一种检测细胞自噬增强的化合物及其制法和用途的制作方法

本发明涉及生物检测领域，是一种通过实时检测细胞器酸化检测自噬增强的材料。

背景技术

自噬是一种细胞内降解过程，细胞通过该过程控制细胞稳态和存活[参见：kroemer,g.；marino,g.；levine,b.molecularcell2010,40,280.]。在衰老和各种神经退行性疾病模型如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩侧索硬化症中自噬增强是有益的[参见：tan,c.c.；yu,j.t.；tan,m.s.；jiang,t.；zhu,x.c.；tan,l.neurobiologyofaging2014,35,941；wolfe,d.m.；lee,j.h.；kumar,a.；lee,s.；orenstein,s.j.；nixon,r.a.theeuropeanjournalofneuroscience2013,37,1949；menzies,f.m.；fleming,a.；rubinsztein,d.c.naturereviews.neuroscience2015,16,345.]。在所述疾病中,细胞自噬的增强可以增强由疾病引起的聚集物的清除,从而有助于治疗和减轻疾病的严重程度。对于癌症的治疗，自噬的增强起着双刃剑但非常重要的作用：激活自噬以响应放疗或化疗而保护癌细胞，并且已被证明可促进肿瘤细胞存活和产生抗药性；另一方面，当癌细胞在过度自噬引发自噬性细胞死亡时，自噬作为肿瘤抑制机制起作用[参见：chen,n.；debnath,j.febsletters2010,584,1427]。有大量的证据证明自噬增强是治疗大范围疾病和紊乱的有效方法，因此开发基于自噬增强的药物有广阔的市场前景，这也对开发和优化自噬增强的检测方法提出了需求。

在自噬增强的检测方法中，广泛采用的是使用自噬标记物gfp-lc3标记自噬体,它是一种gfp荧光蛋白和lc3标记物的融合物。gfp-lc3作为自噬体荧光标记物,在标记自噬体方面是非常有效的，但由于其使用步骤繁琐和成本昂贵等问题，大大限制了在药物高通量筛选等方面的应用。对新药开发而言,其根本途径是提高效率,降低成本,在更短的时间上市场。因此,开发一种快速有效的自噬增强检测探针对于提高药物筛选效率——尤其是药物初筛——是非常必要的。

细胞器的酸化与自噬过程密切相关[参见：wijdeven,r.h.；janssen,h.；nahidiazar,l.；janssen,l.；jalink,k.；berlin,i.；neefjes,j.naturecommunications2016,7,11808.mehrpour,m.；esclatine,a.；beau,i.；codogno,p.cellresearch2010,20,748.lamb,c.a.；yoshimori,t.；tooze,s.a.naturereviews.molecularcellbiology2013,14,759.eskelinen,e.-l.；reggiori,f.；baba,m.；kovács,a.l.；seglen,p.o.autophagy2011,7,935.]，例如，自噬体与内吞途径融合(早期核内体、晚期核内体和多泡体(mvbs))，并且由这些融合过程产生的融合体比自噬体酸性增强；同时，内吞途径中的晚期核内体比早期核内体酸性增强[参见：mellman,i.annualreviewofcellanddevelopmentalbiology1996,12,575]。酸化细胞器数量的急剧增加间接反映了自噬的增强。因此，实时成像酸性细胞器的形成对于进一步理解与衰老神经退行性疾病，癌症治疗中的药物抗性和肿瘤抑制密切相关的自噬的增强具有重要意义和重要性。已有报道用于长寿命酸性细胞器的许多分子探针如溶酶体，但未见用于新酸化的细胞器。新酸化细胞器的鉴定和表征主要依靠电子显微镜和荧光显微镜，然而，电子显微镜需要化学固定的死细胞，在固定细胞的过程中可能因污染而得出错误的结论。晚期核内体的活细胞成像可以通过转染核内体特异性蛋白质基因来实现，然而，这些方法需要很长时间和复杂的操作步骤，而效率低下。纳米探针，尤其是超灵敏的ph纳米探针，在研究晚期核内体在胞吞作用和细胞内运输纳米颗粒中的机制理解方面发挥着重要作用，但是细胞内无效递送的问题阻碍了它们在自噬途径中用于标记晚期核内体和其他酸化的细胞器[参见：liu,m.；li,q.；liang,l.；li,j.；wang,k.；li,j.；lv,m.；chen,n.；song,h.；lee,j.；shi,j.；wang,l.；lal,r.；fan,c.naturecommunications2017,8,15646.richardson,d.s.；gregor,c.；winter,f.r.；urban,n.t.；sahl,s.j.；willig,k.i.；hell,s.w.naturecommunications2017,8,577.wang,c.；zhao,t.；li,y.；huang,g.；white,m.a.；gao,j.advanceddrugdeliveryreviews2017,113,87.zhou,k.；wang,y.；huang,x.；luby-phelps,k.；sumer,b.d.；gao,j.angewandtechemie-internationaledition2011,50,6109.]。分子探针是一种更有前途的替代品，因为它们通常具有生物相容性并且通常具有膜渗透性。用于酸性细胞器的合适探针通常由荧光团和亲脂弱碱性基团组成，使得探针呈嗜酸性并在质子化后在酸性囊泡中积累[参见：xu,w.；zeng,z.b.；jiang,j.h.；chang,y.t.；yuan,l.angewandtechemie-internationaledition2016,55,13658.]。然而，这个技巧并不适用于新酸化的细胞器。当细胞与分子探针一起孵育时，长寿命的溶酶体被标记，新生成的酸性细胞器却未被标记，因为一旦在溶酶体中质子化，净正电荷探针不能轻易穿过细胞器膜返回到胞质溶胶中，探针即在溶酶体中富集。因此，溶酶体外的探针浓度通常比溶酶体内的探针浓度低1至2个数量级，在新酸化的细胞器产生时来不及对其进行染色。有专利报道金属络合物用作自噬溶酶体的标记，但是金属络合物本身膜通透性较差，通过内吞途径进入细胞后被核内体截留无法释放到细胞内，因此只能被运送到自噬溶酶体中最终被降解，且对ph变化无响应，因此也无法通过检测新酸化的细胞器快速指示自噬作用的增强[参见：cn104152529a]。成功检测新酸化细胞器的关键是将分子探针以一种看不见的、非荧光的“睡眠状态”进入细胞，并使它们在细胞质和细胞器中均匀分布，从而当产生酸性细胞器时可以“醒来”，即，转变成另一种可见的荧光形式。

技术实现要素：

本发明内容是设计并提供了一种通过实时检测细胞器酸化检测自噬增强的材料其制备方法和用途。

在本发明中，我们巧妙的设计了一类含氟硼的非共轭体系化合物，它们都是中性的小分子探针因此可以均匀的分布在细胞中，且在细胞质、中性至碱性细胞器内几乎没有任何的荧光。然而在细胞器酸化的条件下能够发射强烈的荧光。当用细胞自噬增强药物(雷帕霉素)刺激细胞时，观察到酸性细胞器剧烈增多，间接的指示了细胞自噬的增强。探针不仅显示出良好的细胞渗透性，几乎没有任何细胞毒性，而且几乎没有背景荧光，无需任何洗涤步骤。

技术实现要素：

一种检测细胞自噬增强的化合物,它有如下结构：

snx(x代表化合物编号)

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6，各自独立的选自h、卤素、硝基、(c1-c6)烷基、(c3-c6)环烷基、(c6-c10)芳基、(c3-c10)杂芳基、(c3-c6)烯基、ch3coo-、ccl3coo-、cf3coo-、clo4-、bf4-、bph4-、-cn、-n3或-och3。

上述的检测细胞自噬增强的化合物，所述的r1基团优选的为h或ch3。

上述的检测细胞自噬增强的化合物，所述的r2基团优选的为h、no2或n(ch3)2。

上述的检测细胞自噬增强的化合物，所述的r3基团优选的为ocnh2n+1，其中n＝1-8。

上述的检测细胞自噬增强的化合物，所述的r4基团优选的为cn或cooc2h5。

上述的检测细胞自噬增强的化合物，所述的r5基团优选的为cooc2h5。

上述的检测细胞自噬增强的化合物，所述的r6基团优选的为h或ch3。

一种制备上述化合物的方法，它如下式所示：

一种制备上述的检测细胞自噬增强的化合物的方法,它包括下列步骤:

在反应容器中加入含取代基(r1、r2)的苯甲醛和含取代基(r4-r6)的吡咯，取代苯甲醛和取代吡咯的物质的量之比为1:2，将其溶解于无水二氯甲烷中，加入催化剂三氟乙酸(tfa)，催化剂用量为取代苯甲醛物质的量的1-5倍，在隔绝空气避光的条件下搅拌，回流4-7天，点板检测直到取代吡咯完全耗尽，然后将与取代苯甲醛等摩尔的2，3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq)加入反应溶液中，室温下搅拌30分钟，之后加入过量的三乙胺(tea)和三氟化硼-乙醚溶液(bf3·et2o)，继续搅拌回流反应1小时，用水淬灭反应，反应混合物用蒸馏水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，随后用旋转蒸发仪浓缩，用100-200目硅胶柱层析分离并搜集最大吸收波长在600-700纳米的组分，洗脱剂为二氯甲烷，蒸干溶剂后，加入甲醇和碳酸钾，室温搅拌5分钟，过滤除去碳酸钾，旋蒸干溶剂得到目标化合物。

一种利用上述的检测细胞自噬增强的化合物通过实时检测细胞器酸化检测自噬增强的方法，该方法包含如下步骤：

第一步：获得实验所需细胞；

第二步：将检测细胞自噬增强的化合物与细胞共孵育。

第三步：通过检测细胞自噬增强的化合物发射荧光确定细胞器的酸化。

第四步：通过细胞器的酸化指示自噬的增强。

上述的检测细胞自噬增强的化合物在药物筛选、细胞实验、组织实验、荧光实验、高通量筛选、制备检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明的有益效果

本发明与现有技术相比,其显著优点是：首次发明了一种能够实时检测新酸化细胞器的含氟硼二吡咯的非共轭材料，此材料本身不具有荧光，却能在细胞器酸化时立刻发射强烈的荧光，通过检测新酸化的细胞器检测自噬的增强。首次采用检测细胞器酸化的方法检测细胞自噬增强，提出了全新的检测思路和方法。相比于经典的gfp-lc3标记自噬体的方法，本发明方法操作更简单、快速，更利于高通量筛选。除了以上优点外，探针具有优异的细胞渗透性，可忽略的毒性，在荧光成像过程中无背景荧光干扰，无需任何洗涤步骤，这是快速检测和高通量筛选的突出优点。

附图说明

图1为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn1的¹hnmr谱图；

图2为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn1的¹³cnmr谱图；

图3为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn1的ph滴定紫外吸收和荧光光谱图；

图4为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn1的检测新酸化细胞器实验图，其中1a、2a、3a、4a代表加入自噬激动剂之前(即0分钟时)选定的区域的放大图，1b、2b、3b、4b代表加入自噬激动剂10分钟后选定区域的放大图，图中的箭头指出了加入自噬激动剂10分钟后比10分钟前新增加的酸性细胞器，图4清晰的说明了本发明材料能够实时检测自噬增强过程中伴随的细胞器酸化；

图5为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn2的¹hnmr谱图；

图6为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn2的¹³cnmr谱图；

图7为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn3的¹hnmr谱图；

图8为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn3的¹³cnmr谱图；

图9为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn4的¹hnmr谱图；

图10为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn4的¹³cnmr谱图；

图11为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn5的¹hnmr谱图；

图12为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn5的¹³cnmr谱图；

图13为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn6的¹hnmr谱图；

图14为本发明的检测细胞自噬增强的化合物sn6的¹³cnmr谱图。

具体实施方式

检测所用仪器为：brukerarx500型核磁共振仪(tms为内标,cd2cl2和cd3od为溶剂),岛津uv-4500型紫外-可见分光光度计(扫描范围300-900纳米,狭缝宽度2.0纳米),日立f4600荧光扫描仪、美国brukerdaltonicsautoflexii质谱工作站。

实施例1：化合物sn1的合成

在反应容器中加入(r1＝r2＝h)苯甲醛(0.106g,1mmol)和2-氰基-2-(乙氧羰基乙烯基)-1-h-吡咯(0.380g,2mmol),溶解于50ml无水二氯甲烷中。用注射器抽取三氟乙酸(tfa)催化剂0.5ml注入体系，无水避光条件下放入磁力搅拌子搅拌，回流7天后用薄层色谱板监测直到所述的2-氰基-2-(乙氧羰基乙烯基)-1-h-吡咯完全耗尽。然后将2，3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq：0.227g，1mmol)加入反应溶液中，室温下搅拌30分钟，之后加入三乙胺(tea)3ml搅拌均匀后，分三次加入三氟化硼-乙醚溶液(bf3·et2o)6ml(质量百分比48％)，继续搅拌回流反应1小时，得到蓝色带有红色荧光的溶液，点板监测至未配位的产物耗尽，用水淬灭反应，反应混合物用蒸馏水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，随后用旋转蒸发仪浓缩，用100-200目硅胶柱层析分离并搜集最大吸收波长630纳米的组分，洗脱剂为二氯甲烷，蒸干溶剂后，加入甲醇、碳酸钾，室温搅拌5分钟，过滤除去碳酸钾，旋蒸干溶剂得到含有2-氰基丙烯酸乙酯基团的异氟硼二吡咯化合物(r1＝h；r2＝h；r3＝och3；r4＝cn；r5＝cooch2ch3；r6＝h)。产物为淡黄色粉末，298mg，产率58％。malditofms:calculatedfor[c28h25bf2n4o5+h]⁺m/z547.18,found547.50.¹hnmr(见图1)(600mhz,meod)δ＝8.83(s,2h),7.77(d,j＝4.2,2h),7.38–7.33(m,2h),7.28–7.22(m,2h),7.21–7.17(m,1h),6.18(d,j＝4.1,2h),3.68(ddd,j＝5.9,4.6,1.0,1h),3.65–3.62(m,2h),3.57(ddd,j＝17.3,8.9,4.4,2h),3.33(dt,j＝3.3,1.6,4h),1.19(dd,j＝8.4,5.7,4h).¹³cnmr(见图2)(151mhz,meod)δ＝165.92,145.85,145.26,128.69,127.72,126.82,125.17,121.34,118.42,112.04,87.96,76.80,72.38,63.16,57.15,53.47,53.29,53.11,52.92,52.74,48.43,48.29,48.14,48.00,47.86,47.72,47.58,17.23.。

实施例2：sn1的ph滴定实验

化合物sn1在甲醇中呈现无色至淡黄色的溶液，其紫外吸收光谱见图3，在374纳米和413纳米处有两个吸收峰。将tfa加入到iso-bodipy的甲醇溶液中进行ph滴定，在ph值从7.0到2.12的滴定过程中观察到从浅黄色到红色的明显颜色变化，并且伴随着强烈的红色荧光的产生。在ph值为6.0以下，开始观察到荧光的产生，当ph值从7.0变为4.1时，荧光发射强度(λem＝635nm)增加了17倍以上。图3中的插图显示了ph滴定过程中618nm处的吸收变化。通过使用henderson-hasselbach方程获得pka值为4.71。紫外吸收光谱和荧光光谱的变化表明iso-bodipy适用于ph荧光探针，可能拥有潜在的酸性细胞器荧光标记功能。

实施例3：sn1的溶酶体荧光标记和实时监测应用

kb细胞株由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。kb细胞在掺有10％胎牛血清(fbs)的无血清细胞冻存培养基(rpmi)1640中培养。将其置于二氧化碳培养箱内，37℃培养箱4小时。细胞无须清洗直接扫描成像。通过3d活细胞成像技术对合成的iso-bodipy与标记溶酶体荧光探针做了进一步研究。将hela细胞加载1(15μm)30分钟，并进行共聚焦显微镜观察，然后在显微镜下加入雷帕霉素(20μm)。对于每个场，记录一系列10-20个连续焦平面图像，连续焦平面相距0.8μm，针对每一个焦平面的垂直投影作图。在选定的时间点记录荧光图像，计算像素点增加的百分比。图像比例尺10μm(图4)。

实施例4：化合物sn2的合成

在反应容器中加入对硝基苯甲醛(0.128g)和2-氰基-2-(乙氧羰基乙烯基)-1-h-吡咯(0.380g),溶解于70ml无水二氯甲烷中。用注射器抽取三氟乙酸(tfa)催化剂0.5ml注入体系，无水避光条件下放入磁力搅拌子搅拌，回流5天后用薄层色谱板监测直到吡咯完全耗尽。然后将2，3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq：0.227g，1mmol)加入反应溶液中，室温下搅拌30分钟，之后加入三乙胺(tea)3ml搅拌均匀后，分三次加入三氟化硼-乙醚溶液(bf3·et2o)6ml(质量百分比48％)，继续搅拌回流反应1小时，得到蓝色带有红色荧光的溶液，点板监测至未配位的产物耗尽，用水淬灭反应，反应混合物用蒸馏水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，随后用旋转蒸发仪浓缩，用100-200目硅胶柱层析分离并搜集具有红色荧光的组分，洗脱剂为二氯甲烷，蒸干溶剂后，加入甲醇、碳酸钾，室温搅拌5分钟，过滤除去碳酸钾，旋蒸干溶剂得到含有2-氰基丙烯酸乙酯基团的异氟硼二吡咯化合物(r1＝h；r2＝no2；r3＝och3；r4＝cn；r5＝cooch2ch3；r6＝h)。产物为淡黄色粉末，产率55％。化合物经过核磁氢谱和碳谱表征(见图5、图6)。

实施例5：化合物sn3的合成

在反应容器中加入对二甲胺基苯甲醛(0.150g)和2-氰基-2-(乙氧羰基乙烯基)-1-h-吡咯(0.380g),溶解于50ml无水二氯甲烷中。用注射器抽取三氟乙酸(tfa)催化剂0.5ml注入体系，无水避光条件下放入磁力搅拌子搅拌，回流7天后用薄层色谱板监测直到吡咯完全耗尽。然后将2，3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq：0.227g，1mmol)加入反应溶液中，室温下搅拌30分钟，之后加入三乙胺(tea)3ml搅拌均匀后，分三次加入三氟化硼-乙醚溶液(bf3·et2o)6ml(质量百分比48％)，继续搅拌回流反应1小时，得到蓝色的溶液，点板监测至未配位的产物耗尽，用水淬灭反应，反应混合物用蒸馏水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，随后用旋转蒸发仪浓缩，用100-200目硅胶柱层析分离并搜集最大吸收波长大于600纳米的组分，洗脱剂为二氯甲烷，蒸干溶剂后，加入甲醇、碳酸钾，室温搅拌5分钟，过滤除去碳酸钾，旋蒸干溶剂得到含有2-氰基丙烯酸乙酯基团的异氟硼二吡咯化合物(r1＝h；r2＝n(ch3)2；r3＝och3；r4＝cn；r5＝cooch2ch3；r6＝h)。产物为淡黄色粉末，产率57％。化合物经过核磁氢谱和碳谱表征(见图7、图8)。

实施例6：化合物sn4的合成

在反应容器中加入2，6-二甲基苯甲醛(0.140g)和2-氰基-2-(乙氧羰基乙烯基)-1-h-吡咯(0.380g),溶解于50ml无水二氯甲烷中。用注射器抽取三氟乙酸(tfa)催化剂0.5ml注入体系，无水避光条件下放入磁力搅拌子搅拌，回流6天后用薄层色谱板监测直到吡咯完全耗尽。然后将2，3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq：0.227g)加入反应溶液中，室温下搅拌30分钟，之后加入三乙胺(tea)3ml搅拌均匀后，分三次加入三氟化硼-乙醚溶液(bf3·et2o)6ml(质量百分比48％)，继续搅拌回流反应1小时，得到具有强烈红色荧光溶液，点板监测至未配位的产物耗尽，用水淬灭反应，反应混合物用蒸馏水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，随后用旋转蒸发仪浓缩，用100-200目硅胶柱层析分离并搜集最大吸收波长大于600纳米的组分，洗脱剂为二氯甲烷，蒸干溶剂后，加入乙醇、碳酸钾，室温搅拌5分钟，过滤除去碳酸钾，旋蒸干溶剂得到含有2-氰基丙烯酸乙酯基团的异氟硼二吡咯化合物(r1＝ch3；r2＝h；r3＝och2ch3；r4＝cn；r5＝cooch2ch3；r6＝h)。产物为淡黄色粉末，产率68％。化合物经过核磁氢谱和碳谱表征(见图9、图10)。

实施例7：化合物sn5的合成

在反应容器中加入苯甲醛(0.106g)和2，2-二-(乙氧羰基乙烯基)-1-h-吡咯(0.410g),溶解于50ml无水二氯甲烷中。用注射器抽取三氟乙酸(tfa)催化剂0.4ml注入体系，无水避光条件下放入磁力搅拌子搅拌，回流4天后用薄层色谱板监测直到吡咯完全耗尽。然后将2，3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq：0.227g)加入反应溶液中，室温下搅拌30分钟，之后加入三乙胺(tea)3ml搅拌均匀后，分三次加入三氟化硼-乙醚溶液(bf3·et2o)6ml(质量百分比48％)，继续搅拌回流反应1小时，得到具有玫瑰红色荧光溶液，点板监测至未配位的产物耗尽，用水淬灭反应，反应混合物用蒸馏水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，随后用旋转蒸发仪浓缩，用100-200目硅胶柱层析分离并搜集最大吸收波长大于600纳米的组分，洗脱剂为二氯甲烷，蒸干溶剂后，加入辛醇、碳酸钾，室温搅拌5分钟，过滤除去碳酸钾，旋蒸干溶剂得到含有2-氰基丙烯酸乙酯基团的异氟硼二吡咯化合物。(r1＝h；r2＝h；r3＝och2ch2ch2ch2ch2ch2ch2ch3；r4＝cooch2ch3；r5＝cooch2ch3；r6＝h)。产物为淡黄色粉末，产率65％。化合物经过核磁氢谱和碳谱表征(见图11、图12)。

实施例8：化合物sn6的合成

在反应容器中加入2,6-二甲基苯甲醛(0.135g)和2，2-二-(乙氧羰基乙烯基)-1-甲基-吡咯(0.460g),溶解于50ml无水二氯甲烷中。用注射器抽取三氟乙酸(tfa)催化剂0.5ml注入体系，无水避光条件下放入磁力搅拌子搅拌，回流7天后用薄层色谱板监测直到吡咯完全耗尽。然后将2，3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq：0.227g)加入反应溶液中，室温下搅拌30分钟，之后加入三乙胺(tea)3ml搅拌均匀后，分三次加入三氟化硼-乙醚溶液(bf3·et2o)6ml(质量百分比48％)，继续搅拌回流反应1小时，得到具有红色荧光溶液，点板监测至未配位的产物耗尽，用水淬灭反应，反应混合物用蒸馏水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，随后用旋转蒸发仪浓缩，用100-200目硅胶柱层析分离并搜集最大吸收波长大于600纳米的组分，洗脱剂为二氯甲烷，蒸干溶剂后，加入丙醇、碳酸钾，室温搅拌5分钟，过滤除去碳酸钾，旋蒸干溶剂得到含有2-氰基丙烯酸乙酯基团的异氟硼二吡咯化合物(r1＝ch3；r2＝h；r3＝och2ch2ch3；r4＝cooch2ch3；r5＝cooch2ch3；r6＝ch3)。产物为淡黄色粉末，产率51％。

实施例9：化合物sn2的ph滴定实验

化合物sn2在甲醇中呈现无色至淡黄色的溶液，在375纳米和415纳米处有两个吸收峰。将tfa加入到iso-bodipy的甲醇溶液中进行ph滴定，在ph值从7.0到2.12的滴定过程中观察到从浅黄色到红色的明显颜色变化，并且伴随着强烈的红色荧光的产生。在ph值为5.5以下，开始观察到荧光的产生，当ph值从7.0变为2.0时，荧光发射强度(λem＝635nm)增加了20倍以上。通过使用henderson-hasselbach方程获得pka值为2.0。紫外吸收光谱和荧光光谱的变化表明iso-bodipy适用于ph荧光探针，可能拥有潜在的酸性细胞器荧光标记功能。

实施例10：化合物sn4的ph滴定实验

化合物sn2在甲醇中呈现无色至淡黄色的溶液，在375纳米和415纳米处有两个吸收峰。将tfa加入到iso-bodipy的甲醇溶液中进行ph滴定，在ph值从7.0到2.00的滴定过程中观察到从浅黄色到红色的明显颜色变化，并且伴随着强烈的红色荧光的产生。在ph值为7.0以下，开始观察到荧光的产生，当ph值从7.0变为2.0时，荧光发射强度(λem＝630nm)增加了30倍以上。通过使用henderson-hasselbach方程获得pka值为5.5.0。紫外吸收光谱和荧光光谱的变化表明iso-bodipy适用于ph荧光探针，可能拥有潜在的酸性细胞器荧光标记功能。

实施例11：sn2的溶酶体荧光标记和实时监测应用

kb细胞株由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。kb细胞在掺有10％胎牛血清(fbs)的无血清细胞冻存培养基(rpmi)1640中培养。将其置于二氧化碳培养箱内，37℃培养箱4小时。细胞无须清洗直接扫描成像。通过3d活细胞成像技术对合成的iso-bodipy与标记溶酶体荧光探针做了进一步研究。将hela细胞加载1(15μm)30分钟，并进行共聚焦显微镜观察，然后在显微镜下加入雷帕霉素(20μm)。对于每个场，记录一系列10-20个连续焦平面图像，连续焦平面相距0.8μm，针对每一个焦平面的垂直投影作图。在选定的时间点记录荧光图像，计算像素点增加的百分比。观察到酸性细胞器像素点的增多，表明化合物可以检测细胞自噬的增强。

实施例12：sn4的溶酶体荧光标记和实时监测应用

kb细胞株由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。kb细胞在掺有10％胎牛血清(fbs)的无血清细胞冻存培养基(rpmi)1640中培养。将其置于二氧化碳培养箱内，37℃培养箱4小时。细胞无须清洗直接扫描成像。通过3d活细胞成像技术对合成的iso-bodipy与标记溶酶体荧光探针做了进一步研究。将hela细胞加载1(15μm)30分钟，并进行共聚焦显微镜观察，然后在显微镜下加入雷帕霉素(20μm)。对于每个场，记录一系列10-20个连续焦平面图像，连续焦平面相距0.8μm，针对每一个焦平面的垂直投影作图。在选定的时间点记录荧光图像，计算像素点增加的百分比。观察到酸性细胞器像素点的增多，表明化合物可以检测细胞自噬的增强。