胰腺特异性ECM在促进BMSCs增殖、迁移及定向分化为胰岛素分泌细胞中的应用的制作方法

本发明涉及一种促进骨髓间充质干细胞（bmscs）增殖、迁移及定向分化为胰岛素分泌细胞(ipcs)的方法,是一种胰腺特异性ecm在促进bmscs增殖、迁移及定向分化为胰岛素分泌细胞中的应用。

背景技术

糖尿病是一种严重危害人类健康的全球性慢性疾病。胰岛移植是目前有效的治疗手段之一，然而捐献组织来源短缺以及体外培养技术的不成熟，极大限制了该技术的应用开展。近年来，由干细胞向各种类型成体细胞定向诱导分化的技术不断取得突破进展。目前，间充质干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞，向具有胰岛素分泌功能的细胞定向分化正广泛开展。间充质干细胞多次传代后仍具有干细胞的特性，通常不形成畸胎瘤且无伦理问题，经富含胰岛素分泌促进因子的培养基诱导后能够定向分化为ipcs，同时表达insulin1、insulin2、glut2、葡萄糖激酶、胰岛淀粉样多肽、巢蛋白、pdx-1、pax-6等与胰腺发育以及功能相关的基因。

然而，细胞所处的微环境（细胞-细胞、细胞-细胞外基质相互作用）对其黏附、增殖、迁移、分化等生物学行为具有显著影响。分离提取成熟、完整的胰岛进行培养时，预包被一种或多种细胞外基质相关重组蛋白（transdifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsintotheislet-likecells:theroleofextracellularmatrixproteins,arch.immunol.ther.exp.,2015），能够显著提高胰岛存活时间、胰岛素分泌水平、体外增殖效率、以及恢复并保护胰岛完整的外膜结构。骨髓间充质干细胞来源的胰岛素分泌细胞在结构和功能上与胰岛类似，其生物学行为亦受细胞外基质微环境的影响。胰腺脱细胞支架具有良好的生物相容性，经蛋白组学实验表明其能够很好的保留胶原蛋白ⅰ、胶原蛋白ⅳ、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、蛋白糖胺聚糖等等数百种特异性细胞外基质成分，如此多的成分组成是常规实验难以模拟的。因此，制备获取胰腺特异性细胞外基质溶液，通过建立条件培养基，用于促进bmscs粘附、增殖、迁移、以及向胰岛素分泌细胞定向分化，具备常规方法经一种或数种重组蛋白包被或添加无可比拟的优势，可为构建具有长期稳定血糖调控功能的组织工程胰腺提供充足的、状态良好的、来源便捷的种子细胞。

技术实现要素：

本发明基于细胞外基质微环境对细胞生物学行为的影响，提供一种胰腺特异性ecm在促进bmscs增殖、迁移及定向分化为胰岛素分泌细胞中的应用。

本发明的技术解决方案是：

一种胰腺特异性ecm在促进bmscs增殖、迁移及定向分化为胰岛素分泌细胞中的应用。

bmscs培养时，在培养基中加入ecm溶液，促进bmscs增殖、迁移；

在诱导培养基中加入ecm溶液，促进bmscs定向分化为胰岛素分泌细胞。

所述ecm溶液，其制备方法是：将5mg胰腺脱细胞支架粉末以及30mg胃蛋白酶混合在10ml含0.01m盐酸的溶液中，37℃下以120r/min搅拌至溶解，0.22μm滤菌处理，0.1mnaoh调节ph至7.4，dmem/f12培养基稀释至0.2mg/ml。

所述胰腺脱细胞支架粉末，其制备方法是：将胰腺脱细胞支架置于低温真空冷冻干燥24h，液氮环境下碾磨成粉，co60辐照灭菌，剂量为10kgy。

促进bmscs增殖培养基，其组成含有2mg/mlecm溶液；促进bmscs迁移培养基，其组成含有2mg/mlecm溶液。

诱导培养基组成为：一阶段：dmem高糖+0.5mmol/lβ-巯基乙醇+10ng/mlegf+10ng/mlbfgf+2%胎牛血清+2mg/mlecm溶液；二阶段：dmem高糖+2%b27+10mmol/l尼克酰胺+0.5%bsa+10ng/mlegf+10ng/mlbfgf+10ng/ml肠促胰岛素类似物exendin-4+2mg/mlecm溶液；三阶段：dmem高糖+10ng/mlegf+10ng/mlβ细胞素+2%b27+0.5%bsa+10ng/ml激活素a+2mg/mlecm溶液。

本发明基于细胞外基质微环境对细胞生物学行为的影响，提供了一种胰腺特异性ecm在促进bmscs增殖、迁移及定向分化为胰岛素分泌细胞中的应用，为构建具有长期稳定血糖调控功能的组织工程胰腺提供理想的、充足的、功能稳定的种子细胞。主要将胰腺特异性细胞外基质溶液添加到培养基中，建立适宜的条件培养基，体外构建细胞与细胞外基质的相互作用，促进其生物学行为的发挥。具体生物学行为包括，干性维持、增殖能力提高、迁移能力加强、定向分化效率及稳定性增强。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是大鼠胰腺脱细胞支架大体形态图。

图2是胰腺特异性ecm溶液制备模式图。

图3是胰腺特异性ecm促进bmscs增殖示意图。

图4是胰腺特异性ecm促进bmscs迁移示意图。

图5是胰腺特异性ecm促进bmscs定向诱导分化为ipcs最终细胞形态图。

图6是胰岛相关基因insulin1、insulin2、somatostatin、glucagon、pdx-1表达情况(somatostatin：生长抑素、glucagon：胰高血糖素、pdx-1：胰十二指肠同源盒1)示意图。

图7是akt、erk及其磷酸化蛋白表达情况示意图。

注：所有分组withoutecm：不含ecm组；withecm：含有ecm组；control：对照组。

具体实施方式

为更好的阐述本发明的目的、技术方案和优势，通过以下实施例对本发明作进一步阐述。

实施例：sd大鼠胰腺特异性细胞外基质促进bmscs增殖、迁移及定向分化为ipcs

1）sd大鼠胰腺脱细胞ecm溶液的制备

sd大鼠250-300g禁食1d，10%水合氯醛以0.5ml/100g腹腔注射，碘伏和75%酒精消毒腹部皮肤，t字形切口打开腹腔；将小肠、大肠、网膜以及胃移向右侧，暴露出腹主动脉以及胰腺组织，脾动脉置入22g留置针，缓慢将胰腺与周围胃、肠等组织分离，取出完整胰腺组织后将留置针接入蠕动泵；依次灌注ddh2o0.5h、1%tritonx-100/0.1%氨水4h、pbs2.5h，流速2.5ml/min。新鲜制备的胰腺脱细胞支架置于低温真空冷冻干燥24h，液氮环境下碾磨成粉，co60辐照灭菌，剂量为10kgy（附图1）。

称取5mg粉末以及30mg胃蛋白酶混合在10ml含0.01m盐酸的溶液中，37℃下以120r/min搅拌至溶解，0.22μm滤菌处理，0.1mnaoh调节ph至7.4，dmem/f12培养基稀释至0.2mg/ml备用（附图2）。

2）sd大鼠骨髓间充质干细胞分离培养

4周龄sd大鼠，10%水合氯醛0.5ml/100g腹腔注射，75%酒精浸泡约10min，在超净台取股骨与胫骨置于培养皿，含双抗pbs冲洗3遍，剪去两头，5ml注射器抽取培养基（dmem/f12+10%fbs+4mmol/l谷氨酰胺+100u/ml青霉素+100g/ml链霉素）从两端分多次缓慢冲洗至长骨发白后收集冲洗液，1000rpm离心5min。弃上清，加入培养基重悬，按照细胞密度4000/cm²接种于75cm²培养瓶。置入细胞培养箱24h后首次全量换液，以后每隔3d半量换液，待细胞融合80%左右首次传代。

3）ecm对细胞增殖及迁移促进

p3bmscs种植于96孔板，每孔100μl细胞悬液，分组：无ecm组、ecm组、空白对照组。培养结束后加入10μl阿尔玛蓝细胞增殖试剂，避光继续培养12-24h，在570nm测定吸光度（附图3）。

p3bmscs以5×10⁴/孔置于24孔板中，上室加入200μl细胞培养基，下室分组：500μl培养基组、400μl培养基+100μlecm溶液组。36h后取出24孔板，倒净上室培养基，下室pbs冲洗，异丙醇固定30min，用棉签小心擦拭上室细胞，结晶紫染色30min，随机选取5个视野进行迁移细胞计数（附图4）。

4）骨髓间充质干细胞定向诱导分化为胰岛素分泌细胞

p3-p6bmscs三步法诱导分化（附图5）

a.bmscs消化重悬种植于培养瓶中，加入一阶段诱导培养基（dmem高糖+0.5mmol/lβ-巯基乙醇+10ng/mlegf+10ng/mlbfgf+2%胎牛血清）培养4d，每隔2d换液。

b.将一阶段诱导的细胞消化重悬种植于低吸附6孔板，细胞密度为2×105/ml，加入二阶段诱导培养基（dmem高糖+2%b27+10mmol/l尼克酰胺+0.5%bsa+10ng/mlegf+10ng/mlbfgf+10ng/ml肠促胰岛素类似物exendin-4）悬浮培养4d，每隔2d换液。

c.三阶段诱导培养基（dmem高糖+10ng/mlegf+10ng/mlβ细胞数+2%b27+0.5%bsa+10ng/ml激活素a）悬浮培养4d，每隔2d换液，进行葡萄糖刺激实验。

ecm组：每阶段培养基加入2mg/mlecm溶液。

5）rt-pcr检测胰岛相关基因表达

取三阶段细胞，按照试剂盒说明提取总rna，逆转录42℃60min，72℃5min。rt-pcr反应条件：94℃5min预变性，94℃30s40个循环，退火60℃30s，72℃延伸15s（附图6）。

6）蛋白提取及表达检测

取三阶段细胞离心弃上清，用pbs反复洗两遍，加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂反复吹打，12000r离心30min，收集上清液。nanodrop2000c测定蛋白浓度，100℃煮15min。配置10%分离胶及5%浓缩胶，80v-40min/100v-1.5h跑胶，切取目标蛋白300ma恒流转膜2h，封闭，一抗孵育4℃过夜，1×tbst洗膜3次，每次10min，二抗室温孵育2h，1×tbst洗膜3次，每次10min，发光液a、b液等比例混合后滴于膜上，成像摄片（附图7）。