一株具有一甲胺降解能力的微小杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，更具体地，具有涉及一株具有一甲胺降解能力的微小杆菌及其应用。
背景技术：
近年来，我国各地日渐增多的灰霾天气引起了社会各界的广泛关注。灰霾天气不仅影响交通安全，而且会诱发多种疾病，给人体健康带来巨大威胁。颗粒物是灰霾的主要元凶，粒径小于2.5μm的颗粒物能被吸入人的支气管和肺泡中并沉积下来，引起或加重呼吸系统的疾病。颗粒物可分为一次和二次颗粒物。其中二次颗粒物是由大气中某些污染气体组分之间，或大气中的o2与这些组分之间通过光化学氧化反应转化生成的。有机胺作为大气中最重要的碱性含氮有机化合物，其对二次有机颗粒物形成的影响使其在近几年受到了越来越多的重视。其中，一甲胺(monomethylamine，ch3nh2)是分子结构最为简单的脂肪族胺，又称氨基甲烷，是一种重要的化工原料之一，常使用在药物，有机氮农药，染料，炸药和表面活性剂等生产中。而在生产和使用的过程中，一甲胺也常常会被释放到环境中，因此对大气中二次有机颗粒物的形成可能具有一定的贡献。除此之外，一甲胺属于嗅阈值非常低的有机含氮恶臭化合物，由于其具有嗅阈值低，沸点低，蒸气压高，难生化降解等特性对人体的生理及心理健康产生不利影响。如危害人体的呼吸系统、循环系统和消化系统，高浓度的一甲胺气体进入人体甚至可以引起急性中毒反应。因此对一甲胺的去除势在必行。现阶段国内外对一甲胺的物理和化学治理方法主要包括有吸附法、氧化法、光催化法等，主要集中在各种化学氧化法。同这些物理和化学方法相比，采用微生物法降解恶臭污染物具有成本低、降解彻底、无二次污染等优点，因此一直受到国内外研究者的关注。虽然目前已有一部分研究者通过接种混合菌种对一甲胺进行降解研究，然而，使用分离培养新的单一菌种对一甲胺进行降解研究的文献报道却非常有限，因此筛选出高效率、低成本的一甲胺降解菌在恶臭有机含氮污染物的净化方面具有非常重要的意义。该微小杆菌是一种革兰氏阳性菌、杆状，在固体培养基表面，菌体可形成黄色、圆形、边缘不整齐，表面光滑的菌落。迄今为止，还没有见到有关使用微小杆菌降解一甲胺的相关报道及专利。技术实现要素：为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，提供一株具有降解含氮恶臭污染物一甲胺能力的微小杆菌。该微小杆菌gdutan4属于微小杆菌属的一个新变种，具有优异的一甲胺降解能力，能降解环境中的一甲胺，且一甲胺降解率高。本发明的另一目的在于提供上述具有一甲胺降解能力的微小杆菌在环境修复中的应用。本发明的目的通过下述技术方案来实现：本发明的第一方面，提供一株具有一甲胺降解能力的微小杆菌，该菌株名称为微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学；保藏编号为cctccno：m2018228，保藏日期为2018年4月23日。本发明的所述具有降解含氮恶臭污染物一甲胺能力的微小杆菌的形态特性如下：(a)采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的微小杆菌的细胞染色为革兰氏阳性，杆状。(b)菌落的形态特性为：在lb固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，黄色，不透明，表面平滑，菌落直径为1～2mm。本发明的所述具有一甲胺降解能力的微小杆菌的主要的生理生化特征如下表1所示：表1微小杆菌的主要的生理生化特征本发明的所述具有一甲胺降解能力的微小杆菌的16srdna序列如seqidno：1所示。通过16srdna序列比对分析，发现本发明的菌株与exiguobacteriumsp.nh-q34的同源性达到64％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4属于微小杆菌属的一个新变种，命名为微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4。本发明的第二个方面，提供所述的具有一甲胺降解能力的微小杆菌在环境修复中的应用。本发明的具有一甲胺降解能力的微小杆菌在环境修复的应用中，能够降解环境中的一甲胺。进一步地，所述环境包括大气、水体或者土壤。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1.本发明的菌株是首次从广东省广州市某垃圾填埋场的垃圾渗滤液中筛选得到具有降解一甲胺能力的微小杆菌gdutan4。该微小杆菌gdutan4呈革兰氏阳性，杆状，黄色，不透明，表面平滑，菌落直径为1～2mm。2.本发明的微小杆菌gdutan4具有高效降解一甲胺的能力，在底物浓度为5～130mg/l条件下降解96h，降解率可达93.5％。附图说明图1是本发明的微小杆菌gdutan4在电子显微镜下的形态图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。实施例1一株具有一甲胺降解能力的微小杆菌，该菌株的名称为微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏编号为cctccno：m2018228，保藏日期为2018年4月23日。本实施例的微小杆菌gdutan4分离筛选自广东省广州市某垃圾填埋场渗滤液。其分离纯化方法如下：所用的驯化培养基为无机盐培养基g/l(每1000ml无机盐培养基含k2hpo4·3h2o1.2g，kh2po41.2g，nh4cl0.4g，mgso4·7h2o0.2g，feso4·7h2o0.01g，1ml微量元素液(g/l)：cacl2·2h2o0.2g，mnso4·4h2o0.2g，cuso4·2h2o0.01g，znso4·7h2o0.2g，cocl2·6h2o0.09g，na2moo4·2h2o0.12g，h3bo30.006g)。首先取1ml垃圾渗滤液稀释100倍，接种至营养肉汤中，在摇床温度为37℃、转速150rpm条件下好氧培养1天。取经富集的菌液1ml，接种在含一甲胺的无机盐营养液中，在摇床温度为37℃、转速150rpm条件下好氧培养5天后以10％接种量移入下一浓度驯化，底物驯化梯度分别为：10，20，50，100mg/l。将终浓度驯化液做10-1～10-6的稀释，分别取稀释10-5和10-6倍的稀释液200μl涂布到以一甲胺为唯一碳源的固体琼脂平板(含一甲胺的固体培养基为：每升上述无机盐培养基中加入琼脂18g和一甲胺4mg)上，放入35℃恒温箱中培养3天，挑选不同形态单菌落进行一甲胺降解率的测定，选择降解率最高的菌种进行纯化。降解率的测定：在一甲胺生物降解的过程中定时取样通过分光光度法测定降解率。降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。分光光度法测定一甲胺的浓度：分别取一定量的一甲胺降解液于l0ml比色管中，以吸收液(0.01mhcl)稀释至2.0ml，分别加入缓冲液(80ml蒸馏水内溶解4.08g磷酸二氢钾、1.6g硼砂，再加入5.0mnaoh溶液6.35ml，用水稀释至100ml)4.0ml，重氮盐溶液(10ml对硝基苯胺盐酸溶液中加入亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀)0.4ml，摇匀，放置40min，再加入5mnaoh溶液1.0ml，混匀，放置20min，于波长510nm处比色定量。将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：(1)菌体的形态特性：a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的微小杆菌的细胞染色为革兰氏阳性；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为(1.0～1.5)μm×(1.2～3.2)μm，单鞭毛，如图1所示；b.菌落的形态特性：在lb固体培养基培养24h后，菌落边缘整齐，圆形，黄色，不透明，菌落直径为1～2mm；c.主要的生理生化特征如表2所示：表2微小杆菌的各项生理生化特征上述结果表明本发明所筛选的细菌与微小杆菌属的生理生化特性很相似。(2)提取细菌基因组dna，采用细菌的16srdna通用引物：上游引物：f27(5'-agtttgatcmtggctcag-3')下游引物：r1492(5'-ggttaccttgttacgactt-3')扩增其16srdna全部基因，测序结果如如seqidno：1所示。将seqidno：1中所示的长为1419bp的16srdna基因序列与genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与exiguobacteriumsp.nh-q34的同源性达到64％。综合上述的生理生化特性、16srdna基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属微小杆菌属的一个新变种，命名为微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4。该微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4于2018年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为cctccno：m2018228。实施例2本实施例为微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4在环境修复中的应用，可降解环境中的一甲胺。其中环境包括大气、水体或者土壤。下面对本发明筛选得到的微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4的一甲胺降解能力进行试验验证的方法如下：根据降解实验需要，配置无机盐培养基，往300ml的血清瓶中加入无机盐溶液100ml(每100ml无机盐溶液含：k2hpo4·3h2o0.12g，kh2po40.12g，nh4cl0.04g，mgso4·7h2o0.02g，feso4·7h2o0.001g，cacl2·2h2o0.02g，mnso4·4h2o0.02g，cuso4·2h2o0.001g，znso4·7h2o0.02g，cocl2·6h2o0.009g，na2moo4·2h2o0.012g，h3bo30.0006g，双蒸水100ml)，于121℃高压灭菌30min。首先，将筛选所得的具有一甲胺降解能力的微小杆菌gdutan4在营养肉汤培养基中(牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl5.0g/l)30℃，100rpm的摇床中活化菌体24h，菌液离心，收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，并用10ml无机盐溶液重悬，并向含有不同浓度的一甲胺的100ml无机盐溶液中接种1.0ml菌液，其中一甲胺的浓度分别为5mg/l、10mg/l、40mg/l、70mg/l、100mg/l和130mg/l，其中无机盐的ph值为7，在30℃100rpm的摇床反应96h时，定时取样通过分光光度法测定降解率。降解率的测定同实施例1，结果如表3所示：表3微小杆菌gdutan4对不同初始浓度的一甲胺的降解率一甲胺浓度(mg/l)降解率593.5％1083.3％4064.2％7044.6％10035.1％13028.7％从表3中可以看出，本发明筛选得到的微小杆菌gdutan4在该条件下对一甲胺的降解能力最高可达到93.5％。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>广东工业大学<120>一种具有一甲胺降解能力的微小杆菌及其应用<130>1<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1419<212>dna<213>微小杆菌(exiguobacteriumsp.)gdutan4<400>1cagtcgagcgcaggaagccgtctgaacccttcggggggacgacggtggaatgagcggcgg60acgggtgagtaacacgtaaagaacctgcccataggtctgggataaccacgagaaatcggg120gctaataccggatgtgtcatcggaccgcatggtccgctgatgaaaggcgcttcggcgtcg180cccatggatggctttgcggtgcattagctagttggtggggtaacggcccaccaaggcgac240gatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagact300cctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgc360cgcgtgaacgatgaaggctttcgggtcgtaaagttctgttgtaagggaagaacaagtgcc420gcaggcaatggcggcaccttgacggtaccttgcgagaaagccacggctaactacgtgcca480gcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgc540gcaggcggcctcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggccattgga600aactgggaggcttgagtataggagagaagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcg660tagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctttggcctataactgacgctgag720gcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgat780gagtgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgctgaagctaacgcattaagcactc840cgcctggggagtacggtcgcaaggctgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaag900cggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaactcttgacatcc960ccctgaccggtgcagagatgtaccttccccttcgggggcaggggtgacaggtggtgcatg1020gttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttg1080tccttagttgccagcattaagttgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggagg1140aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgagttgggctacacacgtgctaca1200atggacggtacaaagggcagcgaagccgcgaggtggagccaatcccagaaagccgttctc1260agttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaggt1320cagcatactgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgaga1380gtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaaccgtaaggag1419当前第1页12