促进细胞生长的纳米金核复合物、制备方法及应用与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及促进干细胞以及免疫细胞生长技术领域，具体是指一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物、相关制备方法及应用。

背景技术：

环境的变化以及人口老龄化的加快，导致人类面临各种疾病危险、癌症风险的系数在上升，随着生物技术的发展，尤其是细胞治疗技术的发展，使人们看到了希望，干细胞治疗技术对多个系统的疾病有很好的治疗效果，例如，造血干细胞治疗白血病，骨髓间充质干细胞治疗肝硬化，脂肪干细胞治疗骨关节炎等；免疫细胞治疗技术可以治疗多种癌症，cart、cik、nk细胞治疗肝癌、胃癌、结肠癌等癌症都有很好的效果。美国fda、韩国fda、加拿大fda、欧盟ema、日本厚生劳动省等很多国家都批准了多款干细胞治疗疾病的药物。美国fda还批准了cart用于治疗急性淋巴细胞性白血病(all)。

这些细胞治疗技术的瓶颈在于怎样能获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞。

因此，需要提供一种细胞培养物，其能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其设计巧妙，结构简洁，制备简便，成本低，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法，由其制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法，其设计巧妙，操作简便，成本低，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物在促进干细胞以及免疫细胞生长中的应用，其能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物在促进干细胞以及免疫细胞生长中的应用，其设计巧妙，操作简便，成本低，适于大规模推广应用。

为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物，包括纳米金核和碳酸钙壳层，所述碳酸钙壳层包覆在所述纳米金核外，其特点是，所述纳米金核的直径为95nm～115nm，所述碳酸钙壳层的厚度为5nm～15nm。

较佳地，所述纳米金核包括纳米金星和纳米金球中的至少一种。

在本发明的第二方面，提供一种上述的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法，其特点是，包括以下步骤：

(1)纳米金核种子溶液的制备：将柠檬酸三钠溶液加入煮沸腾的氯金酸(haucl4)溶液中，搅拌反应，然后冷却至室温，即得到所述纳米金核种子溶液；

(2)纳米金核粒子溶液的制备：将所述纳米金核种子溶液加入含盐酸的氯金酸溶液中，搅拌反应，然后加入硝酸银溶液与抗坏血酸溶液形成混合溶液，待所述混合溶液颜色变深蓝色后，加入hs-peg-cooh溶液，室温搅拌反应，即得到所述纳米金核粒子溶液；

(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备：在所述纳米金核粒子溶液中加入氯化钙溶液，室温搅拌反应，离心收集沉淀，即得到所述的氯化钙包覆的纳米金核粒子；

(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备：所述的氯化钙包覆的纳米金核粒子复溶于去离子水中，加入碳酸钠溶液，室温搅拌反应，离心收集沉淀，即得到所述的碳酸钙包覆的纳米金核复合物。

较佳地，在所述步骤(1)中，所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠的质量百分含量为10％，所述氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为1mm，所述柠檬酸三钠与所述氯金酸溶液的体积比为1～1.5：80～100，所述搅拌反应的时间为10分钟～20分钟，所述搅拌反应的转速为300rpm。

较佳地，在所述步骤(2)中，所述的含盐酸的氯金酸溶液中盐酸的摩尔浓度为10m，所述的含盐酸的氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为10mm，所述硝酸银溶液中硝酸银的摩尔浓度为30m，所述抗坏血酸溶液中抗坏血酸的摩尔浓度为10m，所述纳米金核种子溶液、所述的含盐酸的氯金酸溶液、所述硝酸银溶液和所述抗坏血酸溶液的体积比为8～12：100：1：0.5，所述搅拌反应的时间为1分钟，所述搅拌反应的转速为300rpm，所述hs-peg-cooh溶液中hs-peg-cooh的摩尔浓度为10mm，所述hs-peg-cooh的分子量为5000da，所述hs-peg-cooh溶液与所述混合溶液的体积比为10～100：1095～1135，所述室温搅拌反应的时间为12小时，所述室温搅拌反应的温度为28℃，所述室温搅拌反应的转速为200rpm，所述纳米金核粒子溶液中所述纳米金核的直径为95nm～115nm。

较佳地，在所述步骤(2)中，所述纳米金核粒子溶液中所述纳米金核包括纳米金星、纳米金球、纳米金三角、纳米金棒、纳米金双锥中的至少一种。

较佳地，在所述步骤(3)中，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量浓度为10mg/ml，所述氯化钙溶液与所述纳米金核粒子溶液的体积比为5～10：250，所述室温搅拌反应的时间为24小时，所述室温搅拌反应的温度为28℃，所述室温搅拌反应的转速为200rpm。

较佳地，在所述步骤(3)中，所述氯化钙溶液替换为硫酸钙溶液、氢化钙溶液、氧化钙溶液或氢氧化钙溶液。

较佳地，在所述步骤(4)中，所述碳酸钠溶液中碳酸钠的质量浓度为10mg/ml，所述碳酸钠溶液与所述去离子水的体积比为5～10：100，所述室温搅拌反应的时间为24小时，所述室温搅拌反应的温度为28℃，所述室温搅拌反应的转速为200rpm，所述的碳酸钙包覆的纳米金核复合物中所述碳酸钙壳层的厚度为5nm～15nm。

在本发明的第三方面，提供一种促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其特点是，采用上述的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法制备而成。

在本发明的第四方面，提供上述的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物在促进干细胞以及免疫细胞生长中的应用。

本发明的有益效果主要在于：

1、本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物包括纳米金核和碳酸钙壳层，碳酸钙壳层包覆在纳米金核外，纳米金核的直径为95nm～115nm，碳酸钙壳层的厚度为5nm～15nm，其能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞，适于大规模推广应用。

2、本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物包括纳米金核和碳酸钙壳层，碳酸钙壳层包覆在纳米金核外，纳米金核的直径为95nm～115nm，碳酸钙壳层的厚度为5nm～15nm，其设计巧妙，结构简洁，制备简便，成本低，适于大规模推广应用。

3、本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法包括以下步骤：(1)纳米金核种子溶液的制备；(2)纳米金核粒子溶液的制备；(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备；(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备，由其制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞，适于大规模推广应用。

4、本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法包括以下步骤：(1)纳米金核种子溶液的制备；(2)纳米金核粒子溶液的制备；(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备；(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备，其设计巧妙，操作简便，成本低，适于大规模推广应用。

5、本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物在促进干细胞以及免疫细胞生长中的应用，其能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞，适于大规模推广应用。

6、本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物在促进干细胞以及免疫细胞生长中的应用，其设计巧妙，操作简便，成本低，适于大规模推广应用。

本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。

附图说明

图1是本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物一实施例的结构示意图；

图2是本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的一具体实施例的扫描电镜图；

图3是图2所示的具体实施例的吸收光谱示意图；

图4是图2所示的具体实施例对msc细胞的增殖mtt图；

图5是图2所示的具体实施例对nk细胞的增殖mtt图；

图6是对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物对msc细胞的增殖mtt图；

图7是对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物对nk细胞的增殖mtt图；

其中：1纳米金核；2碳酸钙壳层。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

为了促进干细胞、免疫细胞的增殖，本发明提供了一种可缓慢释放钙离子的碳酸钙包覆的纳米金核复合物，如图1所示，包括纳米金核1和碳酸钙壳层2，所述碳酸钙壳层2包覆在所述纳米金核1外，所述纳米金核1的直径为95nm～115nm，所述碳酸钙壳层2的厚度为5nm～15nm。

所述纳米金核1可以具有任何合适的形状，较佳地，所述纳米金核1包括纳米金星和纳米金球中的至少一种。所述纳米金核1还可以是纳米金三角、纳米金棒或纳米金双锥，它们的大小位于直径为95nm～115nm的球形范围内。

本发明还提供了一种上述的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法。

首先是制备纳米金核种子溶液，接着利用还原法得到纳米金核粒子溶液，接着利用hs-peg-cooh与纳米金核1形成au-s键作用进行化学修饰，提高纳米金核1的亲水性，然后利用物理吸附作用，将氯化钙吸附到纳米金核1表面；接着加入碳酸钠溶液，利用碳酸钠与氯化钙的置换反应生成碳酸钙、氯化钠，通过生理盐水漂洗后得到的沉淀即为促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物。

具体地，本发明的上述的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法包括以下步骤：

(1)纳米金核种子溶液的制备：将柠檬酸三钠溶液加入煮沸腾的氯金酸溶液中，搅拌反应，然后冷却至室温，即得到所述纳米金核种子溶液；优选地，所述纳米金核种子溶液采用0.22μm的滤器进行过滤。

(2)纳米金核粒子溶液的制备：将所述纳米金核种子溶液加入含盐酸的氯金酸溶液中，搅拌反应，然后加入硝酸银溶液与抗坏血酸溶液形成混合溶液，待所述混合溶液颜色变深蓝色后，加入hs-peg-cooh溶液，室温搅拌反应，即得到所述纳米金核粒子溶液；

(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备：在所述纳米金核粒子溶液中加入氯化钙溶液，室温搅拌反应，离心收集沉淀，即得到所述的氯化钙包覆的纳米金核粒子；

(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备：所述的氯化钙包覆的纳米金核粒子复溶于去离子水中，加入碳酸钠溶液，室温搅拌反应，离心收集沉淀，即得到所述的碳酸钙包覆的纳米金核复合物。

在所述步骤(1)中，所述柠檬酸三钠溶液和所述氯金酸溶液的浓度、用量，以及反应条件可以根据需要确定，较佳地，所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠的质量百分含量为10％，所述氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为1mm，所述柠檬酸三钠与所述氯金酸溶液的体积比为1～1.5：80～100，所述搅拌反应的时间为10分钟～20分钟，所述搅拌反应的转速为300rpm。

在所述步骤(2)中，所述纳米金核种子溶液、所述的含盐酸的氯金酸溶液、所述硝酸银溶液、所述抗坏血酸溶液和所述hs-peg-cooh溶液的浓度、用量，以及反应条件可以根据需要确定，较佳地，所述的含盐酸的氯金酸溶液中盐酸的摩尔浓度为10m，所述的含盐酸的氯金酸溶液中氯金酸的摩尔浓度为10mm，所述硝酸银溶液中硝酸银的摩尔浓度为30m，所述抗坏血酸溶液中抗坏血酸的摩尔浓度为10m，所述纳米金核种子溶液、所述的含盐酸的氯金酸溶液、所述硝酸银溶液和所述抗坏血酸溶液的体积比为8～12：100：1：0.5，所述搅拌反应的时间为1分钟，所述搅拌反应的转速为300rpm，所述hs-peg-cooh溶液中hs-peg-cooh的摩尔浓度为10mm，所述hs-peg-cooh的分子量为5000da，所述hs-peg-cooh溶液与所述混合溶液的体积比为10～100：1095～1135，所述室温搅拌反应的时间为12小时，所述室温搅拌反应的温度为28℃，所述室温搅拌反应的转速为200rpm，所述纳米金核粒子溶液中所述纳米金核1的直径为95nm～115nm。这里所述纳米金核1的直径的控制是通过加入的还原剂(即抗坏血酸)的量来实现的。

在所述步骤(2)中，所述纳米金核粒子溶液中所述纳米金核1可以具有任何合适的形状，较佳地，所述纳米金核粒子溶液中所述纳米金核1包括纳米金星、纳米金球、纳米金三角、纳米金棒、纳米金双锥中的至少一种。

在所述步骤(3)中，所述纳米金核粒子溶液和所述氯化钙溶液的浓度、用量，以及反应条件可以根据需要确定，较佳地，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量浓度为10mg/ml，所述氯化钙溶液与所述纳米金核粒子溶液的体积比为5～10：250，所述室温搅拌反应的时间为24小时，所述室温搅拌反应的温度为28℃，所述室温搅拌反应的转速为200rpm。

在所述步骤(3)中，所述氯化钙溶液可以替换为其它无机钙化合物溶液，较佳地，所述氯化钙溶液替换为硫酸钙溶液、氢化钙溶液、氧化钙溶液或氢氧化钙溶液。

在所述步骤(4)中，所述碳酸钠溶液的浓度、用量，所述去离子水的用量，以及反应条件可以根据需要确定，较佳地，所述碳酸钠溶液中碳酸钠的质量浓度为10mg/ml，所述碳酸钠溶液与所述去离子水的体积比为5～10：100，所述室温搅拌反应的时间为24小时，所述室温搅拌反应的温度为28℃，所述室温搅拌反应的转速为200rpm，所述的碳酸钙包覆的纳米金核复合物中所述碳酸钙壳层2的厚度为5nm～15nm。这里所述碳酸钙壳层2的厚度是通过加入的碳酸钠的量以及转速来控制的。

本发明还提供采用上述的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备方法制备而成的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物。

本发明还提供上述的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物在促进干细胞以及免疫细胞生长中的应用。

本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物进入干细胞、免疫细胞后，将聚集到溶酶体内，在溶酶体的酸性条件下，复合物中的碳酸钙壳层2遇到h⁺离子会逐渐被降解，生成钙离子、释放二氧化碳等，钙离子会激活细胞的钙离子通道，调节胞内钙离子浓度，促进细胞快速增殖。而且48-72小时后，细胞可通过胞吐作用排出纳米金核1。

优选的，本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的使用浓度范围为10μg/ml～60μg/ml，在该浓度范围内，可以很好的促进细胞的增殖。

优选的，所述干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、多能干细胞中的至少一种，所述免疫细胞包括cik细胞、nk细胞、ctl细胞、til细胞、cart细胞中的至少一种。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

实施例1

(1)纳米金核种子溶液的制备：将1ml10％的柠檬酸三钠溶液加入100ml煮沸腾的1mmhaucl4溶液中，搅拌10min，转速300rpm，冷却至室温后，采用0.22μm的滤器过滤，即得到纳米金核种子溶液。

(2)纳米金核粒子溶液的制备：将8ml纳米金核种子溶液加入含10m盐酸的100ml10mm氯金酸溶液中，搅拌1分钟，转速300rpm，随后加入1000μl30m硝酸银溶液与500μl10m抗坏血酸溶液形成混合溶液，待混合溶液颜色变深蓝色后，加入1mlhs-peg-cooh(分子量为5000da，10mm，购自sigma公司)，搅拌反应12小时，转速200rpm，反应温度为28℃，得到的纳米金核粒子溶液中纳米金核的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为95nm～115nm。

(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备：取25ml纳米金核粒子溶液中加入0.5ml浓度为10mg/ml的氯化钙溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到氯化钙包覆的纳米金星核。

(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备：上述收集的沉淀复溶于10ml去离子水中，加入0.5ml浓度为10mg/ml的碳酸钠溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为5nm～15nm。

获得的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图如图2所示，吸收光谱如图3所示。

实施例2

(1)纳米金核种子溶液的制备：将1.25ml10％的柠檬酸三钠溶液加入90ml煮沸腾的1mmhaucl4溶液中，搅拌15min，转速300rpm，冷却至室温后，采用0.22μm的滤器过滤，即得到纳米金核种子溶液。

(2)纳米金核粒子溶液的制备：将10ml纳米金核种子溶液加入含10m盐酸的100ml10mm氯金酸溶液中，搅拌1分钟，转速300rpm，随后加入1000μl30m硝酸银溶液与500μl10m抗坏血酸溶液形成混合溶液，待混合溶液颜色变深蓝色后，加入5mlhs-peg-cooh(分子量为5000da，10mm，购自sigma公司)，搅拌反应12小时，转速200rpm，反应温度为28℃，得到的纳米金核粒子溶液中纳米金核的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为95nm～115nm；

(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备：取25ml纳米金核粒子溶液中加入1ml浓度为10mg/ml的氯化钙溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到氯化钙包覆的纳米金星核。

(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备：上述收集的沉淀复溶于10ml去离子水中，加入0.75ml浓度为10mg/ml的碳酸钠溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为5nm～15nm。

获得的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱类似实施例1的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱。

实施例3

(1)纳米金核种子溶液的制备：将1.5ml10％的柠檬酸三钠溶液加入80ml煮沸腾的1mmhaucl4溶液中，搅拌20min，转速300rpm，冷却至室温后，采用0.22μm的滤器过滤，即得到纳米金核种子溶液。

(2)纳米金核粒子溶液的制备：将12ml纳米金核种子溶液加入含10m盐酸的100ml10mm氯金酸溶液中，搅拌1分钟，转速300rpm，随后加入1000μl30m硝酸银溶液与500μl10m抗坏血酸溶液形成混合溶液，待混合溶液颜色变深蓝色后，加入10mlhs-peg-cooh(分子量为5000da，10mm，购自sigma公司)，搅拌反应12小时，转速200rpm，反应温度为28℃，得到的纳米金核粒子溶液中纳米金核的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为95nm～115nm。

(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备：取25ml纳米金核粒子溶液中加入1ml浓度为10mg/ml的氯化钙溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到氯化钙包覆的纳米金星核。

(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备：上述收集的沉淀复溶于10ml去离子水中，加入1ml浓度为10mg/ml的碳酸钠溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为5nm～15nm。

获得的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱类似实施例1的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱。对比例1

(1)纳米金核种子溶液的制备：将1.5ml10％的柠檬酸三钠溶液加入80ml煮沸腾的1mmhaucl4溶液中，搅拌20min，转速300rpm，冷却至室温后，采用0.22μm的滤器过滤，即得到纳米金核种子溶液。

(2)纳米金核粒子溶液的制备：将12ml纳米金核种子溶液加入含10m盐酸的100ml10mm氯金酸溶液中，搅拌1分钟，转速300rpm，随后加入1000μl30m硝酸银溶液与800μl10m抗坏血酸溶液形成混合溶液，待混合溶液颜色变深蓝色后，加入10mlhs-peg-cooh(分子量为5000da，10mm，购自sigma公司)，搅拌反应12小时，转速200rpm，反应温度为28℃，得到的纳米金核粒子溶液中纳米金核的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为75nm～90nm。

(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备：取25ml纳米金核粒子溶液中加入1ml浓度为10mg/ml的氯化钙溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到氯化钙包覆的纳米金星核。

(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备：上述收集的沉淀复溶于10ml去离子水中，加入1ml浓度为10mg/ml的碳酸钠溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为5nm～15nm。

获得的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱类似实施例1的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱。对比例2

(1)纳米金核种子溶液的制备：将1.5ml10％的柠檬酸三钠溶液加入80ml煮沸腾的1mmhaucl4溶液中，搅拌20min，转速300rpm，冷却至室温后，采用0.22μm的滤器过滤，即得到纳米金核种子溶液。

(2)纳米金核粒子溶液的制备：将12ml纳米金核种子溶液加入含10m盐酸的100ml10mm氯金酸溶液中，搅拌1分钟，转速300rpm，随后加入1000μl30m硝酸银溶液与500μl10m抗坏血酸溶液形成混合溶液，待混合溶液颜色变深蓝色后，加入10mlhs-peg-cooh(分子量为5000da，10mm，购自sigma公司)，搅拌反应12小时，转速200rpm，反应温度为28℃，得到的纳米金核粒子溶液中纳米金核的直径通过透射电镜拍摄的照片确定为95nm～115nm。

(3)氯化钙包覆的纳米金核粒子的制备：取25ml纳米金核粒子溶液中加入1ml浓度为2mg/ml的氯化钙溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到氯化钙包覆的纳米金星核。

(4)碳酸钙包覆的纳米金核复合物的制备：上述收集的沉淀复溶于10ml去离子水中，加入1ml浓度为2mg/ml的碳酸钠溶液，反应条件为：水浴，反应温度28℃，转速200rpm，反应时间24小时，离心收集沉淀，即得到碳酸钙包覆的纳米金核复合物，其中碳酸钙壳层的厚度通过透射电镜拍摄的照片确定为1nm～4nm。

获得的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱类似实施例1的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的扫描电镜图和吸收光谱。

实施例4与msc细胞的共培养

msc细胞汇合度控制在60-70％，在加入实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物前，先对msc细胞进行换液，换上新鲜的培养液后，将碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，12小时后进行换液，72小时后再次换液或者细胞传代。

对msc细胞的增殖效果检测步骤

1、在96孔板中接种msc细胞悬液(100μl/孔，细胞数量：5000个)，将96孔放在培养箱中培养12小时。

2、对每孔的msc细胞进行换液，换上新鲜培养液(100μl/孔)后，将不同浓度的碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，浓度分别为：0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml，每个浓度3个副孔。

3、12小时后用pbs溶液洗三遍，加入新鲜培养液90μl/孔，加入cck-8溶液10μl/孔(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。

4、2小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、根据吸光度计算细胞的增殖效率，结果见图4。

结果分析：低浓度(5μg/ml)碳酸钙包覆的纳米金核复合物对msc细胞的增殖有一定影响，这是由于细胞摄取复合物后，会影响细胞活性，但是复合物释放出的钙离子的浓度还不足以刺激细胞的增殖，但是随着复合物浓度的增加，对细胞增殖的效果也在递增。但是更高的复合物浓度(60μg/ml以上)对细胞增殖的促进效果不再明显。

采用实施例2制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与msc细胞共培养，取得与采用实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物相似的对msc细胞的增殖效果。

采用实施例3制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与msc细胞共培养，取得与采用实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物相似的对msc细胞的增殖效果。

实施例5与nk细胞的共培养

nk细胞培养密度控制在1-2*10⁶/ml，将实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，12小时后进行离心换液，离心转速为1000rpm，72小时后再次离心换液，离心转速为1000rpm。之后正常补液即可。

对nk细胞的增殖效果检测步骤

1、在96孔板中接种nk细胞悬液(100μl/孔，细胞数量：5000个)，将96孔放在培养箱中培养12小时。

2、对每孔的nk细胞进行换液，换上新鲜培养液(100μl/孔)后，将不同浓度的碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，浓度分别为：0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml，每个浓度3个副孔。

3、12小时后用pbs溶液洗三遍，加入新鲜培养液90μl/孔，加入cck-8溶液10μl/孔(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。

4、2小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、根据吸光度计算细胞的增殖效率，结果见图5。

结果分析：nk细胞对钙离子浓度非常敏感，复合物浓度为5μg/ml时就有了明显的促进增殖的效果，随着浓度的提高(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml)，促进效果越来越显著，但是更高的复合物浓度(60μg/ml以上)对细胞增殖的促进效果不再明显。

采用实施例2制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与nk细胞共培养，取得与采用实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物相似的对nk细胞的增殖效果。

采用实施例3制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与nk细胞共培养，取得与采用实施例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物相似的对nk细胞的增殖效果。

对比例3与msc细胞的共培养

msc细胞汇合度控制在60-70％，在加入对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物前，先对msc细胞进行换液，换上新鲜的培养液后，将碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，12小时后进行换液，72小时后再次换液或者细胞传代。

对msc细胞的增殖效果检测步骤

1、在96孔板中接种msc细胞悬液(100μl/孔，细胞数量：5000个)，将96孔放在培养箱中培养12小时。

2、对每孔的msc细胞进行换液，换上新鲜培养液(100μl/孔)后，将不同浓度的碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，浓度分别为：0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml，每个浓度3个副孔。

3、12小时后用pbs溶液洗三遍，加入新鲜培养液90μl/孔，加入cck-8溶液10μl/孔(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。

4、2小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、根据吸光度计算细胞的增殖效率，结果见图6。

结果分析：低浓度(5μg/ml)碳酸钙包覆的纳米金核复合物对msc细胞的增殖有一定影响，这是由于细胞摄取复合物后，会影响细胞活性，但是复合物释放出的钙离子的浓度还不足以刺激细胞的增殖，但是随着复合物浓度的增加，对细胞增殖的效果也在递增。但是更高的复合物浓度(60μg/ml以上)对细胞增殖的促进效果不再明显。

但是，采用对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述

实施例1、实施例2、实施例3制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与msc细胞共培养，对msc细胞取得的增殖效果明显不如实施例1、实施例2、实施例3制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物，原因可能在于纳米金核偏小。

采用对比例2制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与msc细胞共培养，取得与采用对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物相似的对msc细胞的增殖效果，原因可能在于碳酸钙壳层不够厚。

对比例4与nk细胞的共培养

nk细胞培养密度控制在1-2*10⁶/ml，将对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，12小时后进行离心换液，离心转速为1000rpm，72小时后再次离心换液，离心转速为1000rpm。之后正常补液即可。

对nk细胞的增殖效果检测步骤

1、在96孔板中接种nk细胞悬液(100μl/孔，细胞数量：5000个)，将96孔放在培养箱中培养12小时。

2、对每孔的nk细胞进行换液，换上新鲜培养液(100μl/孔)后，将不同浓度的碳酸钙包覆的纳米金核复合物加入到培养液中，浓度分别为：0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml，每个浓度3个副孔。

3、12小时后用pbs溶液洗三遍，加入新鲜培养液90μl/孔，加入cck-8溶液10μl/孔(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。

4、2小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、根据吸光度计算细胞的增殖效率，结果见图7。

结果分析：nk细胞对钙离子浓度非常敏感，复合物浓度为5μg/ml时就有了明显的促进增殖的效果，随着浓度的提高(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml)，促进效果越来越显著，但是更高的复合物浓度(60μg/ml以上)对细胞增殖的促进效果不再明显。

但是采用对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述实施例1、实施例2、实施例3制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与nk细胞共培养，对nk细胞取得的增殖效果明显不如实施例1、实施例2、实施例3制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物，原因可能在于纳米金核偏小。

采用对比例2制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物代替上述对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物与nk细胞共培养，取得与采用对比例1制备的碳酸钙包覆的纳米金核复合物相似的对nk细胞的增殖效果，原因可能在于碳酸钙壳层不够厚。

因此，本发明通过优选的碳酸钙壳层的厚度(5nm～15nm)、优选的纳米金核的直径(95nm～115nm)以及优选的碳酸钙包覆的纳米金核复合物的使用浓度(10μg/ml～60μg/ml)，可通过胞吞作用进入细胞，在进入细胞到达溶酶体后，在酸性条件下，碳酸钙壳层遇到h⁺离子会逐渐被降解，生成钙离子、释放二氧化碳等，细胞质中游离的钙离子既可以调节胞内的钙离子浓度，还可以通过细胞膜上的钙离子通道，游离到细胞外，促进其他细胞对钙离子的吸收，从而引起细胞群体性的快速增殖，并提高细胞活性。48小时～72小时后，细胞通过胞吐作用排出纳米金核。

本发明的碳酸钙包覆的纳米金核复合物首次使用纳米材料携带碳酸钙进入细胞，具有缓慢释放钙离子、调节胞内钙离子浓度、促进细胞增殖等特点，同时还具有优良的生物安全性。

综上，本发明的促进干细胞以及免疫细胞生长的碳酸钙包覆的纳米金核复合物能够促进干细胞以及免疫细胞生长，从而能够获得质量更好、数量更多的干细胞、免疫细胞，设计巧妙，结构简洁，制备简便，成本低，适于大规模推广应用。

由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。