本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法。
背景技术：
乳酸菌作为一类重要的益生菌，与我们的生活息息相关。众多研究表明，益生乳酸菌具调节肠道菌群平衡、预防和治疗腹泻、缓解肠道炎症、治疗乳糖不耐症、降血脂、降血压、激活机体免疫系统等多种生理功能。随着生物技术的不断发展，市场需求的稳定增加，益生乳酸菌在食品、保健、医药、农业及畜牧业等方面都有广泛的应用。
经过多年的研究，乳酸菌菌粉的制备，主要是通过发酵富集后喷雾干燥或真空冷冻干燥获得乳酸菌菌粉，由于喷雾干燥过程中，温度较高，对菌体损伤较大，获得菌粉的存活率较低，此法已较少用；目前主要是通过真空冷冻干燥获得高品质的乳酸菌菌粉。真空冷冻干燥技术是由wollaston于1813年首次发明，1911年heckly和hammer首次将冻干技术应用于微生物的制备保存，至今已有近百年的研究历史。国内外学者研究表明，相比于其他干燥技术，真空冷冻干燥技术具有保护微生物体内酶活性、降低微生物干燥过程中死亡率、脱水彻底、易于保存等优点。但是随着对冻干技术的进一步研究，发现冻干过程中，温度的变化、冰晶的形成、胞内蛋白结合水的失去等都将影响细胞的活性，例如胞内不规则冰晶的形成会损伤细胞膜、过低的温度导致蛋白质变性、结合水的失去改变蛋白质折叠结构，胞内ph的变化等都将降低乳酸菌菌粉复水后的生物活性和保存期限。
而通过保护剂来改变菌悬液的溶液特性、保护剂与蛋白质分子之间的相互作用、弱化冰晶形成过程中的破坏力，可有效降低冷冻干燥过程对菌体细胞的损害。因此，研究出一种适合乳酸菌真空冷冻干燥的保护剂对获得高品质的乳酸菌冻干菌粉就显得至关重要。同时一种适合的冻干保护剂，可有效提高乳酸菌冻干菌粉的存活率、生物活性，使其易于储存和运输。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法。本发明提供的冻干保护剂冻干效果良好，且能有效提高乳酸菌冻干菌粉的存活率、生物活性。
本发明第一方面提供了一种乳酸菌冻干保护剂，主要包括如下组分：脱脂乳粉，谷氨酸钠，海藻糖，乳糖，菊粉，甜菜碱，虫草多糖。
在本发明的一实施方案中，所述的乳酸菌冻干保护剂包括以下重量百分比的成分：脱脂乳粉10～20％，谷氨酸钠2～10％，海藻糖8～16％，乳糖2～6％，菊粉2～10％，甜菜碱1～5％，虫草多糖1～5％。
优选地，所述的乳酸菌冻干保护剂，包括如下组分：脱脂乳粉10％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％，菊粉6％，甜菜碱3％，虫草多糖2％。
本发明第二方面提供了一种乳酸菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
按照配比称取各组分配制冻干保护剂
(1)脱脂乳粉配制：将称好的脱脂乳粉充分溶解于的纯化水中，然后在高温湿热灭菌5～15min，然后迅速冷却至室温，置于4℃冰箱预冷备用；
(2)菊粉配制：将称好的菊粉充分溶解于的纯化水中，然后在高温湿热灭菌10～30min，然后迅速冷却至室温，置于4℃冰箱预冷备用；
(3)将已称好的甜菜碱、虫草多糖、谷氨酸钠、海藻糖、乳糖分别溶解于纯化水中，高温湿热灭菌10～30min，然后冷却至室温，置于4℃冰箱预冷备用；
(4)将上述步骤所得的各组分，混合均匀，得冻干保护剂。
在本发明的一实施方案中，所述冻干保护制备方法步骤(1)中，纯化水的温度为50～60℃。
在本发明的一实施方案中，所述冻干保护制备方法步骤(1)中，高温湿热灭菌的温度为115℃，灭菌时间为10min。
在本发明的一实施方案中，所述冻干保护制备方法步骤(2)中，纯化水的温度为50～60℃。
在本发明的一实施方案中，所述冻干保护制备方法步骤(2)中，高温湿热灭菌的温度为115℃，灭菌时间为20min。
在本发明的一实施方案中，所述冻干保护制备方法步骤(3)中，高温湿热灭菌的温度为121℃，灭菌时间为20min。
本发明第三方面提供了如权利要求1所述的乳酸菌冻干保护剂、如权利要求3所述的乳酸菌冻干保护剂的制备方法在制备乳酸菌冻干菌粉中的应用。
在本发明的一实施方案中，所述的乳酸菌冻干菌粉的制备包括以下步骤：将乳酸菌活化、培养，富集得菌泥，按菌泥与冻干保护剂1：1～10的重量比加入冻干保护剂混合均匀，真空冷冻干燥，得乳酸菌冻干菌粉。
优选地，所述菌泥与冻干保护剂的重量比为1：4。
在本发明的一实施方案中，所述的乳酸菌包括乳球菌属菌种、乳杆菌属菌种、链球菌属菌各、片球菌属菌种、双歧杆菌属菌种、明串珠菌属菌种中的一种或多种。
冻干菌粉的冻干保护剂可分为小分子保护剂(如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类)和大分子保护剂(如蛋白质、多肽类和多糖类)。作为小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构含有3个以上氢键,在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用。本发明在常规配方的基础上加了菊粉、甜菜碱以及虫草多糖，并通过实验验证加入菊粉、甜菜碱以及虫草多糖的冻干保护剂具有更好的保护作用。
本发明具有如下实施效果：
一、本发明的乳酸菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌等，本发明的保护剂配方可用于上述但不限于上述乳酸菌冻干菌粉的制备，使用该保护剂后可生产高活菌数、高活性的乳酸菌制剂，操作简单、成本低廉、适用性广，可规模化生产。
二、本发明保护剂可以运用于植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌等乳酸菌冻干菌粉的制备，获得的菌粉活菌数在1011cfu/ml以上，冻干存活率在85％以上。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
本发明提供的乳酸菌冻干保护剂，主要包括以下组分：
按菌泥质量的4倍进行保护剂的配制，其中脱脂乳粉10～20％，菊粉2～10％，甜菜碱1～5％，谷氨酸钠2～10％，海藻糖8～16％，乳糖2～6％，虫草多糖1～5％。
本发明提供的乳酸菌冻干保护剂，其制备方法主要包括以下步骤：
(1)脱脂乳粉配制，将称好的脱脂乳粉充分溶解于适量的50～60℃的纯化水中，然后在115℃下，湿热灭菌10min，然后迅速冷却至室温，置于4℃冰箱预冷备用；
(2)菊粉配制，将称好的菊粉充分溶解于适量的50～60℃的纯化水中，然后在115℃下，湿热灭菌20min，然后迅速冷却至室温，置于4℃冰箱预冷备用；
(3)将已称好的甜菜碱、谷氨酸钠、虫草多糖、海藻糖、乳糖分别溶解于适量纯化水中，于121℃下，湿热灭菌20min，然后冷却至室温，置于4℃冰箱预冷备用；
(4)在离心获得菌泥后，将已预冷完毕的各种保护成分(脱脂乳粉、菊粉、海藻糖、谷氨酸钠、乳糖、虫草多糖)混合均匀，即可作为乳酸菌冻干用保护剂。
本发明的乳酸菌冻干保护剂可用于真空冷冻干燥法制备乳酸菌制备乳酸菌菌粉，具体实施例如下：
实施例1：真空冷冻干燥法制备植物乳杆菌菌粉
(1)高密度培养
将活化后的植物乳杆菌菌种按10％的比例接种于植物乳杆菌的增殖培养基(此培养基是经过优化的植物乳杆菌培养基)，控制温度37℃，ph6.0，监控发酵液od600至其处于稳定，此时发酵活菌数在109～1010之间。
(2)保护剂准备
保护剂a中含有脱脂乳粉10％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
保护剂b中含有含有脱脂乳粉10％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％，菊粉6％，甜菜碱3％，虫草多糖2％；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；菊粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌20min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
保护剂c中含有含有脱脂乳粉10％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％，菊粉6％，甜菜碱3％，；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；菊粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌20min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
保护剂d中含有含有脱脂乳粉20％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％，菊粉6％；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；菊粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌20min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
(3)植物乳杆菌菌泥的获取及保护剂的添加
使用转速为10000rpm/min的管式离心机对发酵液进行离心，获得植物乳杆菌菌泥，获得菌泥后将菌泥均匀分为4份，将保护剂各个成分混合后，按菌泥质量的4倍分别加入混合后的冻干保护剂a、b、c、d，之后在8000rpm下均质10min使菌泥与保护剂充分混匀，制备成冻干菌悬液。
(4)真空冷冻干燥
将混匀后的菌悬液，按3～5mm的厚度铺于冻干盘中，控制预冷温度-35℃，预冻速度0.6℃/min，干燥室压力32pa，升温最高温度30℃，进行真空冷冻干燥，获得菌粉含水量在5％以内。
(5)冻干结果
使用保护剂a进行冻干获得的植物乳杆菌冻干菌粉，活菌数为2.1×1011cfu/g，冻干存活率为70％；
使用保护剂b进行冻干获得的植物乳杆菌冻干菌粉，活菌数为3.1×1011cfu/g，冻干存活率为88％；
使用保护剂c进行冻干获得的植物乳杆菌冻干菌粉，活菌数为2.6×1011cfu/g，冻干存活率为75％；
使用保护剂d进行冻干获得的植物乳杆菌冻干菌粉，活菌数为1.8×1011cfu/g，冻干存活率为65％。
结果表明，保护剂b的冻干保护效果最好，即在原有配方(脱脂乳粉10％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％)的基础上添加菊粉6％，甜菜碱3％，虫草多糖2％，可以提高冻干保护剂对植物乳杆菌的保护效果。
实施例2：真空冷冻干燥法制备鼠李糖乳杆菌菌粉
(1)高密度培养
将活化后的鼠李糖乳杆菌菌种按10％的比例接种于鼠李糖乳杆菌的增殖培养基(此培养基是经过优化的鼠李糖乳杆菌培养基)，控制温度37℃，ph5.7，监控发酵液od600至其处于稳定，此时发酵活菌数在109～1010之间。
(2)保护剂准备
保护剂a中含有脱脂乳粉15％，谷氨酸钠8％，海藻糖14％，乳糖6％；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
保护剂b中含有含有脱脂乳粉10％，菊粉6％，甜菜碱3％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；菊粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌20min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
保护剂c中含有含有脱脂乳粉10％，菊粉6％，甜菜碱3％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；菊粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌20min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
保护剂d中含有含有脱脂乳粉20％，菊粉6％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％；各成分单独溶解及单独灭菌，至使用前再混合，其中脱脂乳粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌8～10min，然后快速冷却；菊粉需用50～60℃纯化水充分溶解后，于115℃下，湿热灭菌20min，然后快速冷却；其余成分均在121℃下，湿热灭菌20min。
(3)鼠李糖乳杆菌菌泥的获取及保护剂的添加
使用转速为10000rpm/min的管式离心机对发酵液进行离心，获得鼠李糖乳杆菌菌泥，获得菌泥后，将保护剂各个成分混合后，将菌泥等分为两份，分别按菌泥质量的4倍加入混合后的冻干保护剂a及冻干保护剂b，之后在8000rpm下均质10min使菌泥与保护剂充分混匀，制备成冻干菌悬液。
(4)真空冷冻干燥
将混匀后的菌悬液，按3～5mm的厚度铺于冻干盘中，控制预冷温度-35℃，预冻速度0.6℃/min，干燥室压力32pa，升温最高温度30℃，进行真空冷冻干燥，获得菌粉含水量在5％以内。
(5)冻干结果
使用保护剂a进行冻干获得的鼠李糖乳杆菌冻干菌粉，活菌数为1.5×1011cfu/g，冻干存活率为70％；
使用保护剂b进行冻干获得的鼠李糖乳杆菌冻干菌粉，活菌数为2.5×1011cfu/g，冻干存活率为86％；
使用保护剂c进行冻干获得的鼠李糖乳杆菌冻干菌粉，活菌数为2.0×1011cfu/g，冻干存活率为77％；
使用保护剂d进行冻干获得的鼠李糖乳杆菌冻干菌粉，活菌数为1.1×1011cfu/g，冻干存活率为64％。
结果表明，保护剂b的冻干保护效果最好，即在现有配方(脱脂乳粉10％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％)的基础上添加菊粉6％，甜菜碱3％，虫草多糖2％，可以提高冻干保护剂对鼠李糖乳杆菌的保护效果。
综上，本发明提供的乳酸菌冻干保护剂可在制备冻干菌粉时提供比现有配方更好的保护效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。