鼠源性抗人CD36单克隆抗体131-G1（G2a）和176-B8（G1）的制作方法

本发明涉及两种单克隆抗体的制备方法，具体涉及鼠源性抗人cd36单克隆抗体的制备方法，属于基因技术领域。

背景技术：

自1989年报道首例cd36抗体引起的血小板输注无效（ptr）患者以来，人们逐渐认识到cd36缺失者（i型）在输血或怀孕过程中有诱导cd36抗体产生的危险，可引起一系列免疫性血小板减少的临床病症，其中包括胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症（fnait）、血小板输注无效（ptr）和输血后紫癜（ptp）以及trali。

cd36是分子量为88kd的跨膜糖蛋白，目前，cd36缺失表达类型主要分为typeⅰ（血小板和单核细胞均缺失表达）和typeⅱ（仅血小板缺失表达）两型。据文献报道，cd36缺失频率在日本人群约为3-11%，撒哈拉以南非洲人和美国黑人血小板cd36抗原的缺失频率约为2.4-7.8%，高加索人cd36缺失者极少，低于0.03%。在我国，本研究组对998名中国无偿献血者的cd36抗原表型进行了分析，发现cd36缺失频率约1.8%，且ⅰ型缺失频率高于0.5%。各种免疫因素，特别是怀孕诱导的免疫刺激，会导致cd36抗原缺失的孕妇产生cd36抗体。近几年研究发现，cd36抗体是我国人群发生胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症（fetal/neonatalalloimmunethrombocytopenia，fnait）的重要因素。然而，目前尚无针对cd36抗原缺失进行检测的相关试剂盒和检测方法。本研究拟利用cd36基因敲除小鼠，通过建立的人cd36转染细胞系进行免疫，制备鼠源性抗人cd36单抗，并通过此单抗建立cd36抗原流式细胞检测技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供两种鼠源性抗人cd36单克隆抗体的制备方法，获得可稳定分泌鼠源性抗人cd36mab的杂交瘤细胞株，该mab可特异性结合人血小板的cd36抗原。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

（1）cd36基因敲除小鼠基因型鉴定：根据thejacksonlaboratory提供的信息，合成cd36基因敲除小鼠鉴定的引物，上游引物为：5’-ttgaagtgctgatcctttcaga-3’，下游引物为5’-tgtttgtttcaccacactgga-3’，下游突变引物为5’-cgccttcttgacgagttc-3’，经94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，获得435bp长度的野生型和/或750bp长度的突变型小鼠cd36基因序列；

（2）人血小板cdna的pcr扩增:根据genbank中编码人cd36的cdna序列(nm_000072.3)设计特异性引物，上游引物为:5’-ggtgcttaacactaattcacctcc-3’，下游引物为:5’-ttttattgttttcgatctgcatgc-3’，经95℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min，获得1452bp长度的人cd36基因序列；

（3）ta克隆及蓝白斑筛选:cd36基因序列经胶纯化后，参照pcdna3.1tm/v5-histopo®taexpressionkit操作说明进行ta克隆，并转化top10e.coli，经蓝白筛选获得阳性质粒，37℃摇菌16h后，提取质粒dna进行测序分析；

（4）细胞转染及g418筛选:获得序列与人cd36参考序列一致的质粒dna后，参照effectene®transfection试剂盒的操作说明转染hek293t细胞，并采用g418进行筛选培养；

（5）流式鉴定:收集人血小板cd36转染的hek293t细胞(2.5×105个细胞)，分别于20μlcd36阳性血清或0.05μgcd36单克隆抗体fa6-152于4℃孵育30min，洗涤2遍后，加入fitc标记的兔抗人igg抗体(按照体积比1：50，用pbs进行稀释)，4℃避光孵育30min，洗涤2遍后上流式机分析；

（6）westernblot鉴定:cd36转染细胞的裂解液经sds-page电泳后，转pvdf膜，与抗v5肽单克隆抗体反应(按照体积比1：2000，用pbs进行稀释)，然后加入hrp标记驴抗鼠igg抗体，ecl曝光显影。具体操作参照《分子克隆实验指南》；

（7）cd36基因敲除小鼠抗原免疫：采用0.5x10⁷个转染人cd36hek293t转染细胞对cd36-/-小鼠进行腹腔免疫，每周一次，免疫三次后，尾静脉注射等量转染细胞加强免疫，三天后检测小鼠尾静脉血清抗体效价，并备细胞融合使用；

（8）细胞融合及抗体制备：摘取抗体效价高的已免疫cd36-/-雌鼠的脾脏，将脾细胞与sp2/0-ag14细胞在peg作用下进行细胞融合，采用hat培养液进行筛选培养；采用流式细胞技术对杂交瘤细胞培养上清进行抗人cd36抗体检测，筛选可分泌igg型抗人cd36抗体的杂交瘤细胞，经两次有限稀释培养，获得分泌单抗的杂交瘤细胞株；

（9）抗人cd36单克隆抗体鉴定：以流式细胞术进行单抗滴度及特异性分析；并运用rapidantibodyisotyping试剂进行单克隆抗体亚型鉴定。

鼠源性抗人cd36单克隆抗体鉴定结果显示：

两种单抗经亲和层析柱分离纯化后，经流式细胞检测发现，其可以特异性结合人血小板cd36抗原（图4）；经快速抗体亚型鉴定，其亚型分别为igg2a和igg1（图5）。

本发明的有益效果是：

本发明利用成功建立的小鼠cd36转染细胞免疫cd36基因敲除小鼠，使其产生cd36抗体，通过细胞融合技术获得鼠源性抗人cd36单抗，该单抗可用于人群中cd36抗原缺失表达的检测。

附图说明

图1人血小板cd36cdna扩增、ta克隆及转染示意图；

图2人cd36转染细胞的流式细胞图，ctrl：cd36转染对照细胞；pos：抗cd36阳性血清；fa6-152：抗cd36单克隆抗体；

图3人血小板cd36转染细胞westernblot鉴定结果，1：cd36转染对照细胞；2：稳定表达cd36的转染细胞；

图4鼠源性抗人cd36单克隆抗体与人血小板反应结果的流式细胞图；图a：1，单克隆抗体131-g1与cd36阴性血小板反应流式图；2，单克隆抗体131-g1与cd36阳性血小板反应流式图；图b：1，单克隆抗体176-b8与cd36阴性血小板反应流式图；2，单克隆抗体176-b8与cd36阳性血小板反应流式图；

图5鼠源性抗人cd36单克隆抗体亚型鉴定结果（131-g1：igg-2a；176-b8：igg-g1；kappa）。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例

（1）cd36基因敲除小鼠基因型鉴定：根据thejacksonlaboratory提供的信息，合成cd36基因敲除小鼠鉴定的引物，上游引物为：5’-ttgaagtgctgatcctttcaga-3’，下游引物为5’-tgtttgtttcaccacactgga-3’，下游突变引物为5’-cgccttcttgacgagttc-3’，经94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，获得435bp长度的野生型和/或750bp长度的突变型小鼠cd36基因序列；

（2）人血小板cdna的pcr扩增:根据genbank中编码人cd36的cdna序列(nm_000072.3)设计特异性引物，上游引物为:5’-ggtgcttaacactaattcacctcc-3’，下游引物为:5’-ttttattgttttcgatctgcatgc-3’，经95℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min，获得1452bp长度的人cd36基因序列；

（3）ta克隆及蓝白斑筛选:cd36基因序列经胶纯化后，参照pcdna3.1tm/v5-histopo®taexpressionkit操作说明进行ta克隆，并转化top10e.coli，经蓝白筛选获得阳性质粒，37℃摇菌16h后，提取质粒dna进行测序分析；

（4）细胞转染及g418筛选:获得序列与人cd36参考序列一致的质粒dna后，参照effectene®transfection试剂盒的操作说明转染hek293t细胞，并采用g418进行筛选培养；

（5）流式鉴定:收集人血小板cd36转染的hek293t细胞(2.5×105个细胞)，分别于20μlcd36阳性血清或0.05μgcd36单克隆抗体fa6-152于4℃孵育30min，洗涤2遍后，加入fitc标记的兔抗人igg抗体(按照体积比1：50，用pbs进行稀释)，4℃避光孵育30min，洗涤2遍后上流式机分析；

（6）westernblot鉴定:cd36转染细胞的裂解液经sds-page电泳后，转pvdf膜，与抗v5肽单克隆抗体反应(按照体积比1：2000，用pbs进行稀释)，然后加入hrp标记驴抗鼠igg抗体，ecl曝光显影，具体操作参照《分子克隆实验指南》；

（7）cd36基因敲除小鼠抗原免疫：采用0.5x10⁷个转染人cd36hek293t转染细胞对cd36-/-小鼠进行腹腔免疫，每周一次，免疫三次后，尾静脉注射等量转染细胞加强免疫，三天后检测小鼠尾静脉血清抗体效价，并备细胞融合使用；

（8）细胞融合及抗体制备：摘取抗体效价高的已免疫cd36-/-雌鼠的脾脏，将脾细胞与sp2/0-ag14细胞在peg作用下进行细胞融合，采用hat培养液进行筛选培养；采用流式细胞技术对杂交瘤细胞培养上清进行抗人cd36抗体检测，筛选可分泌igg型抗人cd36抗体的杂交瘤细胞，经两次有限稀释培养，获得分泌单抗的杂交瘤细胞株；

（9）抗人cd36单克隆抗体鉴定：以流式细胞术进行单抗滴度及特异性分析；并运用rapidantibodyisotyping试剂进行单克隆抗体亚型鉴定。