一种单细胞分选芯片及其制造方法以及单细胞分选方法与流程

本发明属于生物传感器领域，特别涉及一种单细胞分选芯片及其制造方法以及单细胞分选方法。

背景技术：

我国肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首，已成为世界第一肺癌大国。统计显示我国肺癌早期诊断率较低患者5年的生存率仅为10％，70～90％的癌症病人在5年内死于肿瘤的转移和复发。经过长期研究，人们发现循环肿瘤细胞(ctc)在肿瘤转移的过程中发挥着重要的作用。ctc的检测分析可以实现癌症的早期诊断，提高5年内的生存率，并可用于疗效评估和复发转移的监测，同时在预后评价和个体化治疗方面也具有重要的意义。

目前已有多种方法用于ctc的富集和回收。其中，一种方法基于免疫捕获，该方法需要联合多种肿瘤标记物来提高捕获率，减少异质性ctc的损失；另一种方法基于物理分离，该方法无需额外的标记，操作简单，但特异性较差，无法筛除与ctc有相同物理特性的白细胞，具有较高的假阳性。大多数的富集回收方法均是基于整体分析，不具有选择性，导致得到的ctc纯度较差。

而基于单细胞水平的富集方法则能够最大限度地提高ctc的纯度，提高后续研究的准确性，同时也为单细胞分析提供了技术基础。已有的单细胞水平的富集方法，比如显微操作法和激光切割法，存在着操作复杂和仪器昂贵的缺点。目前亟需一种易操作、低成本且选择性高的单细胞富集方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种单细胞分选芯片，以高捕获率、高选择性地实现单细胞分选。

为了实现上述目的，本发明提供了一种单细胞分选芯片，包括自上而下依次贴合的一上层芯片和一玻璃片；所述上层芯片的下表面为上层芯片的结构面，其上刻蚀有一主通道，主通道包含多个相互连通的u型部，每个u型部的两个直段之间均刻蚀有一捕获通道，每个捕获通道均通过一释放通道与一刻蚀于该上层芯片的结构面上的释放微阀相连，所述捕获通道的尺寸设置为使捕获通道的流阻小于所述主通道的流阻。

该捕获通道的与主通道的相交处的尺寸设计为仅能容纳单个细胞。

所述上层芯片上还设有贯通的第一进样口、第二进样口、第一出样口和第二出样口，且所述上层芯片的结构面上还刻蚀有连接所述两个进样口的进样通道，以及连接两个出样口的两个出样通道，且所述进样通道和出样通道分别与主通道的两端相连。

所述上层芯片和玻璃片之间设有一下层芯片，该下层芯片的下表面为下层芯片的结构面，其上刻蚀有4个挤压通道，其分别对应于进样通道或出样通道的下方并与之垂直。

所述每个挤压通道的一端设有贯通该上层芯片和下层芯片且与该挤压通道连通的流控微阀。

所述上层芯片和下层芯片的材质为pdms。

另一方面本发明还提供一种根据权利要求5所述的单细胞分选芯片的制造方法，包括以下步骤：s1：制作上层芯片，包括：s11：根据上层芯片的结构制作出所需要的掩膜；s12：采用s11所述的掩膜，以硅片为衬底，进行光刻和深反应离子刻蚀，刻蚀完成后去除残胶，得到具有微结构的上层硅片模具；s13：将制作好的上层硅片模具进行硅烷化，随后将第一材料浇注到上层硅片模具上并一起加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口和释放微阀处打孔，得到上层中间模具；s14：将第二材料浇注到上层中间模具中，第二材料填充上层中间模具的打孔位置，并固化形成对应进样口、出样口和释放微阀的柱子，剥离固化的第二材料，得到上层最终模具；s15：将第一材料浇注到上层最终模具中，使第一材料的液面没过上层最终模具上的柱子，随后加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口处打孔，保留释放微阀处的薄膜，得到所述上层芯片；s2：制作下层芯片，包括：s21：在硅片上采用光刻工艺，得到下层硅片模具；s22：将第一材料旋涂到下层硅片模具上并一起加热至固化，得到贴合在一起下层硅片模具和下层芯片；s3：制作单细胞分选芯片，包括：s31：将s1中制得的上层芯片的结构面和s2中制得的下层芯片键合在一起，并加热；s32：将上层芯片和下层芯片一起从硅片上剥离下来，并在下层微阀处打孔；s33：将下层芯片(2)的结构面和玻璃片键合在一起，得到单细胞分选芯片。

所述第一材料为pdms，且所述第一材料是通过配置其预聚物和固化剂混合物并在搅拌均匀后抽真空直至气泡消失而得到的。

所述第二材料为环氧胶。

所述步骤s31和所述步骤s33的键合均是利用等离子体处理得到的。

另一方面，本发明还提供一种基于权利要求5所述的单细胞分选芯片的单细胞分选方法，其包括以下步骤：a1：将所述单细胞分选芯片抽真空，然后在上层芯片中通入缓冲液，使上层芯片内完全充满液体；a2：当捕获细胞时，开启第一进样口和第一出样口，关闭第二进样口和第二出样口，并在第一进样口注入经过荧光染色的细胞悬液；a3：当进行细胞回收时，开启第二进样口和第二出样口，关闭第一进样口和第一出样口，并在第二进样口注入缓冲液，同时手动对一个或多个释放微阀进行按压。

所述第一进样口、第一出样口、第二进样口和第二出样口的开启和关闭分别通过利用注射器向与其对应的流控微阀内抽取和注射液体来进行。

所述缓冲液为0.05％的吐温‐20。

一种单细胞分选芯片，包括自上而下依次贴合的一上层芯片和一玻璃片；上层芯片的下表面为上层芯片的结构面，其上刻蚀有一主通道，主通道包含多个u型部，每个u型部的两个直段之间均刻蚀有一捕获通道，每个捕获通道的中央均通过一释放通道与一刻蚀于上层芯片的结构面上的释放微阀相连。

所述捕获通道的流阻小于所述主通道的流阻，且捕获通道的与主通道的相交处的尺寸设计为仅能容纳单个细胞。

所述上层芯片上还设有贯通的第一进样口、第二进样口、第一出样口和第二出样口，且所述上层芯片的结构面上还刻蚀有分别连接所述主通道的一端与两个进样口的两个进样通道，以及分别连接所述主通道的另一端与两个出样口的两个出样通道。

所述上层芯片和玻璃片之间设有一下层芯片，下层芯片的下表面为下层芯片的结构面，其上刻蚀有4个挤压通道，其分别位于进样通道或出样通道的正下方并与之垂直。

所述每个挤压通道的一端设有贯通该上层芯片和下层芯片且与挤压通道连通的流控微阀。

所述上层芯片和下层芯片的材质为pdms。

另一方面，本发明还提供一种根据上文所述的单细胞分选芯片的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：制作上层芯片，包括：s11：根据上层芯片的结构制作出所需要的掩膜；s12：采用s11所述的掩膜，以硅片为衬底，进行光刻和深反应离子刻蚀，刻蚀完成后去除残胶，得到具有微结构的上层硅片模具；s13：将制作好的上层硅片模具进行硅烷化，随后将第一材料浇注到上层硅片模具上并一起加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口和释放微阀处打孔，得到上层中间模具；s14：将第二材料浇注到上层中间模具中，第二材料填充上层中间模具的打孔位置，并固化形成对应进样口、出样口和释放微阀的柱子，剥离固化的第二材料，得到上层最终模具；s15：将第一材料浇注到上层最终模具中，使第一材料的液面没过上层最终模具上的柱子，随后加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口处打孔，保留释放微阀处的薄膜，得到所述上层芯片；s2：制作单细胞分选芯片，包括：s21：在硅片的相应位置上采用光刻工艺，得到下层硅片模具；s22：将第一材料旋涂到下层硅片模具上并一起加热至固化，得到贴合在一起下层硅片模具和下层芯片；s23：将s1中的上层芯片的结构面和s22的下层芯片键合在一起，并加热；s24：将上层芯片和下层芯片一起从硅片上剥离下来，并在下层微阀处打孔；s25：将下层芯片的结构面和玻璃片键合在一起，得到单细胞分选芯片。

所述第一材料为pdms，且所述第一材料是通过配置其预聚物和固化剂混合物并在搅拌均匀后抽真空直至气泡消失而得到的。

所述第二材料为环氧胶。

所述步骤s23和所述步骤s23的键合均是利用等离子体处理得到的。

另一方面，本发明还提供一种基于权利要求5所述的单细胞分选芯片的单细胞分选方法，其包括以下步骤：a1：将所述单细胞分选芯片抽真空，然后在上层芯片中通入缓冲液，使上层芯片内完全充满液体；a2：当捕获细胞时，开启第一进样口和第一出样口，关闭第二进样口和第二出样口，并在第一进样口注入细胞悬液；a3：当进行细胞回收时，开启第二进样口和第二出样口，关闭第一进样口和第一出样口，并在第二进样口注入缓冲液，同时手动对一个或多个释放微阀进行按压。

所述第一进样口、第一出样口、第二进样口和第二出样口的开启和关闭均通过利用注射器向与其对应的流控微阀内抽取和注射液体来进行。

所述缓冲液为0.05％的吐温‐20。

本发明的单细胞分选芯片基于捕获通道的流阻差异分布、尺寸束缚以及释放微阀的设置，能够实现单个细胞的捕获以及通过按压释放微阀实现对目的细胞进行有选择地释放，本发明的单细胞分选通过根据已染色的细胞悬液中的ctc和白细胞的荧光颜色判断捕获的是ctc还是白细胞，然后在进行细胞回收时利用单细胞分选芯片的释放微阀有选择地释放所需细胞和排除被拦住的白细胞，以此来提高纯度，提高了细胞分选的捕获率和选择性，单细胞分选所需采用的芯片成本低廉，且操作简单，仅仅通过按压释放微阀即可回收细胞；其功能单元可以设计多种尺寸来满足不同细胞分选的需求。下层芯片中流控微阀的引入，使得该微阀可以通过注入液体来驱动，水压引起微阀薄膜的形变，从而对上层芯片通道进行封闭和打开并控制液体流向，使得进出样口可以随时进行开启和关闭转换，实现了从不同进样口进入的样本液与缓冲液转换、以及目的细胞(这里指ctc)与其它细胞(这里指白细胞)从不同出样口回收的无缝连接，避免在芯片中引入气泡，方便了实验操作，可以根据需要实时地对单细胞进行分选和回收，有利于后续的细胞研究。此外，本发明的单细胞分选方法采用了0.05％的吐温-20作为缓冲液有效地解决了细胞非特异性吸附的问题。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施例的单细胞分选芯片的结构分解图；

图2是如图1所示单细胞分选芯片的上层芯片的俯视示意图；

图3是图2的局部放大图；

图4是如图1所示单细胞分选芯片的下层芯片的俯视示意图；

图5是本发明单细胞分选芯片内单细胞捕获的显微镜成像图，其示出了不同u型部的单细胞捕获结果；

图6是本发明单细胞分选芯片内单细胞释放的显微镜成像图，其示出了单细胞释放时同一u型部内的细胞随时间的释放情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

如图1所示为根据本发明的一个实施例的单细胞分选芯片，其包括自上而下依次贴合的一上层芯片1、一下层芯片2和一玻璃片3。

上层芯片1的下表面为其结构面，俯视如图1所示的单细胞分选芯片的上层芯片1，可得到如图2所示的上层芯片1的结构面的结构示意图。该上层芯片1的结构面上刻蚀有一主通道11。主通道11包含多个相互连通的u型部111，每个u型部111均由一弯曲段和分别位于该弯曲段两侧且彼此平行的两个直段组成，所述两个直段之间均刻蚀有与直段垂直的捕获通道12，每个捕获通道12的中央均通过一释放通道与一释放微阀13相连，使捕获通道12和释放通道13之间形成三通结构。该释放微阀13刻蚀于上层芯片1的结构面上，进而每个u型部111分别与相连的捕获通道12和释放微阀13组成一个功能单元，且各功能单元通过主通道11相互连通。上层芯片1的材质优选为pdms(聚二甲基硅氧烷)，其结构面与下层芯片2的上表面贴合，下层芯片2的上表面起到密封所述上层芯片1的结构面上的刻蚀结构的作用，从而使得释放微阀13可以通过按压来使位于其中的液体通过捕获通道12流出，并带动细胞从捕获通道12中释放出来。

如图3所示，所述芯片的捕获通道12和主通道11是基于流阻差异性分布来设计的。捕获通道12的尺寸设计为使捕获通道12的流阻小于主通道11的流阻，从而使得细胞优先选择流经捕获通道12。其中，主通道11和捕获通道12的流阻的计算公式为，

其中，l、w、h分别为主通道11或捕获通道12的长、宽、高，μ为流体的粘滞系数。

当细胞被捕获通道12拦截后，捕获通道12的流阻瞬间增大，细胞则会选择主通道11流向下一个功能单元。这种设计避免了细胞在单个功能单元的堵塞。同时，如图3所示，捕获通道12的与主通道11的相交处的尺寸设计为仅能容纳单个细胞，为单细胞水平上的分选提供了保证。

再请参见图2，上层芯片1上还设有第一进样口141、第二进样口142和连接该两进样口的进样通道16；以及第一出样口151和第二出样口152和连接该两出样口的出样通道17，且所述进样通道16和出样通道17分别与主通道11的两端相连.。其中，所述进样口141、142以及出样口151、152均贯通所述上层芯片1，所述进样通道16和出样通道17均刻蚀于上层芯片1的结构面上。

下层芯片2的下表面为下层芯片2的结构面，另一面为与上层芯片1贴合的平坦面。俯视如图1所示的单细胞分选芯片的下层芯片2，可得到如图4所示的下层芯片2的结构面的结构示意图。该下层芯片2的结构面上刻蚀有4个挤压通道21，其分别对应于所述上层芯片1的进样通道16或出样通道17的正下方并与之垂直。此外，每个挤压通道21的一端还设有贯通该上层芯片1和下层芯片2且与挤压通道21连通的流控微阀22。使用时，挤压通道21和流控微阀22内注入有空气或液体，通过挤压流控微阀22使得挤压通道21处的气压或液压引起上层芯片1的形变，该形变用于封闭进样通道16或出样通道17。下层芯片2的材质为pdms，其结构面与下方的玻璃片3贴合，所述玻璃片3起到密封所述下层芯片2的结构面上的刻蚀结构的作用。

本发明还提供了上述单细胞分选芯片的制造方法，其包括以下步骤：

s1：制作上层芯片1，包括：

s11：根据上层芯片1的结构利用cad软件制作出所需要的掩膜；

s12：采用s11所述的掩膜，以硅片为衬底，进行光刻和深反应离子刻蚀，刻蚀完成后用等离子体干法去除残胶，得到具有微结构的上层硅片模具；

所述光刻包括：将光刻胶旋涂在清洗后的硅片上，经过曝光、显影等一系列光刻工艺，将硅片上的光刻胶按照掩膜版的图形进行图案化，其中光刻胶的厚度为3μm；所述深反应离子刻蚀以光刻后的光刻胶图形为掩膜对硅片进行刻蚀，刻蚀深度为20μm。

s13：将制作好的上层硅片模具进行硅烷化(包括熏氟硅烷和真空过夜)，通过配置第一材料的预聚物和固化剂混合物，搅拌均匀后抽真空直至气泡消失，来得到第一材料，随后将第一材料浇注到上层硅片模具上并一起放置在热板上加热至固化，加热温度为65-95℃，剥离固化的第一材料，并在进样口141、142、出样口151、152和释放微阀13处打孔，得到上层中间模具。在本实施例中，所述第一材料为pdms，且pdms的预聚体与固化剂的质量比为10:1。

s14：将第二材料浇注到上层中间模具中，第二材料填充上层中间模具的打孔位置，并固化形成对应进样口141、142、出样口151、152和释放微阀13的柱子，剥离固化的第二材料，得到上层最终模具。在本实施例中，第二材料为环氧胶。

s15：将第一材料浇注到上层最终模具中，使第一材料的液面没过上层最终模具上的柱子，随后放置在热板上加热至固化，加热温度为50-70℃，剥离固化的第一材料，并在进样口141、142、出样口151、152处打孔，保留释放微阀处的薄膜，得到材质为第一材料的所述上层芯片1。

s2：制作下层芯片2，包括：

s21：在硅片上采用光刻工艺，得到具有挤压通道(21)和流控微阀(22)的阳模的下层硅片模具；

s22：通过配置第一材料的预聚物和固化剂混合物，搅拌均匀后抽真空直至气泡消失，来得到第一材料；随后将第一材料以1300～1500rpm旋涂到下层硅片模具上并一起放置在热板上加热至固化，得到贴合在一起下层硅片模具和下层芯片2。其中，下层芯片2的材质为第一材料(即pdms)，但pdms预聚体与固化剂的质量比为20：1，以提高pdms的柔韧性，加热温度为90～105℃。

s3：制作单细胞分选芯片，包括：

s31：利用等离子体处理将s1中制得的上层芯片1的结构面和s2中制得的下层芯片2的平坦面键合在一起，并置于热板上在90～105℃加热5～10min。

s32：将上层芯片1和下层芯片2一起从硅片上剥离下来，并在下层微阀22处打孔。

s33：再次利用等离子体处理，将下层芯片2的结构面和玻璃片3键合在一起，得到单细胞分选芯片。

根据上文所述的单细胞分选芯片，本发明还提供了一种基于该单细胞分选芯片的单细胞分选方法，其包括以下步骤：

a1：将单细胞分选芯片抽真空，然后在上层芯片1中从第二进样口142通入缓冲液，使上层芯片1内完全充满液体。抽真空实现了负压的进样方式，这种负压进样使样本液和缓冲液的注入更加地简便，同时也降低了向芯片内引入气泡的可能。在本实施例中，所述缓冲液为0.05％的吐温-20，用于消除细胞在微流控通道内的非特异性吸附。通常，细胞会通过疏水相互作用与微流控通道壁发生非特异性吸附，被吸附的细胞干扰后续细胞的流动，影响细胞的捕获和释放。而吐温-20是非离子表面活性剂，可以改变界面的亲疏水性，采用0.05％的吐温-20作为进样缓冲液，有效地解决了非特异吸附的问题。

a2：当捕获细胞c时，开启第一进样口141和第一出样口151，关闭第二进样口142和第二出样口152，并在第一进样口141注入经过荧光染色的细胞悬液。由于主通道11和捕获通道12流阻的差异，如图5所示，细胞c优先流经捕获通道，并被捕获在其中，后续的细胞c则会绕过该细胞c，经过主通道11，流向下一个捕获通道12，比捕获通道12个数多的细胞则最终流向第一出样口151。该步骤a2还可以包括：对捕获有白细胞的捕获通道12所对应的释放微阀13进行按压以释放白细胞，从而将其从单细胞分选芯片中除去。

a3：当进行细胞回收时，开启第二进样口142和第二出样口151，关闭第一进样口141和第一出样口151，并在第二进样口142注入缓冲液，同时手动对一个或多个捕获有所需的ctc的捕获通道12所对应的释放微阀13进行按压以释放ctc细胞并回收。如图6所示，该按压引起的释放微阀13的形变导致了流体的扰动，该扰动对之前捕获的细胞c造成冲击，使得细胞c从捕获通道12重新进入主通道11，并沿主通道11中的液体的流动方向先向上随后向右向下移动，离开主通道中的u型部111，从而实现了细胞c的释放，释放的细胞c的数量等于按压的释放微阀13的数量，且释放的细胞流向第二出样口，实现细胞的回收。

其中，第一进样口141、第一出样口151、第二进样口142和第二出样口152的开启和关闭分别通过利用注射器向与其对应的流控微阀22内抽取和注射液体(如水)来进行。流控微阀22内注射的液体所施加的正压挤压进样通道16或出样通道17使其形变封闭，进而实现进样口141、142或出样口151、152的关闭。流控微阀22内的液体被抽取且对进样通道16或出样通道17施加负压，则进样通道16或出样通道17的形变恢复，实现进样口141、142或出样口151、152的开启。本发明通过利用注射器抽取和注射液体是对进样通道16或出样通道17施加负压和正压进而实现了进样通道16或出样通道17的开启和关闭，和空气相比，液体由于具有不可压缩的性能，因此使进样通道16或出样通道17在形变的响应上更快。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。例如，本发明的单细胞分选可以仅仅包括上层芯片和玻璃片而省略下层芯片，缓冲液还可以替换为磷酸盐缓冲液，上层芯片和下层芯片的材质即第一材料可以替换为塑料，第二材料可以替换为具有相似性能的其他环氧树脂材料。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。