一种快速分离植物叶片角质层的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离植物叶片角质层领域。

背景技术

植物角质层(角质膜)覆盖在高等植物的茎、叶、花和果实上，主要由角质和蜡质组成。角质层具有耐酸碱、耐氧化、不易透水和透气的特性，因而作为植物体与外界环境的第一道保护屏障，可抵抗外界环境因子，如机械损伤、紫外线和干旱等胁迫，也可避免外界微生物侵染。角质层可以调节植物体表温度、调节水的渗透性，从而对植物体自身的各种生理活动起调节作用。研究人员发现角质层不仅在植物保护发育中有着重要作用，叶角质层内表面的凸缘特征在属和属下分类上与用生殖器官所依据的性状分类结果大体一致，在分类学上也具有重要意义。另外，角质层运输特征的研究在生态学、环境和农用化学等方面都具有非常重要的意义，完好地分离角质层是进行这方面研究的前提。

根据已有的报道，通过物理撕取的方法，分离出的角质层内表面结构模糊，表皮细胞大量粘附。因而经典的分离和观察角质层内表面的方法一般都是化学的方法，主要有：(1)用加热的果酸和果酸铵混合溶液浸泡植物组织，腐烂后分离角质层；(2)切碎后用20％三氧化铬(cro3)水溶液浸泡4-8小时，用蒸馏水冲洗后，再用毛笔或解剖针针清除残存在内表面的所有细胞，再用酒精干燥后分离角质层。然而，上述方法均存在不易操作，操作过程危险(操作人员需接触危险化学品)，处理时间较长，化学试剂处理使组织发生水解作用并破坏角质层内表面的完整性，角质层内外表面不易区分，以及清除残存在角质层内表面的细胞困难等问题。

技术实现要素：

针对如上所述的缺点，本发明提供出一种更为快速高效和能保护组织完整性的温和的分离角质层内膜的新方法，并且以扫描电镜定位，利用原子力显微镜观察其z轴上更精细的微观结构。

为达到本发明的目的，本发明的快速分离植物叶片角质层的方法按以下步骤进行：

一、表皮的撕取：选取新鲜嫩绿的植物叶子，用镊子撕取叶子的表皮；

二、角质层内表面的定位：将步骤一撕取的表皮的上下表面利用尼龙膜覆盖，将表皮的内表面向上放置，得到定位表皮结构；

三、叶肉细胞的去除：首先配制酶解液，按重量分数分别称取0.5％-3％的纤维素酶、0.005％-0.015％的聚乙烯吡咯烷酮、0.5％-3％的牛血清白蛋白和50％-60％的渗透缓冲液倒入培养皿中，混合得到酶解液，所述的酶解液ph为5-6；将步骤二中得到的定位表皮结构加入到上述酶解液中进行酶解反应，并且保证所述的定位表皮结构的内表面向上放置，酶解温度为23℃-27℃，酶解时间为2h-4h；

四、角质层内表面的清洗：用镊子夹住步骤三得到酶解后的定位表皮结构的尼龙膜，然后利用渗透缓冲液清洗数次，直至清洗溶液变成无色，得到清洗样品；

五、样品的干燥：将步骤四得到的样品进行干燥，得到分离的角质层结构。

优选地，所述的渗透缓冲液中按摩尔浓度由0.1m/l-1m/l的cacl2、0.1m/l-1m/l的mgcl2、1m/l-10m/l的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes·h2o)和按质量分数的山梨糖醇9％-10％组成，所述渗透缓冲液的ph为5-6。

优选地，步骤一所述撕取表皮的长为1cm-2cm和宽为0.5cm-1cm。

优选地，所述尼龙膜的孔径为30um-100um。所述尼龙膜购自北京科创汇达生物科技有限公司。

优选地，所述纤维素酶为纤维素酶r-10，产品编号为6008，产品参数为10000u/g。纤维素酶r-10产自日本yakult公司，购自北京科创汇达生物科技有限公司。

优选地，所述培养皿的直径为5ml-15ml。

优选地，步骤五所述样品的干燥方法为自然晾干法、超净台吹风辅助干燥法或冷冻干燥法。

优选地，所述的植物为被子植物。

优选地，通过上述所述的方法处理得到的植物叶片角质层，利用扫描电子显微镜进行观察可以看到清晰平整的角质层内表面结构，包括凹缘、凸缘和气孔等结构，较普通显微镜观察的结构更清晰。

优选地，通过上述所述的方法处理得到的植物叶片角质层，利用原子力显微镜可以看到更精细的内部结构，以及扫描电镜无法观察到的z轴的形貌和深度。

本发明相对于现有技术的优点：

1.用酶解法替换原有的化学方法，对内表面结构没有破坏；在扫描电镜下可清晰的看到内表面的结构，分离效果好；另外，本发明使用的酶液中无果胶酶而角质成分中含有果胶，这样本发明提供的分离角质层方法既有很好的酶解效果，又没有破坏角质本身的成分；

2.本发明中使用的尼龙膜用于物理支持酶解叶片，以区分角质层内表面与角质层外表面；渗透缓冲液既保持角质层内表面形态，又利用和酶解液同等的弱酸性溶液以清洗酶解后松软的附着物；

3.操作快速、简便且酶解效率高：酶解法只需要处理2-4小时；

4.成本低廉：只用单一的纤维素酶；

5.操作安全：酶解法代替传统化学方法，无腐蚀性，操作安全。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出来了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为在普通光学显微镜下观察到的未处理的菠菜角质层内表面的结构；

图2为在普通光学显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表面的结构；

图3为在扫描电子显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表面的结构；

图4为在扫描电子显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表面气孔结构；

图5为在扫描电子显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表凸缘的放大结构(5000倍)；

图6为在原子力显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表面的凸缘结构；

图7为在原子力显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表面的凹缘结构；

图8为在扫描电子显微镜下观察到的酶解后的冬青角质层内表面的结构；

图9为在扫描电子显微镜下观察到的酶解后的冬青角质层内表面气孔结构；

图10为在扫描电子显微镜下观察到的酶解后的萱草角质层内表面的结构(100倍)；

图11为在扫描电子显微镜下观察到的酶解后的萱草角质层内表面的结构(200倍)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制权利要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

第一实施例

本发明的快速分离植物叶片角质层的方法按以下步骤进行：

一、表皮的撕取：选取新鲜嫩绿的植物叶子，用镊子撕取叶子的表皮；

二、角质层内表面的定位：将步骤一撕取的表皮的上下表面利用尼龙膜覆盖，将表皮的内表面向上放置，得到定位表皮结构；

三、叶肉细胞的去除：首先配制酶解液，按重量分数分别称取0.5％-3％的纤维素酶、0.005％-0.015％的聚乙烯吡咯烷酮、0.5％-3％的牛血清白蛋白和50％-60％的渗透缓冲液倒入培养皿中，混合得到酶解液，所述的酶解液ph为5-6；将步骤二中得到的定位表皮结构加入到上述酶解液中进行酶解反应，并且保证所述的定位表皮结构的内表面向上放置，酶解温度为23℃-27℃，酶解时间为2h-4h；

四、角质层内表面的清洗：用镊子夹住步骤三得到酶解后的定位表皮结构的尼龙膜，然后利用渗透缓冲液清洗数次，直至清洗溶液变成无色，得到清洗样品；

五、样品的干燥：将步骤四得到的样品进行干燥，得到分离的角质层结构。

其中，所述的渗透缓冲液按摩尔浓度由0.1m/l-1m/l的cacl2、0.1m/l-1m/l的mgcl2、1m/l-10m/l的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物和按质量分数的山梨糖醇9％-10％组成，所述渗透缓冲液的ph为5-6。

本发明实施例提供的快速分离植物叶片角质层的方法，与前述实施方式不同的是，步骤一所述撕取表皮的长为1cm-2cm和宽为0.5cm-1cm。

第二实施例

本发明实施例提供的快速分离植物叶片角质层的方法，与第一实施例不同的是，所述尼龙膜的孔径为30um-100um。

其中，所述纤维素酶为纤维素酶r-10，产品编号为6008，产品参数为10000u/g。

本发明实施例提供的快速分离植物叶片角质层的方法，与前述实施方式不同的是，所述培养皿的直径为5ml-15ml。

第三实施例

本发明实施例提供的快速分离植物叶片角质层的方法，与第一实施例和第二实施例不同的是，步骤五所述样品的干燥方法为自然晾干法、超净台吹风辅助干燥法或冷冻干燥法。

其中，所述的植物为被子植物。

第四实施例

本发明实施例提供的快速分离植物叶片角质层的方法，与第一实施例至第三实施例不同的是，通过上述所述的方法处理得到的植物叶片角质层，利用扫描电子显微镜进行观察可以看到清晰平整的角质层内表面结构，包括凹缘、凸缘和气孔等结构，较普通显微镜观察的结构更清晰。

本发明实施例提供的快速分离植物叶片角质层的方法，与前述实施方式不同的是，通过上述所述的方法处理得到的植物叶片角质层，利用原子力显微镜可以看到更精细的内部结构，以及扫描电镜无法观察到的z轴的形貌和深度。

具体实施例1：菠菜角质层内表面的分离及其显微镜观测

本实施例的菠菜角质层内表面的分离方法按以下步骤进行：

一、选取材料为新鲜的菠菜叶子，直接用镊子撕取尽可能大的表皮；

二、在培养皿底部铺一层100um孔径尼龙膜，再将撕取的表皮铺展在上面，正面向上，然后在上面铺一层尼龙膜；

三、首先配制酶解液，按重量分数分别称取3％的纤维素酶r-10、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、1％牛血清白蛋白和55％的渗透缓冲液倒入培养皿中定容至50ml，得到酶解液，ph为5；将表皮内表面向上置于酶解液中并于25℃下置于黑暗处，静置酶解2小时；所述渗透缓冲液为0.5mmcacl2、0.5mmmgcl2和9g山梨糖醇，再加入5mm和ph＝5.5的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物加入到100毫升水里配制成的溶液；

四、清洗：用镊子夹住尼龙膜，并利用渗透缓冲液清洗数次，直至清洗溶液变成无色，得到清洗样品；

五、干燥样品：将样品内表面向上，超净台下辅助晾干，得到分离的角质层结构。

显微镜观察方法

(一)将具体实施例1已分离的角质层结构先在普通显微镜下观察，选取干净平整无褶皱的样品；

通过具体实施例1的方法处理得到的角质层结构显微镜下观察结果如图2所示，相比未处理的图1，经过酶解后去除叶肉细胞等多余细胞的菠菜样品角质层内表面结构清晰，平整无褶皱。

(二)将具体实施例1已分离的角质层结构在扫描电镜下观察菠菜角质层内表面

方法为：取载玻片，用含1％hcl的75％酒精浸泡过夜(质量分数)，自来水冲洗多次至载玻片表面清亮光滑，水不挂壁，然后用去离子水润洗两次(每次15s)；然后取载玻片，将其置于真空干燥器中自然晾干，并保存于真空干燥器内；最后取通过显微镜下观察过的载玻片，将其进行冷冻干燥后喷金，扫描电镜下观察。

通过具体实施例1的方法处理得到的角质层结构在扫描电子显微镜下观察，实验结果说明酶解后可以看到清晰平整的角质层内表面结构，包括凹缘、凸缘、气孔等结构。图3为200倍下的整体结构图；图4为为放大5000倍的气孔结构；图5为为放大5000倍的凹缘和凸缘的局部结构。

(三)将具体实施例1已分离的角质层结构在原子力显微镜下观察菠菜角质层内表面

将在扫描电镜下观察过的菠菜角质层切取部分，置于铜片上，用原子力显微镜观察。原子力显微镜实验结果说明利用原子力显微镜可以看到更精细的内部结构，以及扫描电镜无法观察到的z轴的形貌和深度，图6为在原子力显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表面的精细凸缘结构，可以得知凸缘结构高度大概在1微米左右，宽度在3-5微米，这是扫描电镜无法得到的结果；图7为在原子力显微镜下观察到的酶解后的菠菜角质层内表面的凹缘结构。

具体实施例2：冬青角质层内表面的分离及其显微镜观测

本实施例的冬青角质层内表面的分离方法按以下步骤进行：

一、选取材料为新鲜的冬青叶子，直接用镊子撕取尽可能大的表皮；

二、在培养皿底部铺一层120um孔径尼龙膜，再将撕取的表皮铺展在上面，正面向上，然后在上面铺一层尼龙膜；

三、首先配制酶解液，按重量分数分别称取2.5％的纤维素酶r-10、0.015％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％牛血清白蛋白和50％的渗透缓冲液倒入培养皿中定容至50ml，得到酶解液，ph为5.5；将表皮内表面向上置于酶解液中并于25℃下置于黑暗处，静置酶解3小时；所述渗透缓冲液为0.6mmcacl2、0.6mmmgcl2和12g山梨糖醇，再加入5mm和ph＝5的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物加入到100毫升水里配制成的溶液；

四、清洗：用镊子夹住尼龙膜，并利用渗透缓冲液清洗数次，直至清洗溶液变成无色，得到清洗样品；

五、干燥样品：将样品内表面向上，超净台下辅助晾干，得到分离的角质层结构。

将具体实施例2已分离的冬青角质层结构在扫描电镜下观察角质层内表面

方法为：取载玻片，用含1％hcl的75％酒精浸泡过夜，自来水冲洗多次至载玻片表面清亮光滑，水不挂壁，然后用去离子水润洗两次(每次15s)；然后取载玻片，将其置于真空干燥器中自然晾干，并保存于真空干燥器内；最后取冬青角质层结构制成载玻片，将其进行冷冻干燥后喷金，扫描电镜下观察。

通过具体实施例2的方法处理得到的冬青角质层结构在扫描电子显微镜下观察，实验结果说明酶解后由图8和9可以看到扫描电子显微镜下观察到的酶解后的冬青角质层内表面的清晰平整的结构以及气孔结构。

具体实施例3：萱草角质层内表面的分离及其显微镜观测

本实施例的萱草角质层内表面的分离方法按以下步骤进行：

一、选取材料为新鲜的萱草叶子，直接用镊子撕取尽可能大的表皮；

二、在培养皿底部铺一层100um孔径尼龙膜，再将撕取的表皮铺展在上面，正面向上，然后在上面铺一层尼龙膜；

三、首先配制酶解液，按重量分数分别称取2％的纤维素酶r-10、0.012％的聚乙烯吡咯烷酮、1.5％的牛血清白蛋白和55％的渗透缓冲液倒入培养皿中定容至50ml，得到酶解液，ph为6；将表皮内表面向上置于酶解液中并于25℃下置于黑暗处，静置酶解4小时；所述渗透缓冲液为0.8mm的cacl2、0.8mm的mgcl2和12g的山梨糖醇，再加入5mm和ph＝5的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物加入到100毫升水里配制成的溶液；

四、清洗：用镊子夹住尼龙膜，并利用渗透缓冲液清洗数次，直至清洗溶液变成无色，得到清洗样品；

五、干燥样品：将样品内表面向上，然后冷冻干燥，得到分离的角质层结构。

将具体实施例3已分离的萱草角质层结构在扫描电镜下观察角质层内表面

方法为：取载玻片，用含1％hcl的75％酒精浸泡过夜，自来水冲洗多次至载玻片表面清亮光滑，水不挂壁，然后用去离子水润洗两次(每次15s)；然后取载玻片，将其置于真空干燥器中自然晾干，并保存于真空干燥器内；最后取萱草角质层结构制成载玻片，将其进行冷冻干燥后喷金，扫描电镜下观察。

通过具体实施例3的方法处理得到的萱草角质层结构在扫描电子显微镜下观察，由图10可以看到扫描电子显微镜下观察到的酶解后的萱草角质层内表面的清晰平整的结构，图11还可以看到角质化条纹的沟槽中不均匀的分布着少量蜡质颗粒或结晶。

综上所述，本发明提供的快速分离植物叶片角质层的方法适用于多种植物，用酶解法替换原有的化学方法，操作快速只需要处理2-4小时，无腐蚀性，操作安全；在扫描电镜下可清晰的看到内表面的结构，分离效果好。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式和实施例仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。