快速检测人类Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用的制作方法

本发明属于基因缺失检测
技术领域：
，具体涉及一种快速检测人类y染色体微缺失的多重pcr引物组、试剂盒和应用。
背景技术：
y染色体微缺失在造成男性不育症的遗传因素中居第二位，发生率仅次于克氏综合征。一般人群y染色体微缺失发生率为1/4,000，但在不育男性中显著升高。目前y染色体微缺失已成为无精、少精和弱精患者的常规检测项目。在少精子症或无精子症男性中发现的y染色体微缺失区域，主要是无精子因子(azoospermiafactor，azf)区域包含azfa、azfb、azfc区。欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网(eaa/emqn)2004年发表“y染色体微缺失分子诊断指导意见”建议通过对各azf区的共6个sts位点检测y染色体微缺失每个区域检测2个sts，分别为azfa检测sy84和sy86，azfb检测sy127和sy134，azfc检测sy254和sy255，若每个区域的2个sts发生缺失时，则代表该区域发生缺失，并指出以上6个sts能检测出超过95％的azf缺失。现有产品应用最为广泛的方法为多重pcr-琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度和分辨率不高，容易出现pcr产物污染造成假阳性，产物量较少时条带不易判别容易出现假阴性，不利于临床结果的判断，且操作较为复杂，耗时长。其它的一些检测方法如基因芯片、测序法，毛细管电泳法，虽然具有高通量、高精确性等特点，但技术要求高，仪器设备昂贵，不利于推广。目前，已有多重荧光定量pcr检测y染色体微缺失，例如中国专利申请cn102876776a公布了检测y染色体微缺失的实时荧光定量pcr试剂盒及方法，该方法只是采用多重荧光定量pcr技术检测y染色体微缺失；中国专利申请cn102703578a也公布了y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒，该试剂盒采取多重荧光定量pcr技术结合同源加尾引物(hand引物)，抑制引物二聚体的产生，但存在多个靶点扩增条件不兼容的问题。因此，急需一种既能抑制引物二聚体产生，又能解决多重pcr技术多个靶点扩增条件不兼容的难点的检测方法和试剂盒。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种快速检测人类y染色体微缺失的多重pcr引物组、试剂盒和应用，通过运用多重荧光pcr技术结合同源加尾系统(homo-tagassistednon-dimersystem,hand)和靶序列富集多重pcr技术(targetenrichedmultiplexpcr，tem-pcr)，实现抑制引物二聚体产生，又能解决多重pcr技术多个靶点扩增条件不兼容的难题，提高检测灵敏度，具有快速、低成本、高准确度、高敏感性、稳定性和均一性的优点。为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种快速检测人类y染色体微缺失的多重pcr引物组，所述多重pcr引物组包括通用引物和特异性引物，可同时扩增6个与y染色体微缺失检测相关的位点和内参基因：所述通用引物具有如seqidno：36和seqidno：37所示的碱基序列；所述6个与y染色体微缺失检测相关的位点包括：sy84、sy86、sy127、sy134、sy254、sy255位点；所述内参基因为sry；所述特异性引物包括具有如seqidno：1～seqidno：4、seqidno：6～seqidno：9、seqidno：11～seqidno：14、seqidno：16～seqidno：19、seqidno：21～seqidno：24、seqidno：26～seqidno：29、seqidno：31～seqidno：34所示的碱基序列。另一方面，本发明提供一种快速检测人类y染色体微缺失的试剂盒，所述试剂盒包括pcr反应液i、pcr反应液ii和纯水，所述pcr反应液i包括第一多重pcr引物组、第一探针和qpcrprobemastermix；所述pcr反应液ii包括第二多重pcr引物组、第二探针和qpcrprobemastermix；所述第一多重pcr引物组包括具有如seqidno：1～seqidno：4、seqidno：6～seqidno：9、seqidno：11～seqidno：14、seqidno：16～seqidno：19所示的碱基序列的特异性引物和具有如seqidno：36和seqidno：37所示的碱基序列的通用引物；所述第二多重pcr引物组包括具有如seqidno：1～seqidno：4、seqidno：6～seqidno：9、seqidno：11～seqidno：14、seqidno：16～seqidno：19、seqidno：21～seqidno：24、seqidno：26～seqidno：29、seqidno：31～seqidno：34所示的碱基序列的特异性引物和具有如seqidno：36和seqidno：37所示的碱基序列的通用引物。进一步地，所述第一探针包括具有如seqidno：5、seqidno：10、seqidno：15、seqidno：20所示的碱基序列；所述第二探针包括具有如seqidno：25、seqidno：30、seqidno：35所示的碱基序列。进一步地，所述探针包括taqman-mgb探针或taqman探针；所述探针的荧光标记包括fam、vic、tram、cy5或其组合。进一步地，所述qpcrprobemastermix包括：pcrbuffer缓冲液、热启动taqdna酶、dntps、dutp、ung酶。进一步地，所述pcrbuffer缓冲液包括：20～80mmol/ltris-hcl、1％tween-20、2～8mmol/lnan3、2～10mmol/lmgcl2。进一步地，所述热启动taqdna聚合酶的浓度为50u/ml～200u/ml。进一步地，所述热启动taq酶的浓度为100～400μm。进一步地，所述ung酶的浓度为50u/ml～200u/ml。进一步地，所述dntps的浓度为20～200μm。进一步地，所述dutp的浓度为5～100μm。进一步地，所述dntps与dutp摩尔用量比为2～4:1。进一步地，所述第一多重pcr引物组和第二多重pcr引物组中特异性引物的浓度为10～50μm；通用引物的浓度为200～1000μm。进一步地，所述第一探针和第二探针的浓度均80～200μm。优选地，所述特异性引物包括特异性pcr引物和巢式pcr引物。进一步地，所述试剂盒还包括对照dna标本。进一步地，所述对照dna标本包括正常男性dna、正常女性dna、0.1×tebuffer或其组合。优选地，特异性扩增sry基因的pcr引物，序列如：seqidno：1和seqidno：2所示；特异性扩增sry基因的pcr巢式引物，序列如：seqidno：3和seqidno：4所示；sry位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：5所示；特异性扩增y染色体sy84位点的pcr引物，序列如：seqidno：6和seqidno：7所示；特异性扩增y染色体sy84位点的pcr巢式引物，序列如：seqidno：8和seqidno：9所示；sy84位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：10所示；特异性扩增y染色体sy127位点的pcr引物，序列如：seqidno：11和seqidno：12所示；特异性扩增y染色体sy127位点的pcr巢式引物，序列如：seqidno：13和seqidno：14所示；sy127位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：15所示；特异性扩增y染色体sy255位点的pcr引物，序列如：seqidno：16和seqidno：17所示；特异性扩增y染色体sy255位点的pcr巢式引物，序列如：seqidno：18和seqidno：19所示；sy255位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：20所示；特异性扩增sry基因的pcr引物，序列如：seqidno：1和seqidno：2所示；特异性扩增sry基因的pcr巢式引物，序列如：seqidno：3和seqidno：4所示；sry位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：5所示；特异性扩增y染色体sy86位点的pcr引物；序列如：seqidno：21和seqidno：22所示；特异性扩增y染色体sy86位点的pcr巢式引物，序列如：seqidno：23和seqidno：24所示；sy86位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：25所示；特异性扩增y染色体sy134的pcr引物，序列如：seqidno：26和seqidno：27所示；特异性扩增y染色体sy134位点的pcr巢式引物，序列如：seqidno：28和seqidno：29所示；sy134位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：30所示；特异性扩增y染色体sy254的pcr引物，序列如：seqidno：31和seqidno：32所示；特异性扩增y染色体sy254位点的pcr巢式引物，序列如：seqidno：33和seqidno：34所示；sy254位点taqman-mgb探针序列如：seqidno：35所示。再又一方面，本发明提供一种快速检测人类y染色体微缺失的方法，所述方法包括如下步骤：1)取血，提取dna；2)将所得dna运用本发明所述的试剂盒进行pcr反应程序；3)检测反应结果并分析。进一步地，所述pcr反应程序包括ung酶反应、预变性、富集阶段、加标签阶段、扩增阶段；具体的程序如下：所述ung酶反应：37℃，5min，1循环；所述预变性：95℃，3min，1循环；所述富集阶段：95℃，15s，58℃，1min，72℃，1min，10循环；所述加标签阶段：95℃，15s，72℃，12min，10循环；所述扩增阶段：95℃，15s，58℃，1min，20循环。一方面，本发明提供一种上述多重pcr引物组或上述试剂盒作为检测人类y染色体微缺失试剂的用途。本发明提供一种快速检测人类y染色体微缺失的试剂盒，可同时扩增y染色体上6个sts基因位点和内参基因y染色体性别决定基因(sex-determiningregionofy-chromosome，sry)；每个sts位点都含有特异性扩增的pcr引物和特异性扩增的rcr巢式引物，其中pcr巢式引物具有一个共同的特点就是含以pcr扩增的通用引物序列的接头。所述试剂盒包括pcr反应液ⅰ、pcr反应液ⅱ、正常男性基因组dna、正常女性基因组dna以及0.1×tebuffer。本发明建立了一种快速、简便的y染色体微缺失检测试剂盒，同时优化了多重荧光定量pcr的扩增效率，有效的抑制二聚体，提高多重pcr体系引物的容纳数量，还可以减小各个基因扩增效率的差异，促使扩增均衡、高效和稳定。本发明提供一种快速检测人类y染色体微缺失的多重pcr引物组、试剂盒和应用，通过运用多重pcr荧光探针法，以sry为内参，扩增y染色体azf基因家族azfa、azfb、azfc三个区域中的6个sts位点；提供一种闭管操作，能避免交叉污染，且检测灵敏度高，操作更加便捷、简单，易于推广y染色体微缺失检测试剂盒。同时，本发明也是改良的多重荧光定量pcr方法，通过将hand系统、tem-pcr技术、多重荧光定量pcr技术三者相结合，解决了多重pcr技术多个靶点扩增条件不兼容的难点。既有tem-pcr技术、荧光定量pcr技术的优点，也克服tem-pcr、荧光定量pcr技术的缺点。本发明的试剂盒用于检测y染色体微缺失的方法简单、高效、快速、低成本、高准确度、高敏感性、通用性好、特异性强，设备简单。本发明采用多重荧光定量pcr技术结合hand引物系统和tem-pcr技术，三者紧密结合，抑制了引物二聚体的产生，解决了多重pcr技术多个靶点扩增条件不兼容的难点具有以下优势：特异性高：采用tem-pcr技术，至少含有两对巢式特异性pcr引物，即使在多对巢式引物同时存在条件下，也能保证其互补靶序列特异性结合；扩增效率的一致性：特异性引物浓度低不容易形成引物二聚体，仅一对标签引物即可进行多个基因扩增，降低了各个基因之间的扩增效率的差异；半定量：采用hand系统，使用标签引物进行扩增，靶序列具有相同的扩增效率，通过结合荧光定量检测，扩增终点的产物量能够一定程度上反应模板的初始拷贝量。高效性：能在一次反应中进行多个基因扩增，利用荧光定量pcr仪平台，扩增高效性和检测的高效性结合。灵活性：可根据待检测的靶序列，设计不同的巢式引物，可对现有的组合进行增减，可以针对不同的靶序列，在原靶序列组合中随意增减扩增目标，不会降低靶序列的检测。敏感性：使用荧光定量pcr技术检测具有较高的敏感性。兼容性：每个靶序列采用2对巢式引物，形成4种组合，每种靶序列具有4种可能的扩增模型，容易寻找不同靶序列的最佳通用条件，克服了常规多重pcr技术中难以找到合适的通用条件的缺陷。附图说明图1a和图1b本发明优选试剂盒的各个位点sts以及内参基因sry基因的扩增效率。图2为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅰ正常男性dna样本检测图；图3为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅱ正常男性dna样本检测图；图4为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅰ人类y染色体微缺失azfa区缺失样本检测图；图5为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅱ人类y染色体微缺失azfa区缺失样本检测图；图6为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅰ人类y染色体微缺失azfb区缺失样本检测图；图7为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅱ人类y染色体微缺失azfb区缺失样本检测图图8为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅰ人类y染色体微缺失azfc区缺失样本检测图；图9为本发明优选试剂盒的pcr反应液ⅱ人类y染色体微缺失azfc区缺失样本检测图。图中，standardcurve标准线；amplificationplot扩增图；cycle循环。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。1.1hand系统低浓度的加尾标签特异性与模板特异性结合，形成含有标签引物相同的序列的初始pcr产物；此时加尾特异性引物之间形成二聚体，由于两端存在互补的标签序列，引物二聚体的单链各自形成一个稳定的发夹结构，从而难以进行循环扩增。然后高浓度的标签引物以初始pcr产物为模板进行特异性结合，直至扩增完成。1.2改进的tem-pcr在tem-pcr中，针对待扩增的每一种靶序列，设计两对巢式的特异性引物：fo，ro；fi，ri。其中的fi和ri引物对带有一个能被通用的超级引物(superprimer)识别的标签序列。巢式的靶序列特异性引物的浓度极低，用于在pcr的最初几个循环中富集目标序列。整个扩增过程由以下3个阶段组成。(1)富集阶段：低浓度的基因特异性引物被给予足够的时间以发现并结合模板。对每个目标序列，根据所使用的引物，可以形成4种产物：fo/ro、fi/ro、fi/ri和fo/ri。这一阶段一般进行10个循环。(2)加标签阶段：把退火温度提高到72℃，此时，仅有长至40寡核苷酸的内部引物(fi和ri)能够结合模板。10个循环后，所有的pcr产物都被标记上和通用超级引物相同的标签序列。(3)扩增阶段：高浓度的超级引物高效地扩增所有的靶序列。1.3荧光定量pcr实时荧光pcr(real-timepcr)，基于荧光共振能量迁移原理，当两个荧光基团靠近时，高能量荧光基团会将受激发产生的能量转移到相邻的低能量荧光基团上。由于标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以反映pcr扩增产物的数量变化，从而使得荧光pcr技术可以起到实时检测的目的。实时荧光pcr不仅具有普通pcr的高灵敏性，而且由于应用了荧光探针，可以通过光电传导系统直接探测pcr扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，与常规pcr相比具有无需进行后pcr的处理，可避免因进行琼脂糖凝胶电泳而可能造成的交叉污染，从而提高检测的准确率和可信度。实施例1试剂盒的制备2.1通用引物筛选出适合的适用于人基因扩增同源加尾通用引物，序列如表1所示：表1：通用引物序列fsseqidno：36gcagtggtatcaacgcagrsseqidno：37ccagggtccgaggtattca2.2y染色头微缺失sts位点特异性引物设计以及筛选通过引物、探针设计软件(例如primer6.0、beacondesigner7.0等)、引物设计在线系统，blast在线系统设计y染色头微缺失sts位点特异性引物及探针，内参基团特异性引物、探针。由生工或者英潍捷基合成后，用abiviia7实时荧光定量pcr仪进行引物及探针检测和筛选。各引物序列及探针序列如表2所示表2：引物及其序列2.3.反应组合的确定以及反应条件优化通过上述确定的引物及探针，采用多重荧光定量pcr对6个sts位点进行检测，确定最佳的反应组合及实验反应条件。pcr反应体系如表3所示，pcr反应条件如表4所示：表3：pcr反应体系表4pcr反应条件每次pcr反应均需要加入正常性对照品(正常男性基因组dna)、阴性对照品(正常女性基因组dna)、空白对照(0.1×tebuffer)。实施例2本发明试剂盒的使用本发明实施例1所述试剂盒用于体外定性检测人类y染色体上影响精子生成的无精子因子(azoospermiafactor，azf)区域的片段微缺失。定性检测欧洲男科协会(eaa)与欧洲分子遗传质控网(emqn)推荐azfa、azfb、azfc区的6个sts(sy84、sy86、sy127、sy134、sy254、sy255)。上述试剂盒仅用于y染色体azf区域微缺失基因检测，可作为男性不育原因查找的分子检查手段，其结果不能直接作为男性不育的最终诊断依据。一、临床适应症背景：目前，全世界不育夫妇约占已婚夫妇的15％，其中由于男方原因引起的不育占50％。研究表明，y染色体上的精子生成因子(azoospermiafactor，azf)位点微缺失是男性原发性不育的一个重要遗传因素。azf基因家族有azfa、azfb、azfc三个区域，其中任何一个区域的微缺失都能导致精子生成障碍。二、检验原理：本发明试剂盒产品采用多重pcr-荧光探针法检测。多重pcr：根据ncbi上公布的azf区域sts序列，参考eaa和emqn颁布的《y染色体微缺失分子诊断实验室指南》选择6个sts序列片段，根据各sts基因序列特点，设计特异性的引物，分2管进行多重pcr检测；同时检测y染色体性别决定基因(sex-determiningregionofy-chromosome，sry)基因作为实验内控。实时荧光pcr(探针法):pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在dna任意一条单链上；pcr扩增时，taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。如表5所示为本发明检测人类y染色体微缺失的试剂盒的组成。表5y染色体微缺失的试剂盒的组成组成成分主要成分规格数量pcr反应液ⅰ引物，探针，qpcrprobemastermix20人份278μlpcr反应液ⅱ引物，探针，qpcrprobemastermix20人份278μl纯水ddh2o20人份1ml正常男性dna正常男性基因组dna20人份15ul正常女性dna正常男性基因组dna20人份15ul说明：试剂盒中不同批号的组份不可以互换使用。储存条件：试剂盒置于-20℃保存有效期：6个月pcr仪：steponetm&steponeplustmreal-timepcrsystem；applied7500&applied7500fastreal-timepcrsystems；qpcrprobemastermix包括：pcrbuffer(缓冲液)、热启动taqdna酶、dntps、dutp、ung酶。所述的pcrbuffer(缓冲液)包含20～80mmol/ltris-hcl、1％tween-20、2～8mmol/lnan3、2～10mmol/lmgcl2等，taqdna聚合酶的浓度为50u/ml～200u/ml，热启动taq酶浓度100～400μm，ung酶浓度为50u/ml～200u/ml,dntps浓度20～200μm,dutp浓度为5～100μm。dntps与dutp用量为2～4:1。三、样本要求本试剂盒样本来源为人(男性)外周全血基因组dna，dna浓度在5ng/μl以上，纯度a260/a280在1.8～2.0之间。样本保存：dna样本在室温(18～28℃)放置不超过24小时，2～8℃保存不超过一周，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存；冷冻保存的样本，反复冻融不宜超过6次。样本运输：dna样本在运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。四、检验方法1、样本基因组dna的准备：本试剂盒对人基因组dna的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组dna。取适量edta-k2或枸橼酸钠抗凝的人外周全血并提取人基因组dna。所提取的dna样本须满足上述样本要求。2、反应液准备及加样：每次试验所需的pcr反应液人份数为n，n＝待检样本数+1份正常对照+1份阴性对照+1份空白对照；从试剂盒中取出pcr反应液管i、ii，正常男性dna，正常女性dna和纯水，均置于室温融化，混匀后短暂离心。每一个样本按表6要求加样，反应总体积为20μl。表6试剂盒体系配置pcr反应液ⅰpcr反应ⅱpcr反应液ⅰ(μl)13.9-pcr反应液ⅱ(μl)-13.9待检样本dna(浓度20～30ng/μl)22纯水(μl)4.14.1试剂盒的正常性对照为正常男性dna，阴性对照为正常女性dna，均无需提取直接使用；空白对照为0.1×tebuffer。对照组与待检样本同步处理，加样完毕，短暂离心pcr96孔板或八排管使所加试剂聚集到管底后。将pcr反应板放入荧光定量pcr仪中检测。选择仪器检测通道后设置pcr扩增程序(表7)表7pcr扩增程序3、质控标准：质控标准见表8表8质控标准注意：以上要求必须在同一次实验中同时满足，否则，本次实验视为无效。结果分析：每次试验需满足“3、质控标准”的要求，试验视为有效，然后才能进行结果分析。试剂盒以男性性别决定区基因(sry)作为内控，只有当每个反应中内控扩增正常，才能进行各sts的结果判读。若sry无扩增，提示dna样本异常，应重新提取后重新检测。结果判读根据各样本的扩增曲线即可判读各sts是否发生缺失，若sts位点出现相应的s型扩增曲线，且ct值<32，提示该sts位点无缺失。若ct值>32，则提示dna模板偏低或存在pcr抑制物。若无扩增信号，提示该sts位点缺失。结果分析示例见表10。表10表10中(-)表示检测结果为阴性图1和图2为使用本发明试剂盒的正常男性dna样本检测图；由图所示，该样本在反应液ⅰ、ⅱ中sry扩增正常，且各sts位点均有扩增且ct值<32，未出现缺失，为正常男性样本。图3和图4为使用本发明试剂盒的人类y染色体微缺失azfa区缺失样本(sy84(-)、sy86(-))检测图；由图所示，该样本在该样本在反应液ⅰ、ⅱ中sry，且反应液ⅰ中sy84无扩增曲线，反应ⅱ中sy86无扩增曲线，其它位点扩增正常，所以该样本属于azfc区缺失样本。图5和图6为使用本发明试剂盒的人类y染色体微缺失azfb区缺失样本(sy127(-)、sy134(-))检测图；由图所示，该样本在该样本在反应液ⅰ、ⅱ中sry扩增正常，且反应液ⅰ中sy127无扩增曲线，反应ⅱ中sy134无扩增曲线，其它位点扩增正常，所以该样本属于azfc区缺失样本。图7和图8为使用本发明试剂盒的人类y染色体微缺失azfc区缺失样本(sy254(-)、sy255(-))检测图；由图所示，该样本在该样本在反应液ⅰ、ⅱ中sry扩增正常，且反应液ⅰ中sy254无扩增曲线，反应ⅱ中s255无扩增曲线，其它位点扩增正常，所以该样本属于azfc区缺失样本。5、本发明试剂和性能指标(1)准确性验证检测5种已知缺失类型样本(每种类型4个样本)和三种已知的阴性样本(每种类型4个样本)，每个样本重复检测3次。分别用4批产品进行检测。检测结果为阳性符合率100％，阴性符合率100％，准确性验证通过。(2)灵敏度分析选择5种已知缺失类型样本及一个阴性样本，每个样本稀释7个浓度梯度，分别用4批产品进行检测，该试剂盒能稳定检测出5ng/μl浓度以上的人类基因组dna样品。(3)特异性分析收集5个正常男性样本和5例非y染色体azf区域微缺失导致少精或无精的男性样本(由精索静脉曲张、隐睾、生殖系统感染、内分泌紊乱或免疫反应异常等原因造成)进行检测。结果显示10例样本均无sts位点缺失。(4)重复性选择2个正常男性样本和5种已知缺失类型的样本(每种类型1个样本)，每个样本两个浓度为5ng/μl和30ng/μl，分别用4批产品进行检测，不同人操作，每个样品重复检测5次，每次检测结果无差异(5)稳定性经验证，该试剂盒在-20℃以下避光储存10个月质量合格，确定有效期为6个月。例如taqman-mgb探针可以换成taqman探针，探针的荧光标记不仅局限于fam、vic、tram、cy5等4种，还可以是其他的荧光标记探针，上述各个位点的可以是各种荧光标记的组合；上述pcr反应的组合均可以进行调整。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>广州达晖生物技术股份有限公司<120>快速检测人类y染色体微缺失的多重pcr引物组、试剂盒和应用<130>2018<160>37<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>sry-fo<400>1aatacccgaattataagtatcga23<210>2<211>22<212>dna<213>sry-ro<400>2cgttgatgggcggtaagtggcc22<210>3<211>47<212>dna<213>sry-fi<400>3tagggcaagcagtggtatcaacgcagacctcgtcggaaggcgaagat47<210>4<211>49<212>dna<213>sry-ri<400>4acgactcaccagggtccgaggtattcagctggtgctccattcttgagtg49<210>5<211>26<212>dna<213>sry-probe<400>5ctgccgaagaattgcagtttgcttcc26<210>6<211>21<212>dna<213>sy84-fo<400>6cagtgcccatatgggccttag21<210>7<211>20<212>dna<213>sy84-ro<400>7attagccagacactaaagaa20<210>8<211>48<212>dna<213>sy84-fi<400>8tagggcaagcagtggtatcaacgcagattagtctgctgtaggcatgct48<210>9<211>48<212>dna<213>sy84-ri<400>9acgactcaccagggtccgaggtattcaagaaagggtcccactgaatct48<210>10<211>27<212>dna<213>sy84-probe<400>10ccagcccatgtttcgtgcagattaagg27<210>11<211>20<212>dna<213>sy127-fo<400>11tctgaagtaataattcatag20<210>12<211>17<212>dna<213>sy127-ro<400>12taatcaagctgcaggca17<210>13<211>45<212>dna<213>sy127-fi<400>13tagggcaagcagtggtatcaacgcagagcacccactggaatctac45<210>14<211>47<212>dna<213>sy127-ri<400>14acgactcaccagggtccgaggtattcacaagctgtgacacagaaatg47<210>15<211>23<212>dna<213>sy127-probe<400>15cccactgtgttcatgcccacaaa23<210>16<211>19<212>dna<213>sy255-fo<400>16ggtctgaacgtgctgagtt19<210>17<211>19<212>dna<213>sy255-ro<400>17aacaaaagttatgtgctcg19<210>18<211>46<212>dna<213>sy255-fi<400>18tagggcaagcagtggtatcaacgcagagttacaggattcggcgtga46<210>19<211>44<212>dna<213>sy255-ri<400>19acgactcaccagggtccgaggtattcactcgtcatgtgcagcca44<210>20<211>29<212>dna<213>sy255-probe<400>20ctgcaggtaggtttcagtgtttggattcc29<210>21<211>18<212>dna<213>sy86-fo<400>21atgtcaaggctgcagatc18<210>22<211>21<212>dna<213>sy86-ro<400>22tggccatagcttgatctcaga21<210>23<211>47<212>dna<213>sy86-fi<400>23tagggcaagcagtggtatcaacgcagaggatctcactttgcaggaca47<210>24<211>48<212>dna<213>sy86-ri<400>24acgactcaccagggtccgaggtattcagatctcagacttctagcctca48<210>25<211>27<212>dna<213>sy86-probe<400>25ctgtgagaatcaaggttgttgtttaag27<210>26<211>21<212>dna<213>sy134-fo<400>26tacttgaagcgttctgtgact21<210>27<211>21<212>dna<213>sy134-ro<400>27tagaacttattactaaactgt21<210>28<211>47<212>dna<213>sy134-fi<400>28tagggcaagcagtggtatcaacgcagactgaagtgcatagcatgatg47<210>29<211>48<212>dna<213>sy134-ri<400>29acgactcaccagggtccgaggtattcaaccactgccaaaactttcaag48<210>30<211>27<212>dna<213>sy134-probe<400>30catgagtaccacccaagacaaaacacc27<210>31<211>21<212>dna<213>sy254-fo<400>31gggagaaatttccacctcatg21<210>32<211>20<212>dna<213>sy254-ro<400>32ttcacttctttcactgaacc20<210>33<211>52<212>dna<213>sy254-fi<400>33tagggcaagcagtggtatcaacgcagaccacctcatggtagtaaaattgtag52<210>34<211>51<212>dna<213>sy254-ri<400>34acgactcaccagggtccgaggtattcaaaagcagcttccaatctcagtttc51<210>35<211>30<212>dna<213>sy254-probe<400>35ccatctatggaaaagaactgaacgtcagag30<210>36<211>18<212>dna<213>fs<400>36gcagtggtatcaacgcag18<210>37<211>19<212>dna<213>rs<400>37ccagggtccgaggtattca19当前第1页12