一种可诱导凋亡的携带检测标签的CD20嵌合抗原受体T淋巴细胞及其应用的制作方法

文档序号：16501870发布日期：2019-01-05 08:48阅读：369来源：国知局

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于cd20的可诱导凋亡并简便检测的嵌合抗原受体及其应用，具体地涉及对特异性表达cd20的b细胞来源的肿瘤的可诱导凋亡并可检测嵌合抗原受体表达的转基因淋巴细胞的制备及治疗应用。

背景技术：

嵌合抗原受体是由抗原识别结构域(配体或单链抗体)和胞内的一系列信号结构域依次连接而成，具体包括抗原特异性的受体(如单链抗体scfv)，间隔序列(spacer)，跨膜序列(tmdomain)和胞内共刺激信号分子。在体内car修饰的t淋巴细胞能够通过其单链抗体特异的识别相关肿瘤表面抗原，然后通过胞内共刺激信号分子将识别的信号传递到细胞内，激活细胞的杀伤性，靶向杀伤肿瘤细胞。由于car-t细胞在血液肿瘤的免疫治疗中起到了重要作用，以cd19-car-t细胞治疗淋巴细胞肿瘤最为突出，2017年美国fda已经批准上市。

淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于t淋巴细胞的过继免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意。近年来，car-t淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略。根据ctl对靶细胞的识别特异性依赖于t淋巴细胞受体(tcellreceptor,tcr)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的单链抗体scfv(single-chainfv，scfv)和t淋巴细胞受体的cd3ζ或fcεriγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)，并将其通过如慢病毒感染等方式表达在t淋巴细胞表面。这种car-t淋巴细胞能够以主要相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)非限制性方式选择性的将t淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。表达嵌合性抗原受体的t淋巴细胞通过scfv与靶细胞抗原结合后，胞内信号转导区将信号传入t细胞，从而激活t细胞，分泌穿孔素、颗粒酶及细胞因子等而发挥杀伤作用。

嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区(intracellularsignalregion，isr)。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scfv，跨膜区采用cd8、cd28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(itam)cd3ζ或fcεriγ，及共刺激信号分子cd28、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)等分子的胞内信号区。目前car技术已经发展到四代，几代car-t的区别在于细胞内信号转到区连入了不同的增强共刺激信号。第一代car只含有一个胞内的信号分子为cd3ζ或fcεriγ。第二代car增加了一个协同共刺激因子；第三代car含有两个协同共刺激因子；而第四代car引入细胞因子、自杀基因等。尽管一些临床前实验证明第3代car在t细胞的扩增倍数、体内存活时间以及分泌细胞因子的能力都较第2代有优势，但由于第3代car技术用于临床仍然存在一定的风险，目前用于临床试验的主要是第2代car技术。

cd20单克隆抗体疗法在治疗b细胞淋巴瘤中已取得了令人满意的效果，但是很多患者最终会产生耐药性。cd20分子是一种b细胞分化抗原，仅表达于前b细胞和成熟b细胞表面，表达于95％以上的b细胞性淋巴瘤，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达。重要的是，cd20分子在膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不会因为与抗体的结合而发生抗原调变，故成为治疗b细胞淋巴瘤的理想靶点。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种编码表达于t淋巴细胞表面的cd20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，该核酸表达的嵌合抗原受体蛋白使得表达该受体的淋巴细胞针对高表达cd20的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。

本发明的第二个目的在于提供包括上述编码表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸载体。

本发明的第三个目的在于提供一种包含上述载体的病毒。

本发明的第四个目的在于提供一种可检测的cd20特异性嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞。

本发明的第五个目的在于提供一种可诱导凋亡的car-t淋巴细胞的应用。为了实现上述目的，本发明提供一种编码表达于t淋巴细胞表面的cd20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，该核酸序列如seqidno.8所示。

其中，该核酸编码表达的cd20特异性嵌合抗原受体包含顺序连接的胞外结合区，cd8α铰链区、跨膜区和cd28、cd137、cd3ζ胞内信号区以及可用于检测的v5-tag，其中所述胞外结合区包含特异性识别cd20的单链抗体scfv(cd20)。

其中，该核酸编码表达的cd20特异性嵌合抗原受体包含scfv

(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ及其组合，该组合优选为：

scfv(cd20)-cd8α-cd137-cd3ζ或scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd3ζ。

其中，该标签融合蛋白选自v5-tag、6xhis-tag、s-tag、flag-tag、myc-tag或ha-tag。

其中，该核酸编码表达的标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因通过ires序列连接。

其中，该核酸编码表达的可诱导凋亡的基因为fkbp12(f36v)-caspase9。

本发明还提供一种核酸载体，该核酸载体为包含有上述核酸的真核表达载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或转座子。

本发明还提供一种病毒，该病毒为包含有上述核酸载体的病毒。

其中，该病毒为包含scfv

(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ-v5-ires-fkbp12(f36v)-caspase9序列的重组载体的腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒。

本发明还提供一种可检测的cd20特异性嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞，包含有上述的核酸，或上述的核酸载体，或上述的病毒。

本发明还提供一种如上述t淋巴细胞作为制备car-t免疫治疗的药物的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种编码表达于t淋巴细胞表面的cd20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸、核酸载体、病毒及可检测的cd20特异性嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞，通过将第二代car结构改进为第三代car结构，使得杀伤效果更强；选用跟靶抗原的亲和力更高的单链抗体；增加了可用于分析、检测car-t细胞的标签；增加了可诱导凋亡的安全开关序列，使car-t免疫治疗更加安全。

附图说明

图1为本发明所述的嵌合抗原受体慢病毒表达质粒的结构示意图

图2a至图2d为流式细胞术对分离培养的nkt细胞表型分析结果。

图3为流式细胞术检测嵌合抗原受体慢病毒car-cd20-8213v5-icasp9对nkt细胞的感染效率。

图4a至图4d为流式细胞术对嵌合抗原受体car-cd20-8213v5-icasp9修饰的nkt细胞表型鉴定结果。

图5为rt-pcr检测嵌合抗原受体基因car-cd20-8213v5-icasp9在nkt细胞中的表达。

图6为westernblot检测嵌合抗原受体car-cd20-8213v5-icasp9在nkt细胞内的表达。

图7为本发明所述的car-cd20-8213v5-icasp9-nkt细胞对人肿瘤细胞的杀伤作用的细胞毒性分析。

图8为流式细胞术检测ap1903对car-cd20-8213v5-icasp9修饰的细胞的诱导凋亡作用。

图9为pwpt-gfp-v5的质粒图谱。

图10为pwpr-gfp的质粒图谱。

具体实施方式

本发明的第一方面涉及编码一种表达于淋巴细胞表面的cd20嵌合抗原受体蛋白的核酸，其表达的嵌合抗原受体蛋白使得表达该受体的淋巴细胞针对高表达cd20的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。所述cd20嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别cd20胞外表位的单链抗体scfv(cd20)。上述嵌合抗原受体蛋白的胞外结合区通过cd8铰链区与cd8或者cd28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。

单链抗体scfv(cd20)可以根据cd20单克隆抗体的序列通过基因工程方法或化学合成方法制备。本发明中使用的术语“单链抗体(scfv)片段”指的是通过如下定义的抗体片段，是包含通过连接肽(linker)连接的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。本发明中scfv包括vh(重链可变区)-linker(连接肽)-vl(轻链可变区)和vl-linker-vh两种形式，linker有多种形式，一般为10-25个氨基酸，目前最常用的linker是5个丝氨酸重复三次排列组合(gly4er)3的15肽序列。单链抗体优选是由一条核苷酸编码的一条氨基酸序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法做进一步修饰均落于本发明权限之内。根据一种抗体的氨基酸序列在其dna序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，sambrook，分子克隆：实验手册，coldspringharborlaboratory(1989)n.y.所指的修饰优选在核苷酸水平上进行。上述单链抗体还可以包括其衍生物。本发明中“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如biacore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与cd20抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；malmborg，免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如wo89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，ep-a10239400和wo90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，wo91/10741，wo94/02602和wo96/33735中所描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法所产生的抗体的衍生物。

本发明的术语“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术在确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。

本发明的嵌合抗原受体的跨膜区选自cd8蛋白的跨膜区。cd8是t淋巴细胞表面的天然标记物。人cd8蛋白是个异二聚体，由α、β或者γ、δ两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自cd8α跨膜区。此外cd8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，cd8α跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗原受体car的靶点识别结构域scfv和胞内信号区连接起来。

本发明细胞内信号转导区主要为免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs,itam，通常为cd3ζ或fcεriγ)以及共刺激分子cd28信号传导结构域和cd137信号传导结构域的组合，同时融合表达用于蛋白表达和car-t细胞检测的标签蛋白。本领域技术人员可以根据需要进行调整，cd28、cd137、cd3ζ信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本发明优选的是cd28-cd137-cd3ζ的顺序组合。

标签蛋白包含v5-tag、6xhis-tag、s-tag、flag-tag、myc-tag、ha-tag等多种，本发明优选但不限于v5-tag。v5标签是从猿猴病毒5(simianvirus5，sv5)p和v蛋白中分离得到的由14个氨基酸残基(gkpipnpllgldst)组成的序列。v5标签抗体经常被用于跨膜型蛋白和分泌型蛋白的融合表达。abbkine的v5标签抗体可特异性识别位于重组蛋白c端或n端的v5标签。嵌合抗原受体和v5标签蛋白重组，可利用流式细胞仪对感染的t细胞和回输到患者体内的cart细胞进行实时监测。

如何保证发挥car-t细胞生物有效性的同时，减少其潜在危险性，是实现基因及细胞治疗恶性肿瘤需要解决的问题之一。为了减少意外的风险，我们在第三代car的基础上增加了可诱导凋亡的元件，可在治疗出现意外情况以及治疗结束后杀灭car-t细胞。本发明将自杀基因系统和car共同修饰t细胞，以增加治疗的安全性。化学诱导二聚化/半胱天冬酶9(chemicalinduceddimmer/caspases9，cid/casp9)是通过化学诱导二聚化激活凋亡相关基因caspase-9，启动car-t细胞凋亡。他克莫司结合蛋白-12(fk506bindingprotein-12，fkbp-12)近年常用于诱导二聚化，将其与caspase-9连接，药物ap1903或者ap20187可以使fkbp12二聚化而激活后者，诱导转基因的细胞凋亡，从而清除car-t细胞，具有本底低、特异性强、诱导效率高等特点。

本发明所述的化学诱导二聚化/半胱天冬酶9通过内部核糖体进入位点序列(internalribozymeentrysite,ires)连接。ires序列是来自病毒的一段序列，可以作为内部核糖体结合位点，从而起始ires序列下游基因的翻译。因而利用ires序列，可以实现在哺乳动物细胞中的两个蛋白基因的串联表达。由于ires和mrna的5‘cap对核糖体翻译起始复合物的结合力不同，ires后面的基因翻译蛋白的水平有可能与ires前面的基因蛋白水平不一致，约为前一个基因表达水平的20-50％。由于代谢压力的原因，细胞需要大量合成car基因，而与细胞免疫功能无关的cid/casp9对细胞的生长有所影响，需尽量较少的合成，所以ires序列是相比于t2a、p2a序列更适合于在car-t细胞中表达cid/casp9的连接方式，这也是本发明采用ires序列而不用t2a、p2a序列的原因。

本发明的核酸所编码的cd20嵌合抗原受体蛋白可以选自但不限于按如下形式顺序连接的嵌合抗原受体和v5标签融合蛋白以及化学诱导二聚化/半胱天冬酶9蛋白：

scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ-v5-ires-fkbp12(f36v)-caspase9。

本发明的第二方面包括上述编码表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸载体，包括真核表达质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒、腺相关病毒载体以及转座子载体等。在一个实施方案中，本发明使用的载体属于第二代自灭活慢病毒系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白gag/pol、编码rev蛋白的包装质粒pspax2；编码vsv-g蛋白的包膜质粒pmd2.g；穿梭质粒pwpt-gfp-v5及pwpr-gfp均基于pwpt-gfp质粒改造而来。pwpt-gfp-v5及pwpr-gfp的质粒图谱见图9和图10，其中，pwpt-gfp-v5是在pwpt-gfp的gfp序列尾部插入v5标签蛋白基因，同时剔除了gfp序列和sali酶切位点之间的无关序列，使得绿色荧光蛋白和v5标签蛋白融合表达。pwpr-gfp含有用于分泌蛋白表达的大鼠生长激素信号肽序列rsp，是通过在pwpt-gfp的bamhi酶切位点插入rsp序列，rsp序列3'末端保留bamhi酶切位点，从而改造得到pwpr-gfp。pwpr-gfp用于引入目的核苷酸序列，即编码car的核苷酸序列。空载体pwpt-gfp-v5(其本身为后续试验的mock)和pwpr-gfp中基因的表达由延长因子-1α(elongationfactor-1α，ef-1α)启动子调控。

本发明的第三方面包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他转导t淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。

本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述

scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ-v5-ires-fkbp12(f36v)-caspase9序列的重组载体的慢病毒。

本发明的第四方面包括一种转基因t淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括脂质体、磷酸钙、阳离子聚合物如pei等转染以及电穿孔和转座子法。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的t淋巴细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养t淋巴细胞到达临床数量的时间等优点。在该转基因t淋巴中，转导的核酸通过转录、翻译表达在其细胞膜表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒试验证明，本发明的细胞膜表面表达嵌合抗原受体的转基因t淋巴细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因自体cik、ctl、nk、γδt、nkt等淋巴细胞，可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。

本发明的核酸序列可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述核苷酸的变异体。其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明的car修饰的t细胞，包含免疫治疗临床上所用的lak，cik，nkt，γδt等t细胞，本发明优选的但不限于nkt细胞。临床上将tcr^-、mig^-、cd56⁺、cd16⁺、cd3⁺淋巴样细胞鉴定为nkt细胞。nkt细胞既表达t细胞表面标志，又表达nk细胞的表面标志，nkt细胞能够识别和杀伤突变的肿瘤细胞和病毒感染细胞，而对正常自身组织细胞无细胞毒作用。nkt细胞通过自身表面的cd16与特异性抗体的fc段结合，发挥adcc(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)作用。但是，在抗体介导的adcc作用过程中，抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，nkt细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。car修饰的nkt细胞经过多年的临床试验，在肿瘤治疗尤其是血液肿瘤方面取得了明确的疗效，类似的还有car修饰的γδt等淋巴细胞。下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能理解为用于限制本发明的范围。本领域技术人员可以对本发明做各种修改或改动比如更换核酸序列的密码子，修改蛋白序列的氨基酸，变更协共激信号分子的组合方式，变更转导的免疫细胞种类等，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件如sambrook等，“分子克隆：实验手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)”中所述的条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则按照说明书所建议的条件进行。

材料：

1.全基因序列由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，引物由北京天一辉远生物技术有限公司合成。

2.包装质粒pspax2、包膜质粒pmd2.g、空载体质粒pwpt-gfp购自addgene公司，空载体质粒pwpt-gfp-v5，pwpr-gfp由本公司改构并保存，hek293t细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

3.琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、质粒小提试剂盒购买自北京康为世纪生物科技有限公司。4.t4dna连接酶、限制性内切酶bamhi、sali、胰蛋白酶、gt-t551培养基、总rna提取试剂rnaisoreagent购自takara公司。

5.trans1-t1phageresistant化学感受态细胞购买自北京全式金生物技术有限公司。

6.高糖dmem培养基、胎牛血清、lipofectamine^tm2000transfectionreagent购自invitrogen公司。

7.一抗(小鼠抗v5单克隆抗体)购自abbkine公司、二抗(fitc标记的兔抗小鼠多克隆抗体，hrp标记的兔抗小鼠多克隆抗体)购自北京全式金生物技术有限公司。小鼠抗人cd3单克隆抗体购自peprotech公司。

8.鱼精蛋白、重组人蛋白干扰素-γ和重组人白介素2购自北京海诚远宏科技有限公司；il-2购自sigma-aldrich公司。

9.逆转录试剂盒revertaid^tmfirststrandcdnasynthesiskit购自fermentas公司。

10.膜联蛋白v-rpe试剂盒、化学发光试剂盒购自上海博鑫生物工程公司。

11.ap1903购自adooqbioscience公司。

实施例1慢病毒质粒pwptr-scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ-v5-ires-fkbp12(f36v)-caspase9的构建

全基因序列scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ-v5-ires-fkbp12(f36v)-caspase9由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，克隆在puc57质粒中，命名为puc57-car20-v5-icasp9，两端分别含有bamhi和sali酶切位点。其中包含顺序连接的第三代car-cd20融合基因序列(scfv(cd20)和胞内信号转导功能区序列的融合基因序列，scfv(cd20)包含重链可变区vh，linker(gly4er)3序列，轻链可变区vl，其核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示，氨基酸序列如序列表中seqidno.2所示，胞内信号转导功能区序列包括cd8α的hinge区和跨膜区序列、cd28胞内信号结构域、cd137胞内信号结构域序列、cd3ζ胞内信号结构域序列、v5-tag序列的融合基因，其核苷酸序列如序列表中seqidno.3所示，氨基酸序列如序列表中seqidno.4所示)；ires序列(核苷酸序列如序列表中seqidno.5所示)；本实例中启动car-t细胞凋亡的cid/casp9结构为fkbp12(f36v)-caspase9序列即icasp9序列(核苷酸序列如序列表中seqidno.6所示，氨基酸序列如序列表中seqidno.7所示)，其中fkbp12(f36v)指fkbp-12蛋白在fkbp结构域在第36个氨基酸残基位点上苯丙氨酸替代了缬氨酸。pwpr-gfp质粒和puc57-car20-icasp9分别经限制性内切酶bamhi/sali双酶切，酶切产物pwpr-gfp-载体片段和car20-v5--icasp9片段经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收，通过t4dna连接酶连接，连接产物转化trans1-t1phageresistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后质粒小提试剂盒提取质粒，bamhi/sali双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒送公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒

pwptr-scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ-v5-ires-fkbp12(f36v)-caspase9命名为car-cd20-8213v5-icasp9。全基因

scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ-v5-ires-fkbp12-caspase9序列如核苷酸序列如序列表中seqidno.8所示，其编码表达两个蛋白，分别是car-cd20和icasp9，氨基酸序列分别如序列表中seqidno.9和seqidno.7所示。以上构建的car载体结构示意图如图1所示，其中包括ef-1α启动子、信号肽、抗cd20单链抗体、cd8的hinge区和跨膜区及胞内信号结构域和v5标签蛋白以及ires-fkbp12-caspase9等基因的核苷酸序列。

实施例2嵌合抗原受体慢病毒的包装和浓缩

用质粒小提试剂盒分别提取空载体质粒pwpt-gfp-v5和嵌合抗原受体慢病毒表达质粒car-cd20-8213v5-icasp9以及辅助质粒pspax2、pmd2.g，分光光度计测定质粒浓度。在10cm培养皿中接种293t细胞，当细胞达到60-80％满时，表达质粒和两种辅助质粒分别以4:2:1的质量比用lipofectamine^tm2000transfectionreagent转染试剂共转染293t包装细胞。分别在转染48h、72h时收集病毒上清于ep管中，4℃，2000g离心10min，转移上清至新ep管中，用4.5μm滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5×peg8000-nacl按照4:1的体积比混匀，4℃静置2h，然后4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀用4℃预冷的无菌pbs溶解，即得病毒浓缩液，按照200μl/管进行分装，-80℃保存备用。

实施例3流式细胞术测定嵌合抗原受体慢病毒慢病毒滴度

第一天，以1×10⁶/ml接种293t细胞于48孔培养板，200μl/孔，37℃，5％co2孵箱进行培养，培养液含有10％胎牛血清的dmem。第二天，每孔弃去100μl培养上清，补加100μl新鲜培养液，并含终浓度为8μg/ml的polybrene。加10μl/孔的病毒浓缩液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃，5％co2孵箱进行培养.感染48h后，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用0.01％甲醛(pbs配制)固定10-15min，0.1％saponin(皂素)冰浴15min透膜；用适量的缓冲液重悬细胞为2×10⁷个/ml，加入50μl的稀释后的一抗(小鼠抗v5单克隆抗体)，避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20min。加入缓冲液2ml，4℃下300-400g离心5min，并弃去上清，重复洗涤过程3次，加入50-100ul稀释好的荧光标记二抗(用缓冲液稀释成合适的浓度)后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-30min，洗涤细胞两次，之后500ul缓冲液重悬细胞，用流式细胞术检测并计算该病毒的感染效率。以阳性率为5-20％的细胞数为宜，计算滴度(u/ml)＝阳性率×稀释倍数×10⁸。用lipofectamine^tm2000transfectionreagent感染293t包装的该嵌合抗原受体病毒浓缩液的滴度均为5-10×10⁷u/ml的水平。

实施例4nkt细胞的制备

(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(pbmcs)。

(2)pbmcs洗三次后，采用含有0.6％常规血清的nkt细胞培养基gt-t551调整细胞终浓度为2×10⁶cell/ml；将细胞接种于预先经过终浓度为5μg/mlcd3单克隆抗体及终浓度为10μg/ml的retronectin包被的75厘米细胞培养瓶。培养基里加入终浓度为200u/ml的重组人蛋白干扰素-γ和200u/ml的重组人白介素2，37℃，饱和湿度、5％co2培养箱培养。

(3)第四天，向瓶中补加100ml含有0.6％常规血清的nkt细胞培养基，加入终浓度为200u/ml的il-2。于37℃，5％co2培养箱培养，得到nkt细胞，流式细胞术对nkt细胞表型进行分析。结果见图2a至图2d，其中cd3：98.74％；cd3cd4:26.05％；cd3cd8:68.68％；cd3cd56:4.83％；cd8cd56:3.35％。

实施例5流式细胞术检测嵌合抗原受体在nkt细胞的感染效率

取实施例2在25cm²培养瓶的培养的1×10⁷个nkt细胞，弃掉旧的培养液，加入2ml新鲜gt-t551培养液，200μlcar-cd20-8213v5-icasp9病毒液，2μl1×10⁶单位鱼精蛋白，终浓度为200u/mlil-2，置于37℃，5％co2孵箱中感染12h后，弃培养液，同时设置对照组nkt细胞，用于计算该病毒的感染效率。将感染后的细胞转至未包被的75cm²培养瓶中，加入20ml的培养基，于37℃，5％co2孵箱继续进行培养。分别收集1×10⁶感染car-cd20-8213v5-icasp9的nkt细胞及未感染病毒对照组细胞(nkt)，离心细胞液并除去上清，用0.01％甲醛(pbs配制)固定10-15min，0.1％saponin(皂素)冰浴15min透膜；用适量的缓冲液重悬细胞为2×10⁷个/ml，加入50μl的稀释后的一抗(小鼠抗v5单克隆抗体)，避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20min。加入缓冲液2ml，4℃下300-400g离心5min，并弃去上清，重复洗涤过程3次，加入50-100μl稀释好的荧光标记二抗(用缓冲液稀释成合适的浓度)后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-30min，洗涤细胞两次，之后500μl缓冲液重悬细胞，用流式细胞术检测并计算该病毒的感染效率，该嵌合抗原受体病毒浓缩液对nkt细胞的感染效率，结果如图3所示，感染效率为33.63％。

实施例6扩增嵌合抗原受体慢病毒感染nkt细胞成富含cd3cd56双阳性的car20-nkt细胞群

取实施例4在25cm²培养瓶的培养的1×10⁷nkt细胞，弃掉旧的培养液，加入2ml新鲜gt-t551培养液，200μl病毒液，2μl1×10^-6单位鱼精蛋白，终浓度为200u/mlil-2，置于37℃，5％co2孵箱中感染12h后，弃培养液，将感染后的细胞转至未包被的75cm²培养瓶中，加入20ml的培养基，于37℃，5％co2孵箱继续进行培养。待细胞量占培养瓶80-90％时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加入终浓度为200u/mlil-2的gt-t551培养液扩增培养，待细胞扩增到1×10⁹个左右后，采用流式细胞仪对感染的细胞群体进行鉴定，细胞表型一般达到：cd3阳性细胞比例＞90％；cd3cd8阳性细胞比例>70％；cd3cd56双阳性细胞比例>5％，结果见图4a至图4d，cd3：96.8％；cd3cd4：20.91％；cd3cd8：70.50％；cd3cd56：6.23％；cd8cd56：5.08％。

实施例7rt-pcr鉴定car-cd20-8213v5-icasp9在nkt细胞中的基因表达

分别收集1×10⁷个感染car-cd20-8213v5-icasp9的nkt细胞、感染car-cd20-813的nkt细胞以及未感染病毒的对照组细胞(nkt)，用总rna提取试剂盒rnaisoreagent提取细胞的总rna，去基因组，用逆转录试剂盒revertaid^tmfirststrandcdnasynthesiskit逆转录得nkt细胞cdna，-20℃保存备用。用引物人gapdh引物(seqidno.10：5'

-agaaggctggggctcatttg-3'，seqidno.11：5'

-aggggccatccacagtcttc-3')和检测引物(seqidno.12：5'

-ccagaagaagaagaaggaggatgt-3'，seqidno.13：5'

-atgtgaagggcgtcgtaggt-3')做pcr鉴定，pcr扩增条件为预变性：94℃，30s；退火：55℃，30s；延伸：72℃，30s；gapdh进行26个循环，目的基因做31个循环，然后总延伸72℃，10min。目的基因条带理论大小为347bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。检测结果如图5所示，结果表明，嵌合抗原受体基因可在nkt细胞内表达。

实施例8westernblot检测嵌合抗原受体car-cd20-8213v5-icasp9在nkt细胞内的表达

分别收集1×10⁷个感染car-cd20-8213v5-icasp9慢病毒的nkt细胞(car-cd20-8213v5-icasp9-nkt)及感染实施例2提取的空载体pwpt-gfp-v5病毒的nkt细胞(pwpt-gfp-v5-nkt)，去培养液后用温和的pbs冲洗2-3遍，加入适量的冰预冷的裂解液，超声裂解，取少量上清bca法进行定量，取30μg蛋白经10％sds-page进行分离后，转移至pvdf膜。5％脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入一抗(小鼠抗v5单克隆抗体)4℃温和震荡过夜，tbst洗涤3次，每次10min，特性hrp标记的二抗温育1h，tbst洗涤3次后，经化学发光试剂盒检测信号强度。以β-actin作为内参，进行半定量分析。结果见图6，可见嵌合抗原受体蛋白在nkt细胞中高表达。

实施例9感染car-cd20-8213v5-icasp9的nkt细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的细胞毒性分析

体外毒性实验使用的靶细胞为3种淋巴细胞肿瘤细胞系，其中k562为cd20阴性细胞系，molt-4和reji细胞为cd20阳性细胞系。效应细胞分别为经体外培养12天的nkt细胞、第二代car-cd20-cd8α-cd137-cd3ζ-v5慢病毒感染的nkt细胞(car-cd20-813v5-nkt)以及car-cd20-8213v5-icasp9慢病毒感染的nkt细胞(car-cd20-8213v5-icasp9-nkt)。分别接种于96孔板，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)进行染色，与k562，molt-4和reji细胞以1:1，5:1，10:1，20:1比率进行共培养，经过24小时的共培养后，将细胞用膜联蛋白v-rpe试剂盒染色。流式细胞术对细胞凋亡进行检测，细胞死亡的量根据下面的公式计算：死亡率＝(对照-样品)/对照×100％)，对照为未加car-nkt的肿瘤细胞。图7为样本为加入效靶比(杀伤细胞：靶细胞)为20:1的时效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。结果显示本发明的car-cd20-8213v5-icasp9-nkt对高表达cd20的肿瘤细胞具有特异杀伤活性，而本发明的car-cd20-8213v5-icasp9-nkt比第二代car-cd20-813v5-nkt具有更高的杀伤效率，对于molt-4细胞，car-cd20-8213v5-icasp9-nkt的杀伤效率为68％，比第二代car-cd20-813v5-nkt杀伤效率高70％，对于reji细胞，car-cd20-8213v5-icasp9-nkt的杀伤效率为73％，比第二代car-cd20-813v5-nkt杀伤效率高92％。

实施例10流式细胞术检测药物对car-cd20-icasp9-293t细胞的诱导凋亡

取对数生长细胞状态良好的化293t细胞，按照感染复数moi＝10感染car-cd20-8213v5-icasp9慢病毒，4天后消化成单细胞，按照实施例5的方法，流式细胞术检测嵌合抗原受体对293t细胞的感染效率，结果为99.8％。用含10％fbs的高糖dmem培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml,分别接种于2个12孔板中，每孔加入10nm的ap1903，37℃，5％co2孵箱继续进行培养，分别于0h，1h，3h，6h，12h收集各组细胞，用4℃预冷的pbs洗两次，用pbs重悬细胞并计数，将细胞用膜联蛋白v-rpe试剂盒染色，用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况以验证car-cd20-8213v5-icasp9中cid/casp9的有效性。如图8所示，本发明的慢病毒载体car-cd20-8213v5-icasp9中cid/casp9对细胞凋亡有时间依赖性，能在较短时间内使细胞凋亡，在细胞治疗过程中可根据需要有效去除car-t细胞，减少意外副作用对机体的损伤(横坐标表示annexinv，横坐标表示细胞数)。

在上述实施例中使用的cd20特异性嵌合抗原受体为scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ，也可以为scfv(cd20)-cd8α-cd137-cd3ζ或scfv(cd20)-cd8α-cd28-cd3ζ。为了确保免疫治疗的安全性，在本发明中增加了可诱导凋亡的结构，增加了car-t细胞的可控性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>河北璋达生物科技有限公司

<120>一种可诱导凋亡的携带检测标签的cd20嵌合抗原受体t淋巴细胞及其应用

<130>demo

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