抗CD47/CD20双特异性抗体及其用途的制作方法

本发明属于肿瘤免疫学领域，具体地，涉及抗cd47/cd20双特异性抗体及其用途。
背景技术：
：白细胞分化抗原47(cd47)又称为整合素相关蛋白(integrinassociatedprotein，iap)，是免疫球蛋白超家族成员。作为一种约50kd的高度糖基化跨膜蛋白，cd47分子由胞外n端免疫球蛋白可变结构域和高度疏水延伸的5个跨膜片段及1个短的选择性拼接胞质区组成。cd47分布广泛，表达于不同组织细胞，诸如巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、肥大细胞及造血干细胞等髓系细胞表面，尤其在造干细胞中高表达。cd47是个多能分子，其主要功能包括①与cd47配体信号调节蛋白(signal-regulatoryprotein，sirp)α结合并与整合蛋白相互作用，调节细胞间通讯。cd47与巨噬细胞表面的sirpα结合，激活酪氨酸磷酸化酶，抑制肌球蛋白在巨噬细胞突触膜下装配位点的聚集，作为“别吃我”信号。cd47缺失会导致老龄或受损细胞被吞噬。②与凝血酶反应蛋白-1结合，参与细胞与胞外基质的相互作用。③与凋亡、增殖、黏附、迁移等细胞学过程密切相关，在免疫及心血管反应中扮演关键角色，是心血管疾病治疗的新靶标。④与肿瘤免疫逃逸相关，对肿瘤细胞的微环境有重要影响。cd47目前已被发现在多种肿瘤类型中异常表达，包括急性骨髓白血病(aml)、慢性骨髓白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍金性淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌和其他实体瘤。虽然在使用cd47的阻断抗体或者sirpa融合蛋白阻断cd47-sirpa信号通路的方法诱导巨噬细胞吞噬作用展示出该方法具有一定的效果，然而这样的策略却无法满足肿瘤靶向性的需要。正常组织表达的cd47会对治疗性的cd47抗体产生“抗原沉淀”(“antigensink”)，进而影响到治疗性cd47抗体到达体内的肿瘤部位。白细胞分化抗原20(cd20)b淋巴细胞上的跨膜蛋白质，以非糖基化形式存在，是一种分子量为33-37kd的磷酸化蛋白质分子，位于b淋巴细胞表面，是b淋巴细胞表面分化抗原。由于其在b细胞来源的淋巴瘤、白血病等的肿瘤细胞表达，以及和涉及免疫疾病和炎症疾病的b细胞中表达，因此成为淋巴瘤、白血病和某些自体免疫等疾病治疗的目标靶点。目前上市在售的抗体药物多为单克隆抗体，治疗性单克隆抗体已被用于治疗癌症、自身免疫病、炎症和其他疾病，多数是针对一个靶标的特异性。然而，病人接受单克隆抗体治疗可能产生耐药性或无应答。并且有些疾病在体内的影响因素是多方面的，包括不同的信号通路、不同的细胞因子和受体的调节机制等，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。因此，需要通过组合不同的药物，或是使用多特异性抗体的多重靶向策略来实现。然而，双抗的开发一直受到技术限制，最大的瓶颈在于分子结构的稳定性。双抗分子中有两重链和两个轻链，在开发过程中极其容易出现错配。不仅如此，在解决链段错配问题的同时，还要满足分子的成药性以及大规模生产能力。这三个因素好比三角架的三个支点，需要满足全部条件才能实现产品的产业化。但很多技术都只能解决一个或者两个问题，这使得双特异性抗体的产品开发一直面临技术瓶颈。因此，本领域迫切需要开发一种结构稳定、特异性佳、易于制备，并且可以减少正常组织对治疗性cd47抗体的抗原沉淀效应的抗肿瘤双抗。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种结构稳定、特异性佳、易于制备，并且可以减少正常组织对治疗性cd47抗体的抗原沉淀效应的抗肿瘤双抗。本发明第一方面提供了一种双功能抗体，所述双功能抗体包括：(a)抗cd20的抗体；和(b)与所述抗cd20的抗体相连接的单价形式的抗cd47的纳米抗体。在另一优选例中，所述抗cd20的抗体和所述抗cd47的纳米抗体通过连接肽相连；优选地，所述连接肽包括抗体恒定区序列。在另一优选例中，所述抗cd47的纳米抗体连接到所述抗cd20的抗体的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、或其组合。在另一优选例中，所述抗cd47的纳米抗体连接到所述抗cd20的抗体的重链可变区、和/或轻链可变区的起始端。在另一优选例中，所述抗cd47的纳米抗体连接到所述抗cd20的抗体的重链恒定区的末端。在另一优选例中，所述抗cd47的纳米抗体包括抗cd47的人源化的纳米抗体。在另一优选例中，所述抗cd47的纳米抗体的数量为1-6，较佳地，2-6。在另一优选例中，所述双功能抗体为同源二聚体。在另一优选例中，所述双功能抗体从n端到c端具有式i所示的结构：其中，d各自独立地为无或抗cd47的纳米抗体，且至少一个d为抗cd47的纳米抗体；l1、l2、l3各自独立地为健或接头元件；vl代表抗cd20抗体的轻链可变区；cl代表抗cd20抗体的轻链恒定区；vh代表抗cd20抗体的重链可变区；ch代表抗cd20抗体的重链恒定区；“～”代表二硫键；“-”代表肽键；其中，所述双功能抗体具有同时结合cd20以及结合cd47的活性。在另一优选例中，所述纳米抗体的互补决定区(cdr)由如seqidno.:1所示的cdr1、如seqidno.:2所示的cdr2和如seqidno.:3所示的cdr3构成。在另一优选例中，所述纳米抗体的cdr1、cdr2和cdr3由框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。在另一优选例中，所述fr1、fr2、fr3、fr4分别如seqidno.:4、5、6、7所示。在另一优选例中，所述接头元件可以相同或不相同。在另一优选例中，所述l1、l2、l3各自独立地选自gs、ggggs(seqidno.:8)、ggggsgggs(seqidno.:9)、ggggsggggsggggsggggs(seqidno.:10)。在另一优选例中，所述抗cd20抗体包括利妥昔单抗。在另一优选例中，所述抗cd20抗体的l链具有如seqidno.:11所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述抗cd20抗体的h链具有如seqidno.:12所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述双功能抗体的l链选自如seqidno.:11或seqidno.:13所示的序列。在另一优选例中，所述双功能抗体的h链选自如seqidno.:14或seqidno.:15或seqidno.:16所示的序列。在另一优选例中，所述双功能抗体的l链的编码序列选自如seqidno.:17或seqidno.:19所示的序列。在另一优选例中，所述双功能抗体的h链的编码序列选自如seqidno.:20或seqidno.:21或seqidno.:22所示的序列。在另一优选例中，所述双功能抗体还含有(优选偶联有)可检测标记物、靶向标记、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。在另一优选例中，所述双功能抗体偶联有肿瘤靶向标记偶联物。在另一优选例中，本发明所述双功能抗体还包括所述抗体的活性片段和/或衍生物，所述衍生物含有权利要求1的活性片段和/或所述衍生物保留了70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的抗cd20和/或抗cd47活性。在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少85％的序列同一性。在另一优选例中，所述抗体的衍生物是本发明抗体经过一个或几个氨基酸缺失、插入和/或取代后并保持至少85％的同一性的序列。在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。在另一优选例中，所述的取代为保守性取代。在另一优选例中，所述双功能抗体从n端到c端具有式ii所示的结构：其中，d代表抗cd47的纳米抗体；l3代表无或接头元件；vl代表抗cd20抗体的轻链可变区；cl代表抗cd20抗体的轻链恒定区；vh代表抗cd20抗体的重链可变区；ch代表抗cd20抗体的重链恒定区；“～”代表二硫键；“-”代表肽键；其中，所述双功能抗体具有同时结合cd20以及结合cd47的活性。在另一优选例中，所述纳米抗体的互补决定区(cdr)由如seqidno.:1所示的cdr1、如seqidno.:2所示的cdr2和如seqidno.:3所示的cdr3构成。在另一优选例中，所述纳米抗体的cdr1、cdr2和cdr3由框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。在另一优选例中，所述fr1、fr2、fr3、fr4分别如seqidno.:4、5、6、7所示。本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述的双功能抗体。在另一优选例中，所述多核苷酸具有如seqidno.:17或seqidno.:19所示的编码所述双功能抗体l链的多核苷酸。在另一优选例中，所述多核苷酸具有如seqidno.:20或seqidno.:21或seqidno.:22所示的编码所述双功能抗体h链的多核苷酸。在另一优选例中，所述多核苷酸中，编码l链的多核苷酸和编码h链的多核苷酸的比例为3:2或1:1，优选地为3:2。本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体同时含有本发明第二方面所述多核苷酸中的所有多核苷酸。在另一优选例中，所述载体分别含有本发明第二方面所述多核苷酸中的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体为表达载体。在另一优选例中，所述载体包括质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。本发明第四方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。本发明第五方面提供了一种制备本发明第一方面所述抗体的方法，包括步骤：(i)在合适的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，获得含有本发明第一方面所述抗体的混合物；(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得本发明第一方面所述的抗体。在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白a亲和柱纯化分离获得目标抗体。在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：(i)本发明第一方面所述的双功能抗体；和(ii)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物中还含有抗肿瘤剂。在另一优选例中，所述药物组合物为单元剂型。在另一优选例中，所述抗肿瘤剂包含紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、或派姆单抗。在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂可以与所述双功能抗体单独存在于独立的包装内，或所述抗肿瘤剂可以与所述双功能抗体偶联。在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。在另一优选例中，所述的胃肠外给药剂型包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射。本发明第七方面提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：(a)如本发明第一方面所述的双功能抗体；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。本发明第八方面提供了如本发明第一方面所述双功能抗体或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备治疗肿瘤的药物组合物。在另一优选例中，所述肿瘤包括实体肿瘤、淋巴瘤、和/或白血病。在另一优选例中，所述肿瘤包括恶性肿瘤。在另一优选例中，所述肿瘤或实体肿瘤选自下组：肺癌、胃癌、头颈癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、大肠癌、肾上腺肿瘤、或其组合。本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的抗体、或本发明第六方面所述的药物组合物、或本发明第七方面所述的免疫偶联物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1是本发明所述抗cd47/cd20双特异性抗体的结构示意图。如图所示，如图所示，本发明设计的六种双特异性抗体由cd47纳米抗体与利妥昔单抗组成。图2是流式细胞术检测双特异性抗体对细胞表面cd20的结合能力。结果表明：本发明申请的双特异性抗体a的ec50为9.669ug/ml，双特异性抗体b的ec50为6.327ug/ml，双特异性抗体c的ec50为11.33ug/ml，对照抗体利妥昔的ec50为5.669ug/ml。因此，双特异性抗体b较好地保留了与cd20的结合能力。图3是流式细胞术检测双特异性抗体对raji(cd47阳性/cd20阳性)细胞结合效应的结果。结果表明，本发明申请的双特异性抗体b能够同时与细胞表面的cd47和cd20结合，并且结合能力与对照抗体的结合活性相似，因此证明，双特异性抗体保留了较好的靶标结合活性。图4是流式细胞术检测双特异性抗体b的ic50结果。本发明申请的双特异性抗体b的ic50为2.496ug/ml，cd47纳米抗体nb1902-fc的ic50为0.7673ug/ml。图5是cck8检测双特异性抗体对raji细胞的增殖抑制毒性结果。cck8试剂盒检测结果表明，双特异性抗体b与对照抗体利妥昔对raji细胞具有相似的增殖抑制作用，生物学活性良好。图6是候选双抗b介导的体外巨噬细胞对raji细胞的吞噬。结果表明：双抗b能够有效的促进巨噬细胞对raji细胞的吞噬。图7是候选双抗b对人血红细胞的凝集作用。结果表明：双抗b不会引起人红细胞凝集。图8是候选双抗b在raji肿瘤模型小鼠中的药效检测。结果表明：候选双抗b的肿瘤抑制率达到92％，远远高于利妥昔单抗药效(肿瘤抑制率为57％)，并且优于对照纳米抗体的药效(肿瘤抑制率为81％)，由此能够表明本发明申请的双抗b在该肿瘤抑制过程中发挥了双靶点的协同作用，达到了较为理想的抗肿瘤效果。图9是本发明所述抗cd47/cd20双特异性抗体b的纯度分析图。表达纯化的双特异性抗体的sec检测结果表明，该双抗的纯度达到99.33％。图10是候选双抗b的温度稳定性检测。结果表明：双抗b在室温条件25℃下及高温条件40℃时均表现出良好的稳定性，且浓度高低并不影响抗体稳定性。由此证明该候选双抗b是一株稳定性良好的双抗药物开发候选者。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一种双功能抗体，由抗cd20的抗体和抗cd47纳米抗体串联而成，本发明的双功能抗体属于同源二聚体。体外实验证实，本发明的双功能抗体可同时与cd20及cd47结合，从而发挥对cd20阳性的肿瘤细胞(尤其是恶性肿瘤细胞)的治疗作用，因此，本发明的双功能抗体可以被开发为一种疗效优越的抗肿瘤药物。在此基础上，本发明人完成了本发明。术语通常，“抗体”也称为“免疫球蛋白“其可以是天然或常规的抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接且每条重链与轻链通过二硫键连接。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(vl)和恒定结构域(cl)。重链包括四个结构域，重链可变区(vh)和三个恒定区(ch1、ch2和ch3，统称为ch)。轻链(vl)和重链(vh)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(cl)和重链的恒定区(ch)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与fc受体(fcr)的结合。fv片段是免疫球蛋白fab片段的n-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(cdr)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(fr)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或cdr指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个cdr，分另称为cdr1-l、cdr2-l、cdr3-l和cdr1-h、cdr2-h、cdr3-h。常规抗体抗原结合位点因此包括六个cdr，包含来自每个重链和轻链v区的cdr集合。如本文所用，术语“单域抗体”、“纳米抗体”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β-折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nihpubl.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。如本文所用，术语“框架区”(fr)指插入cdr间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个fr，分别称为fr1-l、fr2-l、fr3-l、fr4-l和fr1-h、fr2-h、fr3-h、fr4-h。相应地，轻链可变结构域可因此称作(fr1-l)-(cdr1-l)-(fr2-l)-(cdr2-l)-(fr3-l)-(cdr3-l)-(fr4-l)且重链可变结构域可因此表示为(fr1-h)-(cdr1-h)-(fr2-h)-(cdr2-h)-(fr3-h)-(cdr3-h)-(fr4-h)。优选地，本发明的fr是人抗体fr或其衍生物，所述人抗体fr的衍生物与天然存在的人抗体fr基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。获知cdr的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区fr1-l、fr2-l、fr3-l、fr4-l和/或fr1-h、fr2-h、fr3-h、fr4-h。如本文所用，术语″人框架区″是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mab”指针对特定抗原的具有单一氨基酸组成的抗体分子，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。单克隆抗体可由b细胞或杂交瘤的单一克隆产生，但还可为重组的，即通过蛋白工程产生。如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”指能够由抗体或抗体样结合蛋白所结合的分子或分子的部分。该术语进一步指能够用于动物以产生能够与该抗原的表位结合的抗体的分子或分子的部分。靶抗原可具有一个或多个表位。对于每种由抗体或由抗体样结合蛋白识别的靶抗原，抗体样结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。本发明所述的接头是指接头l1、l2和l3，其中l1连接本发明双抗的抗cd47纳米抗体与抗cd20抗体的重链可变区vh，l2连接本发明双抗的抗cd47纳米抗体与抗cd20抗体的轻链可变区vl，l3连接本发明双抗的抗cd47纳米抗体与抗cd20抗体的重链恒定区ch。合适的接头实例包括单甘氨酸(gly)、或丝氨酸(ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。。一种优选的接头如下：l1、l2和l3各自独立地选自以下序列：gs、ggggs(seqidno.:8)、ggggsgggs(seqidno.:9)、ggggsggggsggggsggggs(seqidno.:10)。抗cd47抗体白细胞分化抗原47(cd47)又称为整合素相关蛋白(integrinassociatedprotein，iap)，是免疫球蛋白超家族成员。作为一种约50kd的高度糖基化跨膜蛋白，cd47分子由胞外n端免疫球蛋白可变结构域和高度疏水延伸的5个跨膜片段及1个短的选择性拼接胞质区组成。cd47分布广泛，表达于不同组织细胞，诸如巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、肥大细胞及造血干细胞等髓系细胞表面，尤其在造干细胞中高表达。cd47是个多能分子，其主要功能包括①与cd47配体信号调节蛋白(signal-regulatoryprotein，sirp)α结合并与整合蛋白相互作用，调节细胞间通讯。cd47与巨噬细胞表面的sirpα结合，激活酪氨酸磷酸化酶，抑制肌球蛋白在巨噬细胞突触膜下装配位点的聚集，作为“别吃我”信号。cd47缺失会导致老龄或受损细胞被吞噬。②与凝血酶反应蛋白-1结合，参与细胞与胞外基质的相互作用。③与凋亡、增殖、黏附、迁移等细胞学过程密切相关，在免疫及心血管反应中扮演关键角色，是心血管疾病治疗的新靶标。④与肿瘤免疫逃逸相关，对肿瘤细胞的微环境有重要影响。cd47目前已被发现在多种肿瘤类型中异常表达，包括急性骨髓白血病(aml)、慢性骨髓白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍金性淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌和其他实体瘤。本发明抗cd47抗体的序列如专利申请cn201810151752.6中所述，本领域技术人员也可以通过本领域熟知的技术对本发明抗cd47抗体进行修饰或改造，例如添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基，从而进一步增加抗cd47的亲和力或结构稳定性，并通过常规的测定方法获得修饰或改造后的结果。优选地，本发明抗cd47抗体无论连接于抗cd20抗体的哪一端，均由接头连接两个相同的抗cd47抗体从而以二聚体形式出现。本发明抗cd47抗体可由hek293细胞或cho细胞表达获得。本发明抗cd47抗体与哺乳动物cd47结合，优选为人cd47结合。抗cd20抗体白细胞分化抗原20(cd20)b淋巴细胞上的跨膜蛋白质，以非糖基化形式存在，是一种分子量为33-37kd的磷酸化蛋白质分子，位于b淋巴细胞表面，是b淋巴细胞表面分化抗原。其构象包括四个跨膜区(tm1-4)，其中只有tm3与tm4之间的氨基酸序列在细胞膜外侧，tm1和tm2相连，tm2和tm3之间的区域、n端和c端均在细胞质内。cd20没有已知配体，是一种调节钙转运的多体细胞表面复合物的一部分，并且参与调节b细胞的激活和增殖。由于其在b细胞来源的淋巴瘤、白血病等的肿瘤细胞表达，以及和涉及免疫疾病和炎症疾病的b细胞中表达，因此成为淋巴瘤、白血病和某些自体免疫等疾病治疗的目标靶点。可用于本发明的抗cd20抗体由seqidno.:11所示的轻链及seqidno.:12所示的重链组成，其对应的轻链编码序列如seqidno.：17所示，重链编码序列如seqidno.：18所示。双功能抗体(双特异性抗体)如本文所用，术语“双特异性抗体”、“双功能抗体”“本发明抗体”、“本发明双抗”“双抗”、“双功能融合抗体”可互换使用，是指同时结合cd20和cd47的抗cd20/cd47双特异性抗体。在本发明中，所述双功能抗体包括：(a)抗cd20的抗体；和(b)与所述抗cd20的抗体相连接的单价形式的抗cd47的纳米抗体。在一优选实施方式中，本发明的双功能抗体从n端到c端具有式i所示的结构：其中，d各自独立地为无或抗cd47的纳米抗体，且至少一个d为抗cd47的纳米抗体；l1、l2、l3各自独立地为健或接头元件；vl代表抗cd20抗体的轻链可变区；cl代表抗cd20抗体的轻链恒定区；vh代表抗cd20抗体的重链可变区；ch代表抗cd20抗体的重链恒定区；“～”代表二硫键；“-”代表肽键；其中，所述双功能抗体具有同时结合cd20以及结合cd47的活性。在一优选实施方式中，本发明双抗由抗cd20抗体以及抗cd47的纳米抗体融合而成，且具有相互对称的两对肽链，每对肽链含有轻链l链和重链h链，所有的肽链均由二硫键相连，其中任一一对肽链从n端到c端具有式ii中所示的l链和h链结构：其中，d代表抗cd47的纳米抗体；l3代表无或接头元件；vl代表抗cd20抗体的轻链可变区；cl代表抗cd20抗体的轻链恒定区；vh代表抗cd20抗体的重链可变区；ch代表抗cd20抗体的重链恒定区；“～”代表二硫键；“-”代表肽键；其中，所述双功能抗体具有同时结合cd20以及结合cd47的活性。式i或式ii中，一种优选的l链如seqidno.:11或13所示，一种优选地h链如seqidno.:14或15或16所示。编码l链的序列如seqidno.:17或19所示，编码h链的序列如seqidno.:20或21或22所示。(同前)而两条如式i结构式所示的序列通过h链的二硫键相连，从而形成对称的双功能抗体结构。本发明双抗不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6his标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明双抗指具有抗cd47以及抗cd20活性的、包括两条上述式i结构的抗体。该术语还包括具有与本发明双抗相同功能的、包括两条上述式i结构的抗体的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明双抗的活性片段和活性衍生物。该双抗的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“本发明双抗的保守性变异体”指与本发明双抗的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表1编码核酸和表达载体本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的核酸(以及核酸组合)可用于在合适的表达系统产生本发明的重组抗体。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的双抗可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、或任何以上这些物质的组合结合或偶联。用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如il-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.肿瘤治疗剂(例如，顺铂)或任何形式的抗肿瘤药物等。药物组合物本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。本发明的药物组合物可直接用于结合cd47蛋白分子或cd20，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明的主要优点包括：1.本发明双功能抗体可以同时结合cd20以及cd47，且保持双功能抗体与结合靶标的结合构型不变，分子稳定。2.本发明双功能抗体可以在hek293f细胞中表达，仅通过一步亲和层析纯化的纯度可达到99.33％，制备方法简便可行。3.本发明双功能抗体可同时有效结合cd47及cd20双靶点，既有良好的cd47抗体的生物学活性，又完美保留了西妥昔单抗的生物学活性。4.本发明双功能抗体不会引起人血红细胞的凝集作用，具有较好的安全性。5.本发明双功能抗体在小鼠体内表现出显著的抗肿瘤作用，并且比单靶点抗体具有更好的抑瘤效果，表现出双抗的协同作用。由此，本发明申请的抗cd47/cd20双特异性抗体将具有良好的应用前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。如无特别说明，实施例中所用的材料或试剂均为市售产品。实施例1抗cd47/cd20双特异性抗体分子序列设计本发明提供的可同时结合cd47和cd20胞外结构域的双特异性抗体结构如图1所示。cd47纳米抗体序列源自专利201810151752.6；然后将以上cd47纳米抗体与利妥昔单克隆抗体的重链融合，重链由linker((ggggs)4)将利妥昔抗体重链(lala)和cd47纳米抗体连接，氨基酸序列如下(下划线部分为linker序列)：a：氨基酸序列如seqidno.:14所示,所述的cd47纳米抗体通过连接子(ggggs)4连接在利妥昔抗体重链的n端；qvqlqesggglvqpggslrlscaasgyaytsdcmgwfrqtpgkglegvaliytpgnstnyadsvkgrftisqdnskstvylqmnslraedtamyycaarrgacslrlpffywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggsqvqlqqpgaelvkpgasvkmsckasgytftsynmhwvkqtpgrglewigaiypgngdtsynqkfkgkatltadkssstaymqlssltsedsavyycarstyyggdwyfnvwgagttvtvsaastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkb：氨基酸序列如seqidno.:15所示,所述的cd47纳米抗体通过连接子(ggggs)4连接在利妥昔抗体重链的c端；qvqlqqpgaelvkpgasvkmsckasgytftsynmhwvkqtpgrglewigaiypgngdtsynqkfkgkatltadkssstaymqlssltsedsavyycarstyyggdwyfnvwgagttvtvsaastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsggggsggggsqvqlqesggglvqpggslrlscaasgyaytsdcmgwfrqtpgkglegvaliytpgnstnyadsvkgrftisqdnskstvylqmnslraedtamyycaarrgacslrlpffywgqgtlvtvssc：氨基酸序列如seqidno.:16所示,所述的cd47纳米抗体通过连接子(ggggs)4同时连接在利妥昔抗体重链的n端和c端。qvqlqesggglvqpggslrlscaasgyaytsdcmgwfrqtpgkglegvaliytpgnstnyadsvkgrftisqdnskstvylqmnslraedtamyycaarrgacslrlpffywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggsqvqlqqpgaelvkpgasvkmsckasgytftsynmhwvkqtpgrglewigaiypgngdtsynqkfkgkatltadkssstaymqlssltsedsavyycarstyyggdwyfnvwgagttvtvsaastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsggggsggggsqvqlqesggglvqpggslrlscaasgyaytsdcmgwfrqtpgkglegvaliytpgnstnyadsvkgrftisqdnskstvylqmnslraedtamyycaarrgacslrlpffywgqgtlvtvss双特异性抗体分子的轻链为：a：由seqidno.:11所示的利妥昔单抗轻链；qivlsqspailsaspgekvtmtcrasssvsyihwfqqkpgsspkpwiyatsnlasgvpvrfsgsgsgtsysltisrveaedaatyycqqwtsnpptfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecb：由cd47纳米抗体序列和利妥昔单抗轻链序列组成，其氨基酸序列如seqidno.:13所示，所述的cd47纳米抗体通过连接子(ggggs)4连接在利妥昔抗体轻链的n端。qvqlqesggglvqpggslrlscaasgyaytsdcmgwfrqtpgkglegvaliytpgnstnyadsvkgrftisqdnskstvylqmnslraedtamyycaarrgacslrlpffywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggsqivlsqspailsaspgekvtmtcrasssvsyihwfqqkpgsspkpwiyatsnlasgvpvrfsgsgsgtsysltisrveaedaatyycqqwtsnpptfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec将以上重链和轻链的氨基酸序列分别转换成碱基序列，重链碱基序列如seqidno.:20、seqidno.:21和seqidno.:22所示，轻链碱基序列如seqidno.:17和seqidno.:19所示。将以上碱基序列分别合成至表达载体pcdna3.1(+)上。实施例2抗cd47/cd20双特异性抗体表达纯化将合成基因所在的两个质粒共同瞬转至hek293f细胞中，具体方法如下：(1)用omega质粒答题试剂盒分别将重链所在的质粒和轻链所在的质粒分别大量制备，在超净工作台内过滤除菌备用；(2)培养hek293f细胞培养至2.0×106个/ml；(3)将重链质粒和轻链质粒按照2：3的质量比例混合，混合后的质粒与转染试剂pei以1:3的比例混合均匀至转染培养基f17(gibco)中静置20min，之后加入到hek293f细胞中，于37℃，6％co2摇床培养箱中培养6天；(4)离心获得上清，将上清与proteina珠子在室温条件下结合1h；(5)使用ph7.0的磷酸盐缓冲液洗掉杂蛋白和其他杂质，之后再用0.1mph3.0的glycine洗脱目标抗体蛋白，将获得的抗cd47/cd20抗体编号a-f；(6)将洗脱得到的抗体超滤至1×pbs溶液中，分装置于-80℃保存。表1.cd47/cd20双特异性抗体序列组成实施例3facs检测抗体与细胞表面抗原的结合情况抗cd47/cd20双特异性抗体(a-f)与细胞表面cd20的结合：(1)将3×105个raji(cd20+)细胞(每个样品)与100ul浓度为80ug/ml的cd47纳米抗体nb1902(e.coli表达)于4℃孵育20min；(2)抗体稀释：将各组抗体分别进行梯度稀释(100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml、3.125ug/ml、1.56ug/ml、0.78ug/ml、0.39ug/ml、0.195ug/ml、0.0976ug/ml、0.0488ug/ml)，将100ul稀释好的抗体分别与每孔raji细胞孵育20min，4℃，同时设置阳性对照(利妥昔单抗)；(2)pbs洗涤2次细胞，加入ebioscience的anti-hfc-fitc(1：200稀释使用)，4℃孵育20min，pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bdfacscalibur)检测，使用graphpadprism6软件进行数据处理。结果如图2所示，本发明申请的双特异性抗体a、b、c能够与细胞表面的cd20结合，其中双抗b的结合能力与利妥昔单抗的结合活性相似，因此证明，双特异性抗体b保留了较好的cd20靶标结合活性。实施例4facs检测双抗b同时结合cd47和cd20的能力具体过程如下：(1)每个样品取3×105个raji细胞于pbsbuffer中，加入稀释好的抗cd47/cd20双特异性抗体及对照抗体(抗体稀释终浓度梯度为20ug/ml)，4℃孵育20min；(2)将稀释好的cd47纳米抗体-biotin和利妥昔单抗-biotin分别加入到对应的孔中，排枪混匀，4℃孵育20min；(3)用排枪吸取100ulsa-pe染色液至每孔中，重悬，4℃孵育20min，pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bdfacscalibur)检测，使用graphpadprism6软件进行数据处理。结果如图3所示，双抗b既可以结合cd47，同时又可以结合cd20。实施例5facs检测抗体的ic50具体过程如下：(1)每个样品取3×105个293t/hcd47稳转细胞于pbsbuffer中，加入梯度稀释的抗cd47/cd20双特异性抗体及对照抗体(抗体稀释终浓度梯度为30ug/ml、25ug/ml、20ug/ml、15ug/ml、10g/ml、5ug/ml、3.3ug/ml、2.5ug/ml、1.7ug/ml、1.3ug/ml、0.85ug/ml、0.65ug/ml)，每个样品100ul，所有样本中同时加入2ughsirpa(ecd)-fc-biotin，4℃孵育20min；(2)pbs洗涤2次细胞，加入ebioscience的sa-pe，4℃孵育20min，pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bdfacscalibur)检测，使用graphpadprism6软件进行数据处理。结果如图4所示，双特异性抗体b的ic50为2.496ug/ml，而对照抗体(nb1902-fc)的ic50为0.7673ug/ml。实施例6cck8检测双抗b对raji细胞的增殖抑制毒性具体地，(1)取a，b两块96孔板，a板用于接种细胞，b板用于稀释抗体。(2)胰酶消化raji细胞，完全培养基中和，pbs洗一遍，按照3x104/ml的浓度重悬(1640+1％fbs)，按照100ul/孔用排枪接种到96孔板中，37℃，5％co2，培养24小时。(3)在细胞培养24h前1h稀释抗体(1％fbs的1640)，稀释浓度梯度为1e-6m，2e-7m，4e-8m，8e-9m，1.6e-9m。(4)将细胞中的培养基吸除，加入100ul的稀释好的抗体。(5)72h后，加入cck8溶液10ul/孔，显色1-4h，显色结束后，用酶标仪读取各孔的od450。如图5所示的实验结果表明，本发明申请的抗cd47/cd20双特异性抗体对细胞增殖的抑制活性与利妥昔单抗的抑制活性相同，这说明本发明申请的双特异性抗体完美保留了利妥昔的生物学活性。实施例7候选双抗b介导体外巨噬细胞对raji细胞的吞噬具体过程如下：(1)pbmc在含40ng/mlm-csf的rpmi1640(10％的fbs)诱导9-12天，收获巨噬细胞。(2)给raji标记cfse(终浓度：1.5um)，给macrophage标记eflour670(终浓度：1.25um)。(3)取macrophage1e5(100ul)和3e5(50ul)raji混匀，加入50ul稀释好的抗体。(4)37℃，5％co2，3h。(5)将每个孔中的细胞转移至1.5mlep管中，后用200ul的pbs冲洗各个孔，然后将冲洗后的pbs转移至对应的1.5mlep管中。(6)3000rpm，4℃离心4min，注意不要吸走细胞，加入500ulpbs/管，重悬。(7)3000rpm，4℃离心4min，加入200ulpbs/孔，重悬，流式检测。结果如图6所示，结果表明，双抗b能够有效的促进巨噬细胞对raji细胞的吞噬。实施例8候选双抗b对人血红细胞的凝集作用测定由于红细胞表面有cd47高表达，因此会更容易优先和cd47抗体药物结合，把药物富集在表面起到“储水池”的作用。因此，该种情况容易出现贫血。只有药物进入体内后首先需要突破血小板对cd47抗体的“吸收池”作用，才能有效到达作用位置发挥作用。将cd47纳米抗体nb7(本实验室一株能够引起人、猴子血红细胞凝集的纳米抗体)、cd47纳米抗体nb1902(源自专利201810151752.6)、阳性对照抗体(b6h12)、阴性对照(igg4)分别梯度稀释(8000nm、2000nm、500nm、125nm、62.5nm、15.625nm、3.906nm、0nm)。将50ul梯度稀释好的抗体分别加入到50ul人的红细胞悬液(2％)中，置于37℃下反应过夜后观察结果。结果表明(图7)，候选双抗b不会引起红细胞的凝集反应。其中对照抗体(b6h12)的实验结果与penkas.petrova等人，2016，clin.cancer.res.23(4)报道的结果一致。实施例9候选双抗b在raji肿瘤模型小鼠中的药效检测将含5x106个raji细胞的0.2ml细胞悬液(细胞悬于dpbs)皮下接种于每只小鼠(nsg小鼠，4-6周)的右后背。肿瘤平均体积达到约50-100mm3时开始分组给药。抗体的给药量：20mg/kg。每天给药1次，连续2周。结果如图8所示，结果表明，候选双抗b的肿瘤抑制率达到92％，远远高于利妥昔单抗药效(肿瘤抑制率为57％)，并且优于对照纳米抗体的药效(肿瘤抑制率为81％)，由此能够表明本发明申请的双抗b在该肿瘤抑制过程中发挥了双靶点的协同作用，达到了较为理想的抗肿瘤效果。实施例10候选双抗b纯度分析将纯化后的样品双抗b进行sec分析：(1)样品制备：用流动相将样品稀释到1.0mg/ml，作为供试品。用0.22um的针式滤器过滤至进样瓶中，放入hplc自动进样器中准备进样。(2)流动相：200mmph7.0的磷酸盐水溶液，色谱柱：xbridgebeh200sec3.5μm7.8x300mm，参数设置如下：检测波长280nm，柱温25℃，流速0.5ml/min，进样量10ul。(3)检测结果如图9所示，该双抗样品纯度达到99.33％，可用于后续实验。实施例11候选双抗b的稳定性检测(1)将总量为20mg的样品浓缩或稀释至10mg/ml，用0.22um的针式滤器将样品过滤至新的离心管内，用0.22um的针式滤器将稀释用的样品保存液(1*pbs,ph7.0)过滤至新的离心管内，将过滤后的样品，每管100ul,分装10管至冻存管内，并按照下表10mg/ml对应的名称标记；(2)在新的离心管内加入990ul已过滤的样品保存液，然后再加入110ul的过滤后的样品，充分混匀，每管100ul,分装10管至冻存管内，并按照下表1mg/ml对应的名称标记；(3)在新的离心管内加入880ul已过滤的样品保存液，然后再加入220ul的过滤后的样品，充分混匀，每管100ul,分装10管至冻存管内，并按照下表5mg/ml对应的名称标记；(4)将样品分别按以下条件放置，分别放置在相应的培养箱内：影响因素放置条件代码高温试验25℃±2℃t1强力破坏试验40℃±2℃t2a：高温试验b：强力破坏试验(5)在相应的检测时间点取样，上机检测。结果如图10所示，结果表明：双抗b在室温条件25℃下及高温条件40℃时均表现出良好的稳定性，且浓度高低并不影响抗体稳定性。由此证明该候选双抗b是一株稳定性良好的双抗药物开发候选者。以上实施例表明，本发明的抗cd47/cd20双特异性抗体可以在hek293f细胞中表达，能够进一步通过亲和层析纯化，并且仅经过一步纯化后的纯度可达到99.33％。所得到的双特异性抗体可以结合cd47阳性和cd20阳性的raji细胞，并且同时阻断细胞表面cd47与sirpa的相互作用。该抗体能够有效发挥cd47介导的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，且不发生红细胞凝集；此外，该抗体能够在小鼠体内发挥出双靶点抗体抑制肿瘤的协同功效，并且具有良好的稳定性。由此，本发明申请的抗cd47/cd20双特异性抗体将具有良好的应用前景。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海洛启生物医药技术有限公司<120>抗cd47/cd20双特异性抗体及其用途<130>p2018-0855<160>22<170>patentinversion3.5<210>1<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glytyralatyrthrseraspcysmetgly1510<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2iletyrthrproglyasnserthr15<210>3<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3alaalaargargglyalacysserleuargleuprophephetyr151015<210>4<211>25<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4glnvalglnleuglngluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaser2025<210>5<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5trppheargglnthrproglylysglyleugluglyvalalaleu151015<210>6<211>38<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6asntyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspasn151015serlysserthrvaltyrleuglnmetasnserleuargalagluasp202530thralamettyrtyrcys35<210>7<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7trpglyglnglythrleuvalthrvalserser1510<210>8<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8glyglyglyglyser15<210>9<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9glyglyglyglyserglyglyglyser15<210>10<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>10glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly151015glyglyglyser20<210>11<211>213<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11glnilevalleuserglnserproalaileleuseralaserprogly151015glulysvalthrmetthrcysargalaserserservalsertyrile202530histrppheglnglnlysproglyserserprolysprotrpiletyr354045alathrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpthrserasnproprothr859095pheglyglyglythrlysleugluilelysargthrvalalaalapro100105110servalpheilepheproproseraspgluglnleulysserglythr115120125alaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproargglualalys130135140valglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnserglnglu145150155160servalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuserser165170175thrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyrala180185190cysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysserphe195200205asnargglyglucys210<210>12<211>451<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvallysproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530asnmethistrpvallysglnthrproglyargglyleuglutrpile354045glyalailetyrproglyasnglyaspthrsertyrasnglnlysphe505560lysglylysalathrleuthralaasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargserthrtyrtyrglyglyasptrptyrpheasnvaltrpgly100105110alaglythrthrvalthrvalseralaalaserthrlysglyproser115120125valpheproleualaproserserlysserthrserglyglythrala130135140alaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrval145150155160sertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproala165170175valleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrval180185190proserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhis195200205lysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys210215220asplysthrhisthrcysproproc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