基于焦磷酸测序技术的GSTP1基因启动子甲基化检测方法与流程

本发明设计生命科学与生物技术领域，特别设计了基于焦磷酸测序技术的gstp1基因启动子甲基化检测，对gstp1基因甲基化频率进行检测。旨在对癌症的发生发展在分子水平上进行筛查。

背景技术：
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焦磷酸测序技术是一种新型的对dna片段进行高通量全自动的测序技术。其核心主要是通过dna聚合酶，atp硫酸化酶，荧光素酶以及双磷酸酶共同催化同一反应体系的级联反应。

主要原理是：dna模板在上述四种酶的作用下将每次dntp的结合与荧光信号偶联起来，将dna序列记录下来。主要步骤是首先用beeds将待测的dna进行纯化，得到含有生物素标记的待测单链再和测序引物进行结合。再加入上述的四种酶。再接下来的每次反应中只加入四种dntp中的一种物质，如果与模板配对，聚合酶就可发生反应产生荧光信号。此反应循环进行就可得到最终的dna的核苷酸序列。

dna甲基化是常见的表观遗传学修饰之一，是胞嘧啶五位上的碳原子在dna甲基转移酶的作用下发生甲基化变为5mc的过程。dna甲基化会抑制基因的表达，在细胞中调控基因的表达。但在发生在癌基因中则可能会影响细胞的功能与作用。比如原癌基因的低甲基化，抑癌基因的高甲基化都可能导致肿瘤的发生。dna甲基化在分子水平上对癌症进行检测具有重要意义。

gstp1(谷胱甘肽s转移酶p1)是一种抑癌基因。是人体中重要的致癌物代谢酶基因。如果gstp1基因的甲基化程度高则会很大程度上抑制基因的表达，是部分基因的功能失活。这就很大程度上减少了机体对于致癌物质的代谢，进而容易诱发肿瘤的形成。gstp1基因甲基化的高表达发生在多种肿瘤中，如肺癌，前列腺癌，乳腺癌等等。因此研究gstp1基因启动子甲基化程度对于在分子水平上检测癌症的发生具有重要意义。

采用焦磷酸测序技术对gstp1基因启动子区cpg岛甲基化程度进行快速定量检测可以有助于肿瘤疾病的早期筛查。

技术实现要素：

本发明提出了一种基于焦磷酸测序技术，检测gstp1基因启动子甲基化的试剂盒，包括特异性扩增引物gstp1-f和gstp1-r，以及甲基化测序引物gstp1-s。其中gstp1-r带有生物素标记，其碱基序列如下所示：

gstp1-f:5’-ggggtttaggggatttagg-3’；

gstp1-r:5’-tcccttccctaccaaacacat-3’；

gstp1-s:5’-ggtttaggggatttagga-3’。

进一步的，扩增的反应条件是：95℃15分钟；94℃30秒,57℃30秒,72℃30秒,50个循环；72℃10分钟。

本发明提供了检测gstp1基因启动子区域cpg岛甲基化的方法：

一.提取样本中的dna；

二.用重亚硫酸氢钠处理样本dna，处理方式为将浓度为将180μl浓度为3m的重亚硫酸钠溶液与含有2μgdna的20μl水溶液混合置于98℃，10min，然后64℃，2.5个小时，并进行回收；

三.以步骤二中的dna为模板，用gstp1基因的一对特异性扩增引物gstp1-f,gstp1-r对其进行扩增，得到pcr扩增产物，扩增条件为95℃15分钟；94℃30秒,57℃30秒,72℃30秒,50个循环；72℃10分钟；

四.用琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增产物进行检测，根据产物条带是否肉眼可见并且是否位于200与300bp的标记条带之间来判断扩增是否成功；

五.如步骤四中pcr成功扩增，则利用测序引物gstp1-s对步骤三中扩增产物进行测序；

六.根据步骤五中得到的结果报告，得到gstp1基因甲基化频率；

提出了检测gstp1基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，包括特异性扩增引物gstp1-f和gstp1-r，以及甲基化测序引物gstp1-s。其中gstp1-r带有生物素标记。其碱基序列如下所示：

gstp1-f:5’-ggggtttaggggatttagg-3’；

gstp1-r:5’-tcccttccctaccaaacacat-3’；

gstp1-s:5’-ggtttaggggatttagga-3’。

具体的gstp1基因启动子甲基化的试剂盒还包括以下试剂，热启动聚合酶(hotstarttaq)、dntps、缓冲液溶液、h2o、mgcl2以及检测gstp1基因启动子甲基化程度的扩增引物和检测引物。

附图说明

图1：pcr扩增后gstp1启动子区域cpg岛部分片段的琼脂糖凝胶电泳图。图2：待测序列图谱

图3：为焦磷酸测序结果图

具体实施方式

实施例1：

检测病人血液中gstp1基因启动子区域甲基化程度的引物和方法：

(1)收集病人血液200μl，利用柱纯化法提取其中基因组dna，所用试剂盒为tianampgenomicdnakit，提出的基因组dna通过分光光度计检测，其纯度od260/od280为1.7～1.9判定为合格；

(2)用重亚硫酸氢钠处理样本dna，处理方式为将浓度为将180μl浓度为3m的重亚硫酸钠溶液与含有2μgdna的20μl水溶液混合置于98℃，10min，然后64℃，2.5个小时，并进行回收并纯化回收。

(3)以步骤(2)中的dna为模板，用gstp1基因的一对特异性扩增引物gstp1-f,gstp1-r对其进行扩增，得到pcr扩增产物，pcr体系如下；

(4)用琼脂糖凝胶电泳对(3)中扩增产物进行检测，检测是否扩增成功。

(5)如步骤(4)中pcr成功扩增，则采用焦磷酸测序技术对gstp1基因步骤(3)中扩增产物进行测序,得到gstp1基因甲基化状态,焦磷酸测序实验流程如下。缓冲液是pcr缓冲液，tris-hcl

按照表格加入特异性扩增引物gstp1-f和gstp1-r，mix等配制pcr反应体系。

其中特异性扩增引物gstp1-f和gstp1-r的碱基序列如下所示：

gstp1-f:5’-ggggtttaggggatttagg-3’；

gstp1-r:5’-tcccttccctaccaaacacat-3’。

焦磷酸测序流程：对pcr产物进行37℃孵育15-20分钟，期间不断摇晃，避免beeds的沉降。然后将vacuumperptool移到pcr板中，抓取sepharosebeads。抓取后分别放入70％乙醇，denatureationbuffer，washingbuffer中洗涤。最后放入含有测物引物的板孔中。放置于80℃的plateholder上。室温放置15-20分钟，即可运行焦磷酸测序程序进行检测。

实施例2：

采用tianampgenomicdnakit试剂盒从a549细胞样本中提取基因组dna。收集75cm²培养瓶中的细胞：pbs洗1次，胰酶消化4分钟后转移至1.5ml离心管中。800rpm离心5min。pbs洗两次。按照说明书提取基因组dna，之后操作步骤同实施例1。