一种粳稻典染败恢复系分子标记高效辅助选择方法与流程

本发明属于分子标记应用技术领域，具体涉及一种粳稻典染败恢复系分子标记高效辅助选择方法。

背景技术：

近年来，分子育种发展迅速，已在许多研究中成功地将远缘种或野生稻的有利基因导入优良的稻种资源。抗病分子育种是分子标记辅助选择成功的典范。获得了自叶枯病水平和垂直抗性均有所提高的新品系；培育一批具xa-21基因的抗白叶枯病恢复系；结合抗稻瘟病基因pi25的遗传图谱，新增加与该基因紧密连锁的分子标记rm3330和a7，并结合分子标记辅助选择的结果，而采用目标基因两侧连锁的标记同时进行辅助选择，则可以明显提高分子标记辅助选择符合率。

在优质稻育种上，分子标记辅助选择也取得了许多成就，从控制稻米糊化温度的alk基因和控制香味的fgr基因编码区寻找插入缺失长度多态性(indel)位点，并开发出indel标记进行辅助选择育种。通过比较编码bad2的fgr基因序列和9311序列设计功能性sts标记aro，利用aro标记开展香味基因的分子标记辅助选择。水稻恢复基因的分子辅助选择在国内尚处于开发阶段，具有较高的科学研究价值，是创新性极强的科学技术方法，是解决目前杂交稻发展难题的关键技术。

现有的技术缺点是通过表现型间接对基因型进行选择的，理论上，利用分子标记可从dna水平上直接鉴定基因型的差异，因此，避免了表现型推断基因型不准确的缺点。分子标记辅助选择克服了性状表现型鉴定的困难：有些性状的表现型鉴定相当困难，恢复系无法从表性上鉴定出来，在度量技术上难度较大、程序繁琐、周期长、费用高、效率低；通过测配鉴定后基因型与预想的差距较大。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种粳稻典染败恢复系分子标记高效辅助选择方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种粳稻典染败恢复系分子标记高效辅助选择方法，包括以下操作步骤：

(1)分别用引物rm5629、引物rm10353标记四个水稻亲本晚轮422、r498、r527、c418的第一、十染色体恢复基因ssr，然后进行扩增，电泳，得到四个水稻亲本的恢复系基因型，r498的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10，r527的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10，c418的恢复系基因型为rf10rf10，晚轮422的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10；

(2)将四个水稻亲本之间杂交晚轮422/r498、晚轮422/r527、c418/r498、c418/r527，然后得到f2代群体恢复系基因分子标记辅助选择结果，在f2代分离群体中分子标记辅助选择的恢复系泳道，基因型rf1rf1rf10rf10，因此在f2代分离群体中的22个株系中选择到2株带有纯合显性恢复基因的恢复系；

(3)对f4代进行分子标记辅助选择，在f4代分离群体中分子标记辅助选择的恢复系范围扩大了，具有纯合基因型rf1rf1rf10rf10的有18株，因此在四代与二代分离群体相比较，选择效率提高了9倍，其中rm5629引物的序列为：agctcaactcgagaactccc，rm10353引物的序列为：ttgttagttggcgaaaggaa。

具体地，总dna具体提取方法如下：(1)取约0.1g嫩叶放入到2ml离心管中，加入ctab缓冲液900μl，用无菌棒将叶片快速捣碎；(2)65℃水浴30min后取出，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，颠倒混匀10分钟；(3)4℃离心，8000-12000rpm离心10min；(4)取上清液移至另一1.5ml新离心管，加入等体积预冷的异丙醇，将离心管轻柔混匀5min；(5)4℃离心，10000rpm离心10min；(6)弃上清液，用70％乙醇洗涤1次后再用95％乙醇洗涤；(7)风干后，加入适量已灭菌的te溶液稀释，其中ctab缓冲液为10ml1mol/ltris-hcl、4ml0.5mol/ledta、10ml5mol/lnacl，加去离子水定容至100ml，te溶液为1ml1mol/ltris-hcl、0.2ml0.5mol/ledta、98.8ml去离子水。

具体地，pcr反应程序为：94℃下预变性5min，94℃下变性30s，退火30s，退火温度为47℃，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸7min；扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取反应产物2μl与1μl上样缓冲液混匀，电泳缓冲液为tbe溶液，120v恒压电泳1.5h，经0.05％的agno3溶液染色15分钟、显色后进行特异性检测，其中tbe溶液由以下组分制成：54gtris碱、27.5g硼酸、20ml0.5mol/ledta，加水定容至1000ml。

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

本发明主要以北方粳稻与籼稻恢复系杂交后代分离材料为群体，采用分子标记辅助选择的方法，筛选选择具有纯合主效恢复基因，表现可恢性良好的恢复系，应用基因选择提高了选择效率，改变了以往通过测配大田选择才能确定具有恢复基因的选择技术路线，具有优良遗传特性的基因得以保留，从而解决了籼粳交不融合的难题，也为恢复系引入籼稻成分并使得北方杂交粳稻具有更加良好的杂种优势。同时创新了水稻遗传基础资源的途径，为种质资源创新提供了方法和依据，为扩大北方杂交水稻遗传背景提供了可靠的基础保证。

附图说明

图1为引物rm5629扩增的4个亲本恢复基因型分子标记筛选，图2为引物rm10353扩增的4个亲本恢复基因型分子标记筛选，m泳道为d2000dnaladder，a泳道为典败类型不育系，r泳道为恢复系，1-4泳道为四个亲本，顺序依次为r498、r527、c418、晚轮422。

图3为引物rm5629扩增的二代分离群体中的22个株系，图4为引物rm10353扩增的二代分离群体中的22个株系，m为d2000dnaladder；1泳道为新型不育系，2泳道为恢复系，3-24泳道为分离群体中的22个株系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

一种粳稻典染败恢复系分子标记高效辅助选择方法，包括以下操作步骤：

(1)分别用引物rm5629、引物rm10353标记四个水稻亲本晚轮422、r498、r527、c418的第一、十染色体恢复基因ssr，然后进行扩增，电泳，得到四个水稻亲本的恢复系基因型，r498的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10，r527的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10，c418的恢复系基因型为rf10rf10，晚轮422的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10；

(2)将四个水稻亲本之间杂交晚轮422/r498、晚轮422/r527、c418/r498、c418/r527，然后得到f2代群体恢复系基因分子标记辅助选择结果，在f2代分离群体中分子标记辅助选择的恢复系泳道，基因型rf1rf1rf10rf10，因此在f2代分离群体中的22个株系中选择到2株带有纯合显性恢复基因的恢复系；

(3)对f4代进行分子标记辅助选择，在f4代分离群体中分子标记辅助选择的恢复系范围扩大了，具有纯合基因型rf1rf1rf10rf10的有18株，因此在四代与二代分离群体相比较，选择效率提高了9倍，其中rm5629引物的序列为：agctcaactcgagaactccc，rm10353引物的序列为：ttgttagttggcgaaaggaa。

具体地，总dna具体提取方法如下：(1)取约0.1g嫩叶放入到2ml离心管中，加入ctab缓冲液900μl，用无菌棒将叶片快速捣碎；(2)65℃水浴30min后取出，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，颠倒混匀10分钟；(3)4℃离心，8000-12000rpm离心10min；(4)取上清液移至另一1.5ml新离心管，加入等体积预冷的异丙醇，将离心管轻柔混匀5min；(5)4℃离心，10000rpm离心10min；(6)弃上清液，用70％乙醇洗涤1次后再用95％乙醇洗涤；(7)风干后，加入适量已灭菌的te溶液稀释，其中ctab缓冲液为10ml1mol/ltris-hcl、4ml0.5mol/ledta、10ml5mol/lnacl，加去离子水定容至100ml，te溶液为1ml1mol/ltris-hcl、0.2ml0.5mol/ledta、98.8ml去离子水。

具体地，pcr反应程序为：94℃下预变性5min，94℃下变性30s，退火30s，退火温度为47℃，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸7min；扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取反应产物2μl与1μl上样缓冲液混匀，电泳缓冲液为tbe溶液，120v恒压电泳1.5h，经0.05％的agno3溶液染色15分钟、显色后进行特异性检测，其中tbe溶液由以下组分制成：54gtris碱、27.5g硼酸、20ml0.5mol/ledta，加水定容至1000ml。

附图1中与a泳道没有相同带型，与r泳道相同带型的有1、2、3、4泳道，为恢复系，含有rf10纯合基因。b图中与a泳道相同带型的有3泳道，不含rf1纯合基因；与r泳道相同带型的有1、2、4泳道，含有rf1纯合基因。综上所述，r498的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10，r527的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10，c418的恢复系基因型为rf10rf10，晚轮422的恢复系基因型为rf1rf1rf10rf10。亲本中晚轮422、r498、r527具有第一、十染色体上恢复基因阳性纯合体(rfrf)，c418只具有十染色体上恢复基因阳性纯合体(rfrf)，不具备第一染色体上恢复基因阳性纯合体(rfrf)，且四个亲本中均未发现恢复基因杂合体(rfrf)、隐性纯合体(rfrf)。说明这四个亲本是基因型稳定的材料，晚轮422、r498、r527具有恢复谱广的特点，可同时恢典败和染败类型的不育系，c418只能恢复染败类型的不育系。

附图3中与1泳道相同带型的有12、13泳道，为不育株，基因型为rf10rf10；与2泳道相同带型的有4、6、8、9、11、14、17、24泳道，为可育株系，基因型为rf10rf10，其余泳道基因型为rf10rf10。b图中与1泳道相同带型的有5、6、10、13、17、18、20、22泳道，为不育株，基因型为rf1rf1；与2泳道相同带型的有3、9、11泳道，为可育株，基因型为rf1rf1；其余泳道基因型为rf1rf1。综上所述，在二代分离群体中分子标记辅助选择的恢复系泳道9、11，基因型rf1rf1rf10rf10，因此在二代分离群体中的22个株系中选择到2株带有纯合显性恢复基因的恢复系。

表1四个组合f2代分子标记恢复基因频率

对每个组合植株的f2代进行分子标记辅助选择，发现恢复基因单杂合型出现的频率较高，双杂合型出现的频率最高，纯合型出现的频率最低，结合花粉镜检结果，选取正常花粉粒所占比例超过70％的植株进行测交，共选取762株，通过测配对结实率进行分析，发现显型纯合的基因型植株的杂交组合结实率最高，单杂合体缺失rf10的结实率较高，单杂合体缺失rf1的结实率较低，而双杂合体缺失rf1rf10的结实率最低。说明双杂合体中缺失显性恢复基因对结实率影响最大，但杂合体缺失显性恢复基因两者之一对结实率影响较大，但缺失rf1的影响更为明显，而显型纯合恢复基因是恢复系分子标记辅助选择的重点，为培育恢复系提供可靠的技术保障。

表2四个组合f2代花粉染色和测配结实率

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。