本发明属于基因的遗传转化技术领域，具体涉及一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法。
背景技术：
蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质，具有结构组成、催化、调节、贮存和转运等多种生理生化功能。蛋白质固定化是指利用物理、化学或生物方法将蛋白质固定在材料表面，并保持其活性的过程。蛋白质在材料表面的固定化技术有着广泛的应用，比如蛋白分析、药物筛选、和生物催化等等。蛋白质的固定化是一个复杂的动态过程，涉及蛋白质与载体材料之间的多种作用力，如范德华力、氢键、静电吸引等。在固定化过程中，由于蛋白质分子的不稳定性和易变性，使得蛋白质的固定化显得尤为重要和困难。
实现蛋白质固定化的方法有很多，可分为物理吸附法、化学方法固定法以及生物亲和吸附法等等。然而，物理吸附法会使蛋白质在材料表面随意排列，不能精确控制蛋白质的吸附量和构象，也不能有选择性的吸附特定的蛋白质，同时其活性部位得不到充分的暴露，从而导致蛋白质的生物活性降低。化学吸附法的操作过程繁杂，吸附过程中化学试剂的加入容易造成蛋白质的变性和失活，因而不能大规模使用。生物亲和吸附法能够选择性的吸附特定的蛋白质并能够保持蛋白质的活性，但是操作步骤繁琐，生产成本较高。
蛋白质的固定化一般选用水不溶性的固体材料作为载体，载体的种类很多，来源和性质也各不相同。但都应满足以下条件：（1）来源广泛，价格便宜；（2）有一定的机械强度，不易变形；（3）有较好的酸碱耐受度；（4）固定过程中不会引起酶的变性；（5）能充分暴露蛋白质的活性基团。
遗传转化技术为蛋白质的生产提供了新的思路，可以在物种间转移基因，也可以选择易于大量繁殖和不易被微生物污染的生产者。海洋硅藻在自然界中分布广泛，生长周期较短，易于大规模人工养殖。而且其具有多孔硅质外壳，是固定化蛋白质的理想载体。通过转基因的方法在海洋硅藻的壳面上表达锚定蛋白，可以直接得到固定化蛋白质，大大降低了生产成本，简化了生产工艺，且该方法具有可持续性，对环境污染较小。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法，以大规模生产固定化蛋白质，降低生产成本。经遗传转化方法得到的表达壳面锚定蛋白的转基因藻可以应用于动物饲料、生物肥料、生物制药、功能食品以及保健品研制等领域。
具体实施方式
1.质粒的制备：参照序列1构建基础质粒plj01，根据功能基因序列和硅藻的密码子偏好性，设计适合硅藻表达的功能基因表达序列，将硅藻特有启动子、相应抗性筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到plj01的多克隆位点-1（序列2）位置上，将硅藻特有启动子、锚定蛋白基因序列、功能基因表达序列、荧光筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到plj01的多克隆位点-2（序列3）位置上，获得硅藻壳面锚定蛋白表达载体；
2.藻细胞的准备：选用生长快、易培养的硅藻作为受体藻，采用藻类特定培养基，海水取自青岛附近海域，经0.22μm滤膜过滤后高压灭菌。通气培养，生长至对数生长期后进行后续实验；
3.转化方法：采用玻璃珠转化法、基因枪法或电转法将功能基因表达载体转入硅藻中；
4.转基因藻的筛选：将转基因藻细胞重新涂布于含有载体相应筛选标记抗生素的固体培养基上（注：固体平板倒置）培养，待长出单克隆藻落后，挑取单克隆藻落于含有抗生素的藻类特定培养基中培养；
5.转基因藻的鉴定：采用荧光观察法、pcr法、rt-pcr法、western-blot法等进行荧光观察、基因测序和表达产物分析，确定高效表达功能基因的转化藻。
实施例1
1.假微型海链藻（thalassiosirapseudonana）壳面锚定溶菌酶表达载体的构建：
（1）基础质粒的构建：参照序列1构建基础质粒plj01；
（2）硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建：根据假微型海链藻的密码子偏好性，设计适合假微型海链藻表达的溶菌酶基因序列（序列4），总基因长度为435bp。将硅藻特有启动子tpfcp8promoter（序列5）、相应抗性筛选标记基因nourseothricinn-acetyl-transferasegene（序列6）和特有终止子tpfcp8terminator（序列7）按顺序插入到plj01的多克隆位点-1位置上；将硅藻特有启动子tpfcp8promoter、溶菌酶基因表达序列、锚定蛋白基因序列（序列8）、荧光筛选标记基因egfp（序列9）和特有终止子tpfcp8terminator按顺序插入到plj01的多克隆位点-2位置上，获得最终的假微型海链藻壳面锚定溶菌酶表达载体plj02（序列10）。载体构建完成后进行pcr、酶切以及dna测序验证质粒序列的正确性；
2.“基因枪法”转化假微型海链藻并进行转基因藻的筛选
（1）藻细胞的准备：采用假微型海链藻（thalassiosirapseudonana）作为受体藻，培养基为无菌的f/2培养基，培养器皿为500ml的锥形瓶，海水经0.22μm滤膜过滤后高压灭菌。光照周期为12l:12d，光照强度为75μmolphotons.m-2.s-1，温度为21±1℃，培养至藻细胞数量为2-3×106cells/ml时收集进行遗传转化。取藻细胞离心（4000g，10min）浓缩至200μl（108cells/ml），均匀涂布于f/2固体平板正中央（直径≤2cm），尽快轰击；
（2）基因枪轰击：用表达载体plj02制备钨粉微弹，基因枪法轰击假微型海链藻进行遗传转化；
（3）轰击藻细胞的筛选及后续培养：轰击的藻细胞置于光照状态下恢复24h后，将藻细胞用海水f/2培养基(1ml)洗下，重新涂布于含有诺尔丝菌素（100-300μg/ml）的f/2固体平板上（注：固体平板倒置，光照强度75μmolphotons.m-2.s-1，光照周期12l:12d，温度21±1℃）。待长出单克隆藻落后，挑取单克隆藻落于含有诺尔丝菌素（100-300μg/ml）的海水f/2培养基中扩大培养；
3.表达壳面锚定溶菌酶的假微型海链藻的鉴定：
（1）荧光观察：利用激光共聚焦显微镜的绿色荧光蛋白相应波长对遗传转化假微型海链藻进行观察；
（2）转基因藻的pcr检测：根据溶菌酶序列设计引物f、r；提取野生型假微型海链藻和转基因假微型海链藻的dna，利用引物f、r进行pcr反应，pcr条件：98℃预变性2min；98℃变性20sec，60℃退火20sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min，4℃保温。转基因藻pcr产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，显示出435bp大小的基因片段，说明溶菌酶基因已经整合到假微型海链藻的基因组中；
（3）转基因藻的rt-pcr检测：转基因藻的rt-pcr检测：用rna提取试剂盒提取转基因假微型海链藻的总rna，取1μg作为模板，采用反转录试剂盒进行反转录，然后以引物f、r进行rt-pcr扩增，rt-pcr条件：25℃，10min，50℃，30min，85℃，5min，转基因藻pcr产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，显示出435bp大小的基因片段，表明溶菌酶基因在转录水平上能够成功表达，说明溶菌酶基因能够成功进行自我复制，并且该基因能够在假微型海链藻中转录获得相应的mrna；
（4）转基因藻的western-blot检测：提取假微型海链藻的总蛋白，使用anti-lysozyme作为一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg作为二抗进行免疫反应，检测溶菌酶在假微型海链藻中的表达情况，该结果说明溶菌酶基因在假微型海链藻中成功表达，从而在蛋白水平上验证了溶菌酶在假微型海链藻中表达的可行性。
序列表
<110>中国海洋大学
<120>一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法
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