β-丙氨酸的生物合成方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及β-丙氨酸的生物合成方法。
背景技术：
：β-丙氨酸(β-alanine)是自然界中唯一存在的β型氨基酸，它是一种非蛋白氨基酸，主要用于合成泛酸、辅酶a、肌肽和鹅肌肽等物质，对生物体的生长和发育起着必不可少的作用。随着对β-丙氨酸及其衍生物的研究日趋成熟，如喜树碱β-丙氨酸酯、聚β-丙氨酸等，在医药、精细化工、环境等领域发挥越来越重要的作用。国内外生产β-丙氨酸有化学合成法与生物合成法：化学法合成β-丙氨酸路线生物法合成β-丙氨酸路线其中，化学合成法主要是丙烯腈法，是以丙烯腈和液氨为主要原料，在100～109℃，1mpa压力下保温4h，生成β-氨基丙腈，β-氨基丙腈在90～95℃下碱解1h生成β-氨基丙酸钠，再用hcl中和，生产1吨β-丙氨酸大约需2吨naoh和2吨hcl。该方法的原料丙烯腈易燃、高毒、对环境有严重危害、且价格较高。整个生产过程涉及高温、高压反应，能耗很大，同时有副产物生成，反应需要两步完成，过程复杂，强酸、强碱、原料及中间体对人和环境危害很大，并且其产品中含有一定的有害物质。反应产物中含有nacl，需要反复精制才能得到高纯度的β-丙氨酸，否则cl-的存在会大大影响产物质量。而生物合成法生产β-丙氨酸，主要是通过天冬氨酸酶与l-天冬氨酸-α-脱羧酶双酶偶联，催化富马酸加氨合成l-天冬氨酸，而后脱羧生成β-丙氨酸。该方法的原料富马酸转化为β-丙氨酸时有分子量损失，原子经济性差；反应需要两步完成、过程复杂，影响收率；而且酶催化富马酸加氨合成l-天冬氨酸的反应为可逆反应，不能完全转化，收率低。进一步改进丙氨酸的合成工艺，既避免化学法的一系列危害，而克服现有生物法步骤长、经济性差的缺陷，仍是目前研究的热点。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供β-丙氨酸的生物合成方法。本发明利用突变的酶，以丙烯酸为底物生成β-丙氨酸。本提供了能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶。本发明所述的酶为突变的天冬氨酸酶。所述天冬氨酸酶(ec4.3.1.1)能够催化l-天冬氨酸生成富马酸的可逆反应。野生型天冬氨酸酶的活性口袋中，有4个能够与α-羧基相结合的位点，为极性氨基酸残基，通常为苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和天冬酰胺。天冬氨酸酶目前广泛应用于天冬氨酸的生物法合成，并且是现有生物法合成β-丙氨酸第一步所需的酶催化剂。其性质与催化机理已经得到了广泛研究。天冬氨酸酶具有严格的底物特异性，只对富马酸表现出活力，文献报道与前期研究均表明，其对丙烯酸不存在催化活力。本发明选择天冬氨酸酶作为改造起点，在野生型天冬氨酸酶的基础上，通过人工引入突变，改变其催化性质，使其能够将丙烯酸作为底物生成β-丙氨酸。本发明所述的酶，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸。一些实施例中，本发明所述的酶，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为苯丙氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为异亮氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为亮氨酸。一些具体实施例中，野生型天冬氨酸酶来源于芽孢杆菌ym55-1。一个具体实施例中，所述酶为来源于一种芽孢杆菌菌株ym55-1的天冬氨酸酶突变体，其至少包括如下突变之一：187位由苏氨酸突变为丙氨酸；321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸；324位由赖氨酸突变为异亮氨酸；326位由天冬酰胺突变为亮氨酸。具体的，所述酶为：芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸的突变体(记为t187a)；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸的突变体(记为m321f)；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体(记为k324i)；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体(记为n326l)；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌ym55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体。含有四个突变位点的天冬氨酸酶突变体记为afil，的氨基酸序列如seqidno:4。本发明实验表明，含有t187a、m321f、k324i、n326l突变位点之一的天冬氨酸酶突变体即可实现催化丙烯酸向β-丙氨酸的转变，转化率为15.2％～24.3％。而含有四个突变位点的天冬氨酸酶突变体能够使丙烯酸向β-丙氨酸的转化率达到99.8％。以其他物种来源的天冬氨酸酶为野生型酶进行突变，或引入突变位点，也能够实现丙烯酸向β-丙氨酸的转变，催化效率与本申请的效果相似甚至更高。本发明还提供了编码本发明所述酶的dna分子。所述编码本发明所述酶的dna分子采用人工合成的方法，具体实施例中，采用人工设计引物对野生型天冬氨酸酶的dna分子进行扩增，引入突变位点。本发明还提供了一种质粒载体，包括骨架载体和编码本发明所述酶的dna分子。一些实施例中，所述骨架载体为pet-24a。本发明还提供了一种重组菌株，其表达编码本发明所述酶的dna分子。一些实施例中，所述重组菌株的底盘菌为大肠杆菌jm109(de3)。本发明所述酶的制备方法，其为诱导本发明所述重组菌株表达酶。一些实施例中，所述诱导的培养基为自诱导培养基，诱导的条件为30℃，24h。具体的，本发明所述酶的制备方法为，将所述重组菌株接种至含有卡那霉素的lb培养基，使od600达到0.4～0.5，作为种子液；然后将种子液以1％的接种量接种于自诱导培养基中，30℃培养24小时后，将菌液以超声波破碎，离心后取上清也，即为含有酶的酶液。本发明所述酶用于制备β-丙氨酸。采用上述方法制得的含有酶的酶液促进丙烯酸转化为β-丙氨酸。本发明还提供了一种β-丙氨酸的制备方法，其以本发明所述酶使丙烯酸转化为β-丙氨酸。本发明实施例中，所述丙烯酸转化为β-丙氨酸的反应体系包括：25wt％氨水、冰乙酸、丙烯酸、mgso4·7h2o和所述酶。所述氨水与冰乙酸的体积比为18:1。丙烯酸与氨水的质量-体积比为1g:2ml。丙烯酸与酶液的质量体积比为18g：9ml。mgso4·7h2o与酶液的质量-体积比为0.13mg:9ml。本发明实施例中，所述丙烯酸转化为β-丙氨酸的反应条件为：ph值8.9～9.1，48℃～51℃反应24小时。具体的，β-丙氨酸的制备方法包括：20～30rpm搅拌条件下，在4倍体积的25wt％氨水中依次加入2/9倍体积的冰乙酸、丙烯酸，即热至48℃～51℃，调节ph值为9.0～9.2；丙烯酸与氨水的质量-体积比为1g:2ml；然后加入mgso4·7h2o、1倍体积的酶液，调节ph值为8.9～9.1，48℃～51℃保温反应24小时后；mgso4·7h2o与酶液的质量-体积比为0.13mg:9ml。本发明提供了能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶，以该酶进行β-丙氨酸的生物合成，至少存在如下有益效果：1、能够避免化学法涉及的高温、高压反应，且副反应得到了良好的控制；2、避免了丙烯腈的使用，丙烯腈毒性大，环境危害大，而本发明以丙烯酸为原料，不仅毒性小，对环境影响小；3、与现有的生物法相比，且仅需一步反应，缩短了反应进程，24小时即可实现β丙烯酸的制备，提高了制备效率。附图说明图1示发酵前样品检测图谱；图2示发酵后样品的检测图谱。具体实施方式本发明提供了β-丙氨酸的生物合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1突变生成与筛选制备天冬氨酸酶的突变体：t187、m321、k324、n326和afil(四突变体)。野生型天冬氨酸酶(genbank号为ab028242.1)来源于芽孢杆菌(bacillussp)ym55-1，核苷酸序列如seqidno：1所示，氨基酸序列如seqidno：3，以含有该野生天冬氨酸酶基因的pet-24a(核苷酸序列如seqidno：2所示)的重组质粒为模板，对t187、m321、k324和n326位点进行定点饱和突变。利用软件oligo7设计平末端引物，简并引物如下(其中n＝a、g、c或t；k＝g或t)：突变t187位氨基酸：正向引物：5’-nnkggtatcggcggttttg-3’反向引物：5’-accacccagacccagtgccgga-3’突变m321位氨基酸：正向引物：5’-nnkcaatatatcgtaaaagctgctg-3’反向引物：5’-atgttctttatcgagtaagccaact-3’突变k324位氨基酸：正向引物：5’-nnkccgcgatattgaacgtattgcc-3’反向引物：5’-aaattctttatcgagtaagccaact-3’突变n326位氨基酸：正向引物：5’-nnkattgaacgtattgccaatacga-3’反向引物：5’-aacttctttatcgagtaagccaact-3’进行pcr定点突变，本次pcr突变采用kod-plus-neodna聚合酶试剂盒(东洋纺科技有限公司，上海)。单突变体采用单次pcr获得，四突变体采用迭代pcr获得。使用pcrcleaning试剂盒(捷瑞生物工程有限公司，上海)进行pcr产物回收，将产物清洗后使用pnk激酶(捷瑞生物工程有限公司，上海)连接入pet-24a空载体。将连接有pcr产物的质粒转化大肠杆菌jm109(de3)，平板培养后，挑选长出的单克隆送测序，验证序列正确，得到了含有突变体的大肠杆菌。实施例2天冬氨酸酶突变体的表达将实施例1制备获得的各转化子(含有突变体的大肠杆菌，以表达野生型天冬氨酸酶的大肠杆菌为对照)分别接种于装有5ml含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至od600达到0.4～0.5左右，获得种子液。将各种子液分别以1％的接种量接种于自诱导培养基(青岛海博)中，30℃培养24小时。将菌液超声波破碎，离心后获得上清，即为相应的酶液。实施例3天冬氨酸酶突变体对丙烯酸的催化β-丙氨酸合成路线在100ml三颈烧瓶中加入25％氨水23ml，25rpm开启搅拌，缓慢加入冰乙酸(ar)5ml，加入丙烯酸6.0g，搅拌并水浴加热至48～51℃，体系ph9.0-9.2，加入mgso4·7h2o0.13mg，加入是实施例2制得的酶液9ml，复测ph8.9-9.1，48～51℃保温反应24小时后，取100μl反应液经流动相稀释1000倍进行hplc液相分析。液相条件：c18柱(25cm)，[3％nah2po4·2h2o(ph3.3-3.5):水＝1：3]:乙腈＝85：15；流速1ml/min，检测波长：205nm。保留时间：β-丙氨酸：2.66min；丙烯酸：5.17min转化率＝[1-(残留的丙烯酸含量/初始的丙烯酸含量)]×100％其中，以afil进行催化，反应前的检测谱图如附图1，其中，丙烯酸的浓度为276.9mg/ml；24h反应后谱图如图2所示，其中，丙烯酸的浓度为0.55mg/ml。各突变体催化丙烯酸向β-丙氨酸转化的转化率如表1：表1突变体检测结果突变体丙烯酸转化率野生型nd(未检到)t187a15.2％m321f24.3％k324i20.5％n326l18.4％afil99.8％结果表明，各突变体能够催化丙烯酸向β-丙氨酸的转变，而同时存在四个突变位点的天冬氨酸酶突变体能够使丙烯酸向β-丙氨酸的转化率达到99.8％。四种单突变的突变体的转化效率依次为15.2％、24.3％、20.5％、18.4％，而四突变体的转化率为99.8％，不仅显著性的高于四种但突变体，也显著性的高于四种突变体的转化率之和。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>台州酶易生物技术有限公司<120>β-丙氨酸的生物合成方法<130>mp1818931<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2106<212>dna<213>芽孢杆菌ym55-1(bacillussp.ym55-1)<400>1tctacagcaggaatccctgtattcactgtaaataaaccgatggaaccaaaaatggccata60ctaactgacagtttaatcatagcagatacattcatttgacttccctcaaaactatattaa120tatcctataattttccgaaaactctgaaataaaacaatatagaatctattaaataacatt180tatgtgaatttggcaatactattacaaaatattattaggaaacagggctctttttatatt240ttctatgatagaatagtgtaggatttaataaagaaactctaatacaagttcgacaatgta300aacgtttgcttagagcttcgatagaaagaaaaggagattgtttttattatgaataccgat360gttcgtattgagaaagactttttaggagaaaaggagattccgaaagacgcttattatggc420gtacaaacaattcgggcaacggaaaattttccaattacaggttatcgtattcatccagaa480ttaattaaatcactagggattgtaaaaaaatcagccgcattagcaaacatggaagttggc540ttactcgataaagaagttgggcaatatatcgtaaaagctgctgacgaagtgattgaagga600aaatggaatgatcaatttattgttgacccaattcaaggcggggcaggaacttccattaat660atgaatgcaaatgaagtgattgctaaccgcgcattagaattaatgggagaggaaaaagga720aactattcaaaaattagtccaaactcccatgtaaatatgtctcaatcaacaaacgatgct780ttccctactgcaacgcatattgctgtgttaagtttattaaatcaattaattgaaactaca840aaatacatgcaacaagaattcatgaaaaaagcagatgaattcgctggcgttattaaaatg900ggaagaacgcacttgcaagacgctgttcctattttattaggacaagagtttgaagcatat960gctcgtgtaattgcccgcgatattgaacgtattgccaatacgagaaacaatttatacgac1020atcaacatgggtgcaacagcagtcggcactggcttaaatgcagatcctgaatatataagc1080atcgtaacagaacatttagcaaaattcagcggacatccattaagaagtgcacaacattta1140gtggacgcaactcaaaatacagactgctatacagaagtttcttctgcattaaaagtttgc1200atgatcaacatgtctaaaattgccaatgatttacgcttaatggcatctggaccacgcgca1260ggcttatcagaaatcgttcttcctgctcgacaacctggatcttctatcatgcctggtaaa1320gtgaatcctgttatgccagaagtgatgaaccaagtggcattccaagtgttcggtaatgat1380ttaacaattacatctgcttctgaagcaggccaatttgaattaaatgtgatggaacctgtg1440ttattcttcaatttaattcaatcgatttcgattatgactaatgtctttaaatcctttaca1500gaaaactgcttaaaaggtattaaggcaaatgaagaacgcatgaaagaatatgttgagaaa1560agcattggaatcattactgcaattaacccacatgtaggctatgaaacagctgcaaaatta1620gcacgtgaagcatatcttacaggggaatccatccgtgaactttgcattaagtatggcgta1680ttaacagaagaacagttaaatgaaatcttaaatccatatgaaatgacacatccgggaatt1740gctggaagaaaataatgctacttttttaggcgaagggtactattgaggtgctctttgcct1800tttattttttgagttacaacatgctcatcttgatgaagtgtaatcgaaatctgcaatgtt1860cgataatagccaaaatcgtggagataatagtcaatcaagtaaggataatagtcaaactcg1920ggcagataatagccaatggaagaaaaaggtgcttagcgaaattcgatattagtcaaaatc1980aagaagataatagtcaaccaagcaaggataatagtcaaacttgggaacataatagccaac2040ggaagaaaaagttgcctcgcccctcggcaagataatagccaatggaagaaaaagttgcct2100cgcccg2106<210>2<211>5310<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaa60ggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctt120tgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagcttgt180cgacggagctcgaattcggatccgcgacccatttgctgtccaccagtcatgctagccata240tgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctc300acaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgc360cggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgc420cgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcgg480cgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgc540accattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaat600gcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacct660ttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaac720cagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcg780tggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatgg840cggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgc900tgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcga960ttaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcg1020gcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctga1080tcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatg1140ttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctccc1200atgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcg1260cgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcata1320aatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgcca1380tgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgc1440tggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgc1500gcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttata1560tcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggacc1620gcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcac1680tggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttgg1740ccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgc1800aacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttg1860agagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgca1920cttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtc1980attttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggta2040ttcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttc2100ggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctc2160ctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatca2220ccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaaca2280acatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccc2340tgcaccattatgttccggatctgca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