基于辅助质粒和PCR产物的蓝舌病病毒反向遗传拯救方法及其应用与流程

本发明涉及一种病毒拯救方法，尤其是涉及一种蓝舌病病毒的拯救方法。
背景技术：
：蓝舌病(bluetonguedisease,bt)，是由btv引起，通过吸血昆虫传播的反刍动物病毒性传染病,以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为特征。btv为双股rna病毒，其基因组包含10个节段，大小约为19kb。btv为呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(orbivirus)蓝舌病病毒亚群(bluetinguevirussubgroup)的成员之一，环状病毒属共有14个亚群，其中蓝舌病病毒亚群与鹿出血症病毒亚群有较强的交叉反应性。bt最早于1876年发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热，口腔出现溃疡损伤，口腔粘膜及舌头发蓝，因此，于1906年提议定名为“蓝舌病”，牛的bt发现于1943年。btv几乎可以感染所有的反刍动物，包括家养和野生的牛、山羊和某些野生动物。牛、山羊、鹿及羚羊等野生反刍动物可长期带毒，并在疾病流行间歇期扮演着病毒宿主的角色。而吸血昆虫，特别是库蠓是其主要传播媒介。1940年前本病仅限于撒哈拉以南的非洲大陆，到40年代已蔓延至中东一些国家和地区，例如：塞浦路斯、叙利亚、伊拉克、土耳其、以色列和巴勒斯坦。1948年美国报道此病。70年代后期本病广泛分布于热带、亚热带国家。1956～1957年欧洲尤其是西班牙和葡萄牙流行。1978在澳大利亚的库蠓体内分离到btv。目前，热带和亚热带地区绝大多数国家的易感动物都可能感染btv或与之密切相关的病毒。我国于1979年在云南师宗首先发现本病并分离出btv，从而确定了本病在国内的存在，随后在湖北(1983)、安徽(1985)、四川(1988)、甘肃(1990)、山西(1991)等29个省均检出btv血清学阳性牲畜。近年来，随着全球气候变暖，bt在许多国家相继爆发，且分布范围不断扩大。2006年8月，德国、比利时、法国、荷兰等首次发现牛感染bt，2007年7月，英国、法国、意大利等国爆发本病。世界动物卫生组织(oie)通报，2008年3月～4月，法国、意大利等国爆发了bt，2009年1月～12月，英国、法国、意大利、澳大利亚、希腊、以色列、丹麦、捷克、瑞典、挪威、西班牙、德国、奥地利、葡萄牙、匈牙利、荷兰、阿曼、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯等国先后爆发bt。蓝舌病目前已经报道27个血清型，各个国家血清型分布不均一，到目前为止，并没有有效的疫苗来防治本病。我国已在多数省份和地区检测到该病，加之国际贸易中本病存在的风险，故我国急需加强对该病的研究，做好可对其进行防控和检测的技术储备。但由于btv血清型较多，并且血清型还可以出现基因重组现象，更导致了该病防控的困难。出于对有效防控btv考虑，其机制研究和新型疫苗的研究越来越受到研究人员的关注。而反向遗传操作技术是解决以上问题的重要手段之一。目前主流的蓝舌病病毒反向遗传操作系统均采用基于辅助质粒和体外转录rna的两步法转染方式。但这种方法存在的明显缺点在于，第二步转染用模板需要通过构建质粒，再大量培养细菌，大量提取质粒获得，并且提取的质粒需要经过酶切，纯化并达到一定浓度后方可作为体外转录的模板，然后用昂贵的体外转录试剂盒进行转录，再次经过rna纯化方可获得第二步转染物。这一过程费时费力，并且在转录、转录产物电泳鉴定、纯化和转染等步骤均需要避免rna酶的污染，转录的rna产物由于其固有的特性，保存困难。这种转录方法操作步骤繁琐、试剂费用高、操作难度相对较大，对人员、环境、设备要求均较高，常常由于操作不当导致病毒拯救失败。此外，由于btv某些血清型基因本身的原因，个别节段的基因很难构建入rna转录模板质粒，甚至无法构建入rna转录模板质粒，进而使病毒拯救无法进行。这种情况下急需一种方便快捷的反向遗传操作系统满足基础研究和应用研究的需要，为疫苗研发提供简单实用的技术手段。技术实现要素：本发明提供一种无需制备rna就可以拯救病毒，并且在病毒基因组无法插入质粒时，可以直接从病毒基因组克隆基因，实现病毒拯救的方法。本发明提供一种蓝舌病病毒的反向拯救系统，该系统通过两步细胞内转染，使得pcr产物转染的细胞利用细胞自身的rna转录机制实现了细胞内的转录，实现了无需体外制备rna的过程就可以拯救病毒的目的。进一步该系统通过利用细胞内自身转录机制，当病毒基因组无法插入质粒进行体外转录时，可以通过在细胞内直接从病毒基因组克隆基因，来实现病毒拯救。进一步，本发明提供一组辅助质粒，该质粒含有蓝舌病病毒btv-1sz97/1完整基因。该组辅助质粒数目优选是7个，在拯救系统中，辅助质粒是通过将btvvp1、vp3、vp4、vp6、vp7、ns1和ns2这7种蛋白的开放阅读框插入真核表达质粒pci-noe获得。进一步，本发明提供一组蓝舌病病毒10个节段的pcr产物，该产物是通过pcr技术在蓝舌病病毒segment1、segment2、segment3、segment4、segment5、segment6、segment7、segment8、segment9和segment10的10个节段前面引入t7启动子获得，其中这10个节段称为t7-seg1至t7-seg10，序列号分别为seqidno:1至10。构建的pcr产物使t7细胞内转录产物与对应的蓝舌病病毒rna完全一致，即病毒基因5’端第一个核苷酸位于t7启动子转录启始位置，3’端通过run-off方式保证了最后一个核苷酸与病毒基因的一致性。同时，本发明提供一种通过反向拯救系统拯救蓝舌病病毒的方法，该方法通过辅助质粒和病毒基因组pcr产物两次转染细胞，实现拯救btv病毒的目的，所述细胞优选bsr细胞。进一步，在本发明反向遗传操作系统中，首先转染辅助质粒，并在辅助质粒转染后再次转染病毒基因节段。转染辅助质粒的目的是通过真核表达质粒首先表达病毒复制和组装过程中必须的几种蛋白，首次转染与二次转染的间隔时间保证了辅助质粒携带病毒基因在转染细胞内有效并充分表达，使转染细胞内具备病毒复制与组装的基本条件。这样二次转染的pcr产物在t7启动子的作用下，转录出准确的病毒基因组rna后，就在转染的细胞内形成与病毒真实感染后非常相似的状态，细胞内即可组装出具有感染性的病毒。进一步，本发明提供一种蓝舌病病毒，该病毒是通过本发明反向拯救系统拯救获得。更进一步，本发明提供一种基于蓝舌病病毒的疫苗，该蓝舌病毒是通过本发明的反向拯救系统获得。本发明提供的基于辅助质粒和pcr产物两步转染细胞的简便快捷的病毒拯救系统，可用于蓝舌病病毒致病机制的研究、免疫机制的研究以及为疫苗的研发提供了简单实用的技术手段。附图说明图1、7个辅助质粒酶切鉴定的结果；第1泳道：dl5000dnamarker，第2泳道：a1(pci-vp1)酶切产物，第3泳道：a2(pci-vp3)酶切产物，第4泳道：a3(pci-vp4)酶切产物，第5泳道：a4(pci-vp6)酶切产物，第6泳道：a5(pci-vp7)酶切产物，第7泳道：a6(pci-ns1)酶切产物，第8泳道：a7(pci-ns2)酶切产物。图2、10个pcr产物电泳鉴定的结果：第1泳道：dl5000dnamarker，第2泳道：segment1pcr产物，第3泳道：segment2pcr产物，第4泳道：segment3pcr产物，第5泳道：segment4pcr产物，第6泳道：segment5pcr产物，第7泳道：segment6pcr产物，第8泳道：segment7pcr产物，第9泳道：segment8pcr产物，第10泳道：segment9pcr产物，第11泳道：segment10pcr产物。图3、拯救病毒接种bhk-21细胞后间接免疫荧光的鉴定结果：a拯救病毒间接免疫荧光结果，b细胞对照间接免疫荧光结果。图4、拯救病毒pcr鉴定结果。图5、拯救病毒基因组rna电泳鉴定结果；第1泳道：dl5000dnamarker，第2泳道：拯救病毒pcr鉴定结果。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。主要实验材料和来源1.质粒、细胞用于本发明实验中的7个辅助质粒为本实验室保存，含有蓝舌病病毒btv-1sz97/1完整基因的10个质粒(b1-b10)为本实验室保存。bsr细胞为本实验保存，bhk-21细胞为本实验室保存。7个辅助质粒的信息如下表所示：辅助质粒基因编码蛋白及功能表2.主要试剂和药品胎牛血清(fbs)购自excel公司、dmem及opti-mem购自gibcol公司；转染试剂lipofectamine3000购自neb公司，抗vp7单克隆抗体为本实验保存，抗小鼠iggfitc标记酶标抗体购自sigma公司，质粒大提试剂盒购自bimake公司，2xphantamastermixdna聚合酶和质粒小提试剂盒购自vazyme公司，rna纯化试剂盒购自qiagen公司，s1核酶购自takara公司。实施例1:7个辅助质粒的构建辅助质粒引物设计以蓝舌病毒vp1、vp3、vp4、ns1、vp7、ns2和vp6基因开放阅读框为模板设计引物，并在vp1、vp3、vp4和ns2上下游引物分别引入smai和noti酶切位点，在vp6、vp7和ns1上下游引物分别引入ecori和sali酶切位点(表1)。表1辅助质粒构建引物7个辅助质粒的构建以本实验室保存的血清1型蓝舌病毒vp1、vp3、vp4、ns1、vp7、ns2和vp6基因质粒为模板，用上述所设计引物克隆对应基因，pcr反应体系为：去离子水22ul，对应上下游引物各1ul，对应质粒模板1ul，primestar2xpromix聚合酶25ul。pcr反应条件如表2所示。表2辅助质粒构建对应基因pcr反应条件pcr反应结束后，用pcr纯化试剂盒对pcr产物进行纯化，然后用smai与noti对vp1、vp3、vp4和ns2进行酶切，用ecori与sali对vp6、vp7和ns1进行酶切。并对pci-neo载体分别进行对应的酶切处理。常规方法链接转化，对转化菌提取质粒进行酶切鉴定(图1)，并进行序列测定。将序列测定正确的质粒分别命名为质粒a1(pci-vp1)、a2(pci-vp3)、a3(pci-vp4)、a4(pci-vp6)、a5(pci-vp7)、a6(pci-ns1)和a7(pci-ns2)。实施例2：血清1型蓝舌病病毒10个基因节段的克隆1.引物设计根据含有血清1型蓝舌病病毒基因的b1-b10质粒对应的序列设计克隆蓝舌病病毒10个基因节段的pcr引物(如下表3所示)该引物保证了pcr产物含有完整的btv各个节段基因，即5’端第一核苷酸位于t7启动子的“+1”位，3’端为病毒基因的最后一个核苷酸，见表3：表3：蓝舌病病毒10个基因节段克隆用引物序列以b5质粒为模板设计拯救病毒鉴定引物，所设计的引物如表4所示：表4：蓝舌病病毒鉴定用引物引物名称引物序列(5’-3’)ls5-jd-fgattacgcaaatgccacgagals5-jd-rcactctgcctttgtatccagt2、血清1型蓝舌病病毒btv10个节段pcr的反应体系：pcr的体系：为了获得更多的纯化pcr产物，每个节段进行5个pcr反应。按表5的反应条件进行克隆。表5：pcr反应条件3、pcr反应产物的鉴定将每个片段的5个pcr产物混合，取200ul用于纯化，剩余pcr产物进行电泳鉴定，电泳条件：琼脂糖凝胶浓度：1％电泳电压：160v电泳时间：30分钟上样量：5ul电泳结果如图2所示。4、血清1型蓝舌病病毒10个节段pcr产物的纯化(1)向200ulbtv10个节段pcr产物中分别加入700ulbufferrlt，混匀。(2)再分别向每个pcr产物混合液中加入500ul无水乙醇，用移液器吹打混匀。(3)分别将蓝舌病病毒10个节段混合液700ul加入纯化柱中，12000xg离心15seconds，弃去离心后收集管中的液体。将剩余pcr产物加入到纯化柱中，同样方法离心，去滤液。(4)向纯化柱中加入500ulbufferrpe，12000xg离心15seconds，弃收集管中的液体。(5)再向纯化柱中加入500ulbufferrpe，12000xg离心2min，弃收集管中的液体。(6)将纯化柱放入新的收集管中，12000xg离心1min，以确保去除纯化柱中残留的液体。(7)向纯化柱中加入50ulrnase-freewater，将纯化柱放入1.5ml离心管中，12000xg离心1min。纯化后的酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并测定浓度后，于-20℃冻存以备下一步使用。5、蓝舌病病毒的拯救准备bsr细胞，将bsr细胞铺板6孔板，待细胞生长至单层后，转染辅助质粒，具体方法如下：将待转染孔用无菌pbs洗涤三次，弃去洗涤液，每孔加入2mlopti-mem。然后准备转染液，取2支1.5ml无菌离心管，每个离心管内加入250ulopti-mem，分别标记为溶液1和溶液2。在溶液1中加入15ullipofectaminetm3000reagent，混匀备用，在溶液2中加入辅助质粒共计3.2ug，然后加入p3000tmreagent6.4ul，混匀备用。将溶液1和溶液2混匀，室温静置15分钟，然后按每孔250ul的量将转染液加入待转染孔，将6孔板放入37℃继续培养20小时。辅助质粒转染20小时后，进行基因组pcr产物转染，具体方法如下：取出转染辅助质粒的6孔板，将转染孔内培养液弃去，pbs洗涤3次，然后每孔加入2mlopti-mem，备用。取2支1.5ml离心管，每管加入250ulopti-mem，分别标记为溶液1和溶液2。在溶液1中加入15ullipofectaminetm3000reagent，混匀备用，在溶液2中加入辅助质粒共计8ug，然后加入p3000tmreagent16ul，混匀备用。将溶液1和溶液2混匀，室温静置15分钟，然后按每孔250ul的量将转染液加入待转染孔，将6孔板放入37℃继续培养。20小时以后将转染孔培养液换成含有1％fbs的培养液，每日观察细胞病变，在转染后4天若无可见病变，可将转染孔细胞传代两次，即有可见病变出现。待细胞出现病变后，收获病毒，具体方法如下：将出现细胞病变的细胞冻融1次，然后将待有细胞碎片的培养液收集即为病毒液。6、拯救病毒的鉴定6.1拯救病毒的ifa鉴定：将拯救病毒接种bhk-21细胞，待细胞出现病变后，进行ifa鉴定，具体方法如下：将6孔板取出，弃去病变孔上清，用pbst洗涤细胞3次，每次2ml，每孔加入1ml4％多聚甲醛固定液，放入4℃冰箱放置30分钟。取出6孔板，弃去固定液，于病变孔加入1ml透膜液(含有0.1％tripton-100的pbst)，放入4℃透膜处理30分钟。取出6孔板，弃去透膜液，pbst洗涤5次，每次2ml。每孔加入2000倍稀释的4h7抗体，放入37℃孵育1小时。取出6孔板，pbst洗涤5次，每孔加入128倍稀释的山羊抗小鼠fitc标记酶标抗体，每孔500ul，放入37℃孵育1小时。取出6孔板，pbst洗涤5次，放入荧光显微镜下观察，结果如图3。6.2拯救病毒的pcr鉴定：将拯救病毒接种bhk-21细胞，待细胞病变出现后，用qiagen公司组织细胞rna提取试剂盒提取细胞总rna，所提取的总rna以ls5-jd-f/ls5-jd-r为引物进行反转录，具体方法如下：取细胞总rna3ul，ls5-jd-f/ls5-jd-r各1ul，混匀，放入pcr仪内，95℃处理5分钟，4℃处理5分钟。取出pcr管，依次加入以下试剂：去rnase水5.5ul，5x反转录buffer4ul，rnaseinhibitor0.5ul，amv1ul，混匀，放入pcr仪，25℃10分钟，42℃60分钟，70℃5分钟，4℃5分钟。即获得反转录产物。重组病毒的pcr鉴定：pcr反应体系为：将以上体系混匀，按下述表6程序进行pcr扩增：表6：重组病毒的pcr反应条件pcr结束后，对产物进行电泳鉴定，结果如图5，表明成功拯救重组病毒。6.3拯救病毒基因组电泳鉴定：将拯救病毒接种bhk-21细胞，待细胞病变出现后，用trizoltmlsreagen提取感染细胞总rna，具体方法参照说明书进行，简言之：将细胞冻融一次，将残留在细胞瓶底的细胞悬起，5000g离心5分钟，收集细胞沉淀，用细胞上清定容至250ul并转移至新的1.5ml离心管，加入750ultrizoltmlsreagent混匀，室温放置5分钟，加入200ul三氯甲烷，剧烈摇晃混匀，室温静置15分钟，4℃下12000g离心15分钟，取最上层无色液相至新的无rnase离心管，加入500ul异丙醇，轻混混匀后室温静置10分钟，4℃下12000g离心10分钟，弃去上清，用1ml75％乙醇重悬沉淀，5000g离心5分钟，弃去上清，室温干燥rna5分钟，用适量无rnase水溶解rna。用s1核酸酶对trizol法提取的总rna进行消化，具体方法如下：s1核酸酶酶切体系：将以上体系混合均匀，放入37℃温箱消化1小时。消化结束后，取10ul酶切产物用2％琼脂糖凝胶常规方法电泳，电泳电压160v。电泳结果显示蓝舌病10个基因节段呈典型的“331”分布(图5)通过本发明的两步细胞内转染法，能够快速准确的拯救btv病毒，所述病毒进一步用于制备疫苗以及蓝舌病机制的研究。序列表<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)<120>基于辅助质粒和pcr产物的蓝舌病病毒反向遗传拯救方法及其应用<160>10<170>patentinversion2.1<210>1<211>3975<212>dna<213>蓝舌病病毒亚群（bluetinguevirus）<400>1cggccagtgaattgtaatacgactcactatagttaaaatgcaatggtcgcaatcaccgtgcaaggtgcacagctcatcaagcgagtggtcgaacgcttttatccagggatagcatttaatatagatgaaggagcatgttatatatataagttttctgatcatatacgacgcataaggatgaaacatggaacgaaatatcgacggcaggcggaagagattatgcgcaatataagcttgaggaaagagcgattgtatgggataccagtattagatgaggttgagtggaagtatgtgtttgatggtcaaacgttccaaagttacgcttttgaggtgtacgtgaactcaattttgccgtggagtgaacttgatccggaggaagagttcttacgtaattatagagtttcaagggagatgactgaagtggaaaaatttatcgaattccgtgctaaaaacgagatgcaaatatacggagatatacccattaaggtatggtgttgtttcatcaatgaactgagtgcggaattaaaacatattcccttagggatgcaagttatggctgactttgtaaaccgtttcgattcaccattccatcaggggaatagagatttatcaaatcttgaagattttcaagttgcatacactacgccgcttttgtttgaaatgtgttgcatggaatcaattttagaattcaatatcaaaatgcgtatgcgtgaagaagatatctcggcgctggaattcggtgatatgaaagttgatccggttggactattgcgtgagtttttcattctgtgcttaccacacccaaagaagattaacaacgttctaagagcaccatactcttggtttgtaaagatgtggggcgtcggagctgatccgatcgttgttttacaatctacggcaggcgatgacaggaattcaaaggatgtgttttatgacaagtttcgaaccgagccaaatcgatacaaagccctatttcggtcatcgttttataacgaatcaagacgaatgaatgaggagaagattctagaggcagtgaagtattcgcaaaaattgggctcgcacgaacgtagattacctctttttgagaaaatgttaaagacggtttatactacaccattttatccacataagagctcgaatatgatactagcgtcctttctattaagtattcaaactattactggatatggcagggcgtgggtgaagaacgtgagtactgagttcgataaacagctgaagccgaacccgagcaatctagttcaggatgtttcggatttaacgcgggaattctttaaacaagcatatgttgaagcaaaagaacgtagagaagagatcgttaaacctgaggatttatatacatcgatgttgcgattagcgagaaatacaagttcaggtttttcaaccgagatttatgtaaaaaagagatttggtccaagactaagggataaagatttgatcaagatcaattcaaggattaaggctttagttattttcactaaaggacatactgttttcactgatgaagaacttcataaaaaatataatagtgtagaactataccaaactaagggttcaagagatgtaccgattaaggctacgagaacgatatattcaatcaatctttcagtgttggtaccgcagttaattgttactttacccttgaatgaatatttttctagggttggcgggataaccagtccggattataagaagatcggaggaaaagtaattgtcggagatttggaggccacggggtcgcgcgtgatggatgctgctgattgctttcgtaactctgcagaccgcgatatattcacaattgcaatcgactatagtgaatatgatacacacctaacgcgacataattttcgaaccggtatgctccaaggaatcagagaagccatggccccctatagggatttgcgatatgaaggttatacgttggagcaaatcatagattttggatatggagaggggagagtagcgaatacgttgtggaatggaaagcgaagactgtttaaaactacatttgatgcgtatatacgattagacgagagcgagcgagacaaaggtagtttcaaagtccccaaaggagtgcttccagtatcgagtattgatgtcgcgaaccgaatcgcggttgacaaaggattcgatacgcttatcgcggcaacggatggaagcgatttggctctgatcgacacgcacctttccggcgagaattcgactctcatcgctaactcgatgcacaacatggctattgggaccttgatacaacgagaagttgggaaggagcagccagggattcttactttcttatcggagcaatacgtgggagatgacacactgttttacacaaagctacacactacagatactaaggtttttgataaagtggcggcttcaatttttaatacagtggcgaagtgtggacatgaagcttcacctagtaagacaatgatgacgccatattctgtggagaagacccaaacgcatgcaaagcagggctgttacgtaccgcaagatcgtatgatgattatctcatcagaaaggaggaaggatatcgaggatgtgcaggggtacgtgcgttcgca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