一种嗜盐四联球菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种嗜盐四联球菌，以及其在提升酱油或酱中4-乙烯基愈创木酚含量、提高酱油香气及风味中的应用。

背景技术：

酱油是我国的传统发酵调味品，是一种以大豆、小麦、麸皮等为原料，由多种微生物共同作用经长期发酵而形成的具有独特风味的调味品。

4-乙烯基愈创木酚(4-vinylguaiacol，简称4vg)又名2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(2-methoxy-4-vinylphenol)、对乙烯基愈创木酚(4-hydroxy-3-methoxystyrene)，分子式c9h10o2，分子量150da，密度1.11×103kg/m3，熔点26℃～29℃，沸点100℃/667pa。系无色或淡黄色油状液体，呈发酵香气，略带甜味，微带酚的气息，是决定酒类、酱油、茶叶、咖啡、干酪等食品品位及质量的一个主要香味成分，同时还是日化、医药、香精合成等行业不可多得的高档香料之一，其天然品主要存在于玉米酒精发酵的挥发物中。4-乙烯基愈创木酚的感官阈值很低，仅为0.3mg/l。目前化学合成法是生产4-乙烯基愈创木酚的常用方法，随着人们对绿色产品要求的日益提高，利用为生物技术生产天然、安全、生产条件温和的4-乙烯基愈创木酚开始受到人们的重视。

目前已报道一些菌株能够产生4-乙烯基愈创木酚。例如，cn06883992公开了一株能在高粱糖化液培养基中生产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌；cn103789357提供了一株能在培养基中生产4-乙烯基愈创木酚的环状芽孢杆菌；cn102899212通过将枯草芽孢杆菌的padc基因转化至酵母菌株w303-1a中，从而提高啤酒中4-乙烯基愈创木酚的含量。

然而，目前对于能够直接应用在酱油中来提高4-乙烯基愈创木酚含量的安全菌未见报道。

技术实现要素：

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一种嗜盐四联球菌，其能够显著提升酱油或酱中的4-乙烯基愈创木酚含量，从而提高酱油或酱的香气及风味。基于这一发现，本发明人开发了新的用于制备酱油或酱的嗜盐四联球菌以及基于该菌株的制备酱油或酱的方法。

因此，在一个方面，本发明提供了一种嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)zf601，其于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc.no：60430，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

在另一个方面，提供了本发明的嗜盐四联球菌zf601在制备酱油或酱中的用途。

在另一个方面，提供了本发明的嗜盐四联球菌zf601用于提高酱油或酱中4-乙烯基愈创木酚含量的用途。

在另一个方面，本发明提供了一种提高酱油或酱中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，其包括在发酵酱醪之前或发酵酱醪过程中加入本发明的嗜盐四联球菌zf601。

在某些实施方案中，在发酵酱醪之前向成曲中加入所述嗜盐四联球菌zf601。

在某些实施方案中，在发酵酱醪之前或发酵酱醪的初期向酱醪中加入所述嗜盐四联球菌zf601。在某些实施方案中，所述发酵酱醪的初期是指将成曲与盐水混合后的0-5天，例如0-4天，例如0-3天，例如0-2天，例如0-1天。在本文中，表述“将成曲与盐水混合后的0天”是指将成曲与盐水混合后的当天。

在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：将成曲与盐水混合制成酱醪；将所述嗜盐四联球菌zf601添加到上述酱醪中；和使上述酱醪进行发酵。

在某些实施方案中，所述嗜盐四联球菌zf601的加入量为10⁶cfu/ml。

在某些实施方案中，使用高盐稀态发酵法对所述酱醪进行发酵。

在某些实施方案中，所述嗜盐四联球菌zf601经预培养。在某些实施方案中，所述预培养包含以下步骤：将所述嗜盐四联球菌zf601接种于mrs培养基并在厌氧条件下进行培养。在某些实施方案中，所述预培养包含以下步骤：将所述嗜盐四联球菌zf601接种于含有5％盐的mrs培养基，并在30-40℃(例如35-38℃；例如，36℃)的温度及厌氧条件下进行培养。

在另一个方面，本发明提供了一种制备酱油或酱的方法，其包括在发酵酱醪之前或发酵酱醪过程中加入本发明的嗜盐四联球菌zf601。

在某些实施方案中，在发酵酱醪之前向成曲中加入所述嗜盐四联球菌zf601。

在某些实施方案中，在发酵酱醪之前或发酵酱醪的初期向酱醪中加入所述嗜盐四联球菌zf601。在某些实施方案中，所述发酵酱醪的初期是指将成曲与盐水混合后的0-5天，例如0-4天，例如0-3天，例如0-2天，例如0-1天。在本文中，表述“将成曲与盐水混合后的0天”是指将成曲与盐水混合后的当天。

在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：将成曲与盐水混合制成酱醪；将所述嗜盐四联球菌zf601添加到上述酱醪中；和使上述酱醪进行发酵。

在某些实施方案中，所述嗜盐四联球菌zf601的加入量为10⁶cfu/ml。

在某些实施方案中，使用高盐稀态发酵法对所述酱醪进行发酵。

在某些实施方案中，所述嗜盐四联球菌zf601经预培养。在某些实施方案中，所述预培养包含以下步骤：将所述嗜盐四联球菌zf601接种于mrs培养基并在厌氧条件下进行培养。在某些实施方案中，所述预培养包含以下步骤：将所述嗜盐四联球菌zf601接种于含有5％盐的mrs培养基，并在30-40℃(例如35-38℃；例如，36℃)的温度及厌氧条件下进行培养。

在某些实施方案中，所述方法包含下列步骤中的一项或多项：

预处理豆类原料；

预处理淀粉质辅料；

将预处理后的豆类原料和淀粉质辅料混合，添加曲种，制备成曲；

将成曲和盐水混合制成酱醪；

发酵酱醪；

发酵完成后，从发酵产物中分离发酵完成的酱汁和/或酱醅；

对发酵完成的酱汁进行调配、杀菌、灌装或其任意组合，获得酱油；或者，对发酵完成的酱醅进行调配、杀菌、灌装或其任意组合，获得酱。

在另一个方面，本发明提供了一种酱油或酱，其由本发明的方法制备获得。

在本文中，所使用的技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

酱醪：成曲与盐水混合后形成的半流动状态混合物。

酱醅：成曲与盐水混合后因自然分层形成的多孔固态物，处于上层。

酱汁：成曲与盐水混合后因自然分层形成的液态物，处于下层。

在另一个方面，本发明提供了一种培养本发明的嗜盐四联球菌zf601的方法，其包括将所述嗜盐四联球菌zf601接种于mrs培养基并在厌氧条件下进行培养的步骤。在某些实施方案中，所述方法包括：将所述嗜盐四联球菌zf601接种于含有5％盐的mrs培养基，并在30-40℃(例如35-38℃；例如，36℃)的温度及厌氧条件下进行培养。

发明的有益效果

本发明的嗜盐四联球菌zf601能够显著提升酱油或酱中的4-乙烯基愈创木酚含量，从而提高酱油或酱的香气及风味，同时不影响酱油或酱中的原油总酸、氨基酸态氮等营养成分的含量。此外，本发明的嗜盐四联球菌zf601源自天然酱醅，无安全风险。经本发明的嗜盐四联球菌zf601发酵获得的发酵原油或酱香气和谐、风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久，无需对风味进行调配，天然健康。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1为嗜盐四联球菌zf601在含5％盐的mrs培养基上的菌落形态图。

图2为经嗜盐四联球菌zf601发酵获得的原油的质量分析图。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在广东省微生物菌种保藏中心(广州市先烈中路100号大院59号楼)进行保藏的生物材料：

嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)zf601，其具有保藏号gdmcc.no：60430，且保藏日期为2018年8月13日。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

实施例1.目的菌株的筛选

1、原材料的处理

取传统高盐稀态发酵工艺条件下发酵的180天的酱醪，加入0.85％的无菌生理盐水稀释至10⁴、10⁵、10⁶倍，制成酱醪稀释液，分别从各浓度稀释液中取0.2ml均匀涂布于含有5％食盐的mrs固体培养基平板上，36℃培养72h，挑选表面光滑、不透明、乳白色的小单菌落，接入含盐5％的mrs培养基中，培养于36℃。

2、菌株的初筛

将上一步所培养的菌落在含盐5％的mrs固体培养基上划线进行再次纯化，挑取单一菌落进行培养，成熟后进行保藏，分别命名为zf600～zf609，并经形态特征及基因鉴定确定为嗜盐四联球菌。将该10株菌接种于含盐5％的mrs液体培养基中36℃培养箱静态厌氧培养至对数生长期，并在发酵酱醪0～1天内接入，最终浓度为10⁶cfu/ml，按照传统高盐稀态发酵工艺进行发酵，即盐水配置浓度为18％～18.5％。成曲投入盐水时比例为成曲：盐水＝1:2，常温下发酵。

发酵至55d时，从各罐中取样进行常规理化指标总酸和氨基氮的检测，并通过gc-ms进行检测各组样品中4-乙烯基愈创木酚的含量进行分析，结果如表1所示。结果显示，经菌株zf601、zf602、zf605、zf609发酵后的原油质量正常，氨基氮、还原糖含量较高，且4-乙烯基愈创木酚含量高。

表1：发酵原油质量分析

3、菌株的复筛

将初筛过程中的菌株zf601、zf602、zf605、zf609于含盐5％的mrs液体培养基中重新活化，36℃培养箱静态厌氧条件下培养，在发酵酱醪初期(0～1天内)分别接种，最终接种量为10⁶cfu/ml，按照传统高盐稀态发酵工艺进行发酵。发酵结束后，取各组原油，由10名专业鉴评师进行感官分析，根据各样品的特征针对其香气、滋味、综合感受进行打分，满分为100分，得分越高表示喜爱度越高，结果如表2。结果显示，经zf601发酵的原油香气及滋味均显著优于其他嗜盐四联球菌。

备注：各项指标满分为100分，得分越高表示结果越好。

最终筛选出能够产生最优风味的嗜盐四联球菌zf601，其在含5％盐的mrs培养基上的菌落形态如图1所示，菌落细小，乳白色，呈圆形，直径1～2mm，菌落边缘整齐。菌株zf601经基因鉴定，其基因序列如seqidno:1所示。根据16srdna检测结果对比分析，菌种所测得的16s区序列与嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)相似度达到99％，可确定菌种为一株嗜盐四联球菌。

实施例2.嗜盐四联球菌zf601的效果验证

将通过筛选获得的嗜盐四联球菌zf601进行酱油生产放大实验，即活化zf601菌株于含盐5％的mrs液体培养基中，36℃培养箱静态厌氧培养至对数生长期，在酱醪发酵初期0～1天内接入zf601菌株，最终接种量为10⁶cfu/ml，同时将不接种该菌株的发酵罐作为对照组。发酵结束后，进行常规理化指标总酸和氨基氮的检测，并通过gc-ms检测各组样品中的4-乙烯基愈创木酚含量，结果如表3所示。

表3：发酵原油质量分析

根据表3可知，嗜盐四联球菌菌株zf601应用于酱油发酵中所获得的原油总酸、氨基酸态氮含量均与对照组无显著差异，而4-乙烯基愈创木酚的含量较对照组提高了2.73倍，效果显著。这一结果表明嗜盐四联球菌菌株zf601能够在保持优良酱油质量的同时显著提高4-乙烯基愈创木酚含量。

此外，由10名鉴评人员对两种原油进行感官评定，并对各样品的体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味以及综合口感进行评分，0～4分依次为不接受、接受、正常、满意、很满意，0.5分为一个级别。结果如图2及表4所示。结果显示，嗜盐四联球菌zf601发酵的原油具有香气浓郁、鲜甜突出、滋味醇厚持久的特征。因此，嗜盐四联球菌zf601特别适用于制备酱油或酱。

表4：发酵原油感官鉴评

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

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<110>广东海天创新技术有限公司

佛山市海天（高明）调味食品有限公司

佛山市海天调味食品股份有限公司

佛山市海天（江苏）调味食品有限公司

<120>一种嗜盐四联球菌及其应用

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<213>tetragenococcushalophilus

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