本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种检测白纹伊蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法。
背景技术：
：白纹伊蚊(aedesalbopictus)也被称为亚洲虎蚊，是一种攻击性很强的蚊子，同时也是一种重要的病毒传播媒介，可以传播多种病原体，包括登革热、寨卡等病毒。目前登革热和寨卡已成为全球范围内两个重要的虫媒传染病，严重性也在逐年增加。每年有多于5000万的人死于蚊媒病，目前还没有疫苗或特定治疗药物用于控制登革热和寨卡。传统的控制虫媒病的措施是使用化学杀虫剂减少传播载体蚊子的种群，但是对于控制虫媒病没有起到很好的效果。化学杀虫剂使蚊虫容易产生耐药性，对环境和公众健康带来很大的问题。目前，蚊类抗药性的检测方法，一致沿用1970世界卫生组织推荐的生物测定法，测出害虫对药剂的敏感毒力基线和ld50或lc50值。再从测试地区采集同种害虫种群，采用与测定敏感品系相同的生物测定方法和控制条件，得出待测种群的ld50或lc50值，以待测种群与民敏感种群品系的ld50或lc50值之间的比值来表示抗性水平。但该方法对所获得资料有严格的统计要求，必须严格控制实验条件，需反复多次实验，而且在实践中也显示出较明显的局限性。传统的生物测定法比较繁琐，从虫源、饲养到测定难于做到真正的标准化，而且由ld-p线求出的ld50或lc50值的重复性和精确性较低，当群体抗性较低和抗性种群多样时很难准确测定，因此测得的抗性水平往往具有滞后性，不适合早起抗性检测，不利于制定相应的防治对策。鉴于目前许多抗性对策依赖于抗性的早期检测，因此抗性监测与检测技术的研究尤为重要。随着抗性监测和检测目的的多元化，抗性监测手段和方法也朝着多元化方向发展。害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性机制了解的基础上建立起来的，即利用分子生物学技术检测杀虫剂作用靶标的抗性位点或解毒代谢酶基因的增强表达。基于可操作性、实用性和经济等方面的原因，目前几乎所有的抗性检测研究都集中于靶标抗性方面，即检测靶标基因的突变。kdr基因可以作为昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。多项数据表明发现lc50为代表的高效氯氰菊酯抗性与白纹伊蚊kdr等位基因频率之间存在正相关关系。研究说明kdr基因可以作为白纹伊蚊对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以预测抗性的发生和发展。技术实现要素：本发明提供了一种检测白纹伊蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法，可实现快捷、简便、灵敏、准确的监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，是一种准确、方便预测白纹伊蚊抗药性发生和发展的新方法。本发明的一个目的是提供一种检测白纹伊蚊抗药性基因突变的专用引物对，所述引物对由f和r组成，所述f具有序列表中seqid№：1所示核苷酸序列，所述r具有序列表中seqid№：2所示核苷酸序列。本发明的另一个目的是提供一种检测白纹伊蚊抗药性基因突变的探针，所述探针包括下述1)-6)中的至少一种：1)探针p1具有序列表中seqid№：3所示核苷酸序列；2)探针p2具有序列表中seqid№：4所示核苷酸序列；3)探针p3具有序列表中seqid№：5所示核苷酸序列；4)探针p1为将具序列表中seqid№：3所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加mgb基团、5’端标记fam发光基团后制备得到；5)探针p2为将具序列表中seqid№：4所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加mgb基团、5’端标记fam发光基团后制备得到；6)探针p3为将具序列表中seqid№：5所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加mgb基团、5’端标记vic发光基团后制备得到。本发明的再一个目的是提供一种检测白纹伊蚊抗药性基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的专用引物对和/或本发明所述的至少一种探针。具体的，所述试剂盒包括下述1)-3)中的至少一种：1)试剂a，所述试剂a包括本发明所述的专用引物对、本发明5)所述的探针p2和本发明6)所述的探针p3；2)试剂b，所述试剂b包括本发明所述的专用引物对、本发明4)所述的探针p1和本发明6)所述的探针p3；3)taqman反应缓冲液。本发明的再一个目的是提供一种检测或辅助检测白纹伊蚊中kdr基因的突变位点的方法，所述方法包括使用本发明所述的专用引物对、本发明所述的至少一种探针和/或本发明所述的至少一种试剂盒进行检测。具体的，所述方法包括：使用本发明所述的试剂a对待测白纹伊蚊进行taqmanpcr扩增反应，得到a反应产物；使用本发明所述的试剂b对待测白纹伊蚊进行taqmanpcr扩增反应，得到b反应产物；检测a反应产物和b反应产物：若a反应产物在fam和vic通道均无信号，且b反应产物仅在fam通道有信号，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点，突变位点所在位置的碱基为ttg/ttg；若a反应产物在fam通道有信号且在vic通道无信号，且b反应产物在fam和vic通道均无信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为l1014c，突变位点所在位置的碱基为tgt/tgt；若a反应产物在fam通道无信号且在vic通道有信号，且b反应产物仅在vic通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为l1014f，突变位点所在位置的碱基为ttt/ttt；若a反应产物在fam通道有信号且在vic通道无信号，且b反应产物仅在fam通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为l1014c，突变位点所在位置的碱基为ttg/tgt；若a反应产物在fam通道无信号且在vic通道有信号，且b反应产物在fam通道和vic通道均有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为l1014f，突变位点所在位置的碱基为ttg/ttt；若a反应产物在fam通道和vic通道均有信号，且b反应产物仅在vic通道有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为l1014f和l1014c；突变位点所在位置的碱基为ttt/tgt。再具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：1)所述taqmanpcr扩增反应的反应体系中，引物各自的终浓度均为9μm；2)所述taqmanpcr扩增反应的反应体系中，探针各自的终浓度均为5μm；3)所述taqmanpcr扩增反应的反应体系中，以待测白纹伊蚊的基因组dna为模板；4)所述taqmanpcr扩增反应的退火温度为60℃-65℃；优选退火温度为60℃。本发明的再一个目的是提供一种检测或辅助检测白纹伊蚊中kdr基因的基因型的方法，所述方法包括使用本发明所述的专用引物对、本发明所述的至少一种探针和/或本发明所述的至少一种试剂盒进行检测。具体的，所述方法包括：使用本发明所述的试剂a对待测白纹伊蚊进行taqmanpcr扩增反应，得到a反应产物；使用本发明所述的试剂b对待测白纹伊蚊进行taqmanpcr扩增反应，得到b反应产物；检测a反应产物和b反应产物：若a反应产物在fam和vic通道均无信号，且b反应产物仅在fam通道有信号，则所述kdr基因为不含或候选不含有所述突变位点的纯合型基因；若a反应产物在fam通道有信号且在vic通道无信号，且b反应产物在fam和vic通道均无信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点l1014c的纯合型基因；若a反应产物在fam通道无信号且在vic通道有信号，且b反应产物仅在vic通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点l1014f的纯合型基因；若a反应产物在fam通道有信号且在vic通道无信号，且b反应产物仅在fam通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点l1014c的杂合型基因；若a反应产物在fam通道无信号且在vic通道有信号，且b反应产物在fam通道和vic通道均有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点l1014f的杂合型基因；若a反应产物在fam通道和vic通道均有信号，且b反应产物仅在vic通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点l1014f和l1014c的杂合型基因。再具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：1)所述taqmanpcr扩增反应的反应体系中，引物各自的终浓度均为9μm；2)所述taqmanpcr扩增反应的反应体系中，探针各自的终浓度均为5μm；3)所述taqmanpcr扩增反应的反应体系中，以待测白纹伊蚊的基因组dna为模板；4)所述taqmanpcr扩增反应的退火温度为60℃-65℃；优选退火温度为60℃。本发明的还一个目的是提供本发明所述的专用引物对、本发明所述的至少一种探针、本发明所述的至少一种试剂盒、和/或本发明任一所述方法的应用。具体的，所述应用包括下述1)-3)中的至少一种：1)在检测白纹伊蚊中kdr基因突变位点中的应用；2)在检测白纹伊蚊抗药性中的应用；3)在制备检测白纹伊蚊抗药性产品中的应用。所述任一应用不包括专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。具体的，所述突变位点具体为l1014f或l1014c。具体的，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。具体的，所述试剂a和所述试剂b均为独立包装。具体的，所述专用引物对、探针p1、探针p2和探针p3均为独立包装。本发明的有益效果包括：本发明的实验证明，本发明提供了一种快捷、简便、灵敏的白纹伊蚊kdr突变等位基因检测引物、探针、试剂盒和方法，可用来掌握白纹伊蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况即监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以快捷、简便、灵敏、准确的预测抗性的发生和发展。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例及其具体说明用于解释和理解本发明，并不构成对本发明的不当限定。实施例1、引物和探针的设计1、引物及taqman-mgb探针设计针对抗性白纹伊蚊钠通道kdr的两种点突变三种等位基因的情况，根据序列特征，利用primerexpress2.0软件设计了三条探针，分别针对三种等位基因类型，为了提高退火温度，增加序列的特异性，在探针3’末端增加mgb基团提高探针序列的退火温度。在定量pcr仪的48孔板上，每个样本设计平行的两管扩增，第一管加探针p1、p3和非特异引物f及r，第二管加探针p2、p3和非特异引物f及r，按照abi7500fastreal-timepcr仪的操作规程，第一管的fam基团设计为棕色，vic基团设计为绿色，第二管的fam基团设计为红色，vic基团设计为绿色，运行结束后读取两管的扩增曲线，根据两管显示的颜色可以轻松读出扩增的等位基因类型，即检测l1014和l1014c等位基因的探针1和探针2在5’标记fam发光基团，检测l1014f等位基因的探针3在5’标记vic发光基团。检测时将第一管中的fam设为红色，第二管的fam设为棕色，vic均设为绿色。taqmanuniversalmastermix由taraka公司提供。探针1-3分别对应于tgt、ttg和ttt密码子。本实施例具体设计的引物及taqman-mgb探针如表1所示。表1名称序列tm值长度序列表中的编号f5’gatccagatcatgaacgatgcca3’58.423seqid№：1r5’cccgcagatgatgaagaacacg3’59.122seqid№：2p1fam5’caccacacagtttc3’mgb7014seqid№：3p2fam5’tcaccaccaagttt3’mgb69.614seqid№：4p3vic5’caccacaaagtttc3’mgb68.514seqid№：5表1中，探针p1、p2分别为将具序列表中seqid№：3、seqid№：4所示核苷酸序列的核苷酸3’末端增加mgb基团、5’端标记fam发光基团后制备得到。探针p3为将具序列表中seqid№：5所示核苷酸序列的核苷酸3’末端增加mgb基团、5’端标记vic发光基团后制备得到。2、反应体系设计为了即节约又能检测目的序列，设计了双管法来检测白纹伊蚊双突变等位基因，探针p2，p3和引物f及r组成一组，用来检测等位基因l(ttg)和f(ttt)；探针p1和探针p3及引物f、r组成一组，用来检测等位基因c(tgt)和f(ttt)突变。反应体系(1)a组：反应体系(2)b组：上述反应体系(1)a组和反应体系(2)b组中的，引物的终浓度均为9μm，探针的终浓度均为5μm。taqmanuniversalmastermix为5μl/10μl，购自takara公司。反应条件：实施例2、taqman-mgb探针检测白纹伊蚊钠通道三种突变类型的等位基因提取野外捕获的白纹伊蚊自然种群20个样品的基因组dna，得到编号为1-20的样品dna，将上述样品dna分别用实施例1设计的引物和探针、按照实施例1的反应体系、反应条件进行双管同时进行a组和b组的taqmanpcr检测。l1014f为在kdr基因的第1014位氨基酸的等位基因含有ttt；l1014c为在kdr基因的第1014位氨基酸的等位基因含有tgt；若第一管中无fam基团、vic基团信号，且第二管中仅有fam基团信号，则样品为l1014纯合子，突变位点碱基为ttg；若第一管中有fam基团、无vic基团信号，且第二管中无fam基团和vic基团信号，则样品为l1014c纯合子，碱基为tgt；若第一管中无fam基团、有vic基团信号，且第二管中只有vic基团信号，则为则样品为l1014f纯合子，突变位点碱基为ttt；若第一管中有fam基团、无vic基团信号，且第二管中有fam基团、无vic基团信号，则样品为l1014c杂合子，突变位点碱基为ttg/tgt；若第一管中无fam基团、有vic基团信号，且第二管中有fam基团和vic基团信号，则样品为l1014f杂合子，突变位点碱基为ttg/ttt；若第一管中有fam基团和vic基团信号，且第二管中只有vic基团信号，则样品为l1014f和l1014c突变，突变位点碱基为ttt/tgt。检测结果如下表2所示。表2为taqman-mgb探针平行双管法对白纹伊蚊kdr基因突变等位基因分型结果。表2注：第一管tgt密码子用fam1标记为红色，ttt密码子用vic标记为绿色；第二管ttg密码子用fam2标记为综色，ttt密码子用vic2标记为绿色。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。序列表<110>宁波国际旅行卫生保健中心<120>一种检测白纹伊蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gatccagatcatgaacgatgcca23<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cccgcagatgatgaagaacacg22<210>3<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3caccacacagtttc14<210>4<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tcaccaccaagttt14<210>5<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5caccacaaagtttc14当前第1页12