本发明涉及基因载体
技术领域：
：，尤其是一种具有ccdb负筛作用的菌株及其构建方法。
背景技术：
：：neb商业化的stable菌株与目前公司常用的stbl3菌株相比，具有很多优点：1.感受态转化效率高达1～3×109cfu/μg；2.适用于逆转录病毒/慢病毒载体克隆的克隆；3.适用于克隆一些困难片段，如直接重复或反向重复序列的克隆；4.可减少克隆dna的随机重组几率(reca1)；5.适用于真核生物来源的甲基化dna或pcr来源的非甲基化dna、cdna的高效转化；6.失活非特异性核酸内切酶i(enda1)，以获得高质量的质粒制备物；7.具有对噬菌体t1的抗性；8.适用于蓝白斑筛选。ccdb是一种自杀基因，对于不含gyra462或者ccda基因的普通克隆菌株如top10、stbl3、dh5a等具有致死作用，故只能存在于ccdbt1survivalt1、t2或者db3.1(gyra462)等菌株中。基于该特性，ccdb作为一种高效的负筛基因被广泛应用于基于gateway和goldengate技术的载体构建中。在这些骨架载体中，ccdb和氯霉素基因位于gateway和goldengate载体的克隆位点之间，当ccdb和氯霉素基因被目的序列取代后，正确质粒可在普通克隆菌株中进行复制，而未能与目的序列反应的骨架载体则会使菌株死亡，故而lb平板上长出来的都是阳性克隆，阳性率可达到100﹪。stable菌株作为一种具有高效感受效率及对复杂不稳定序列具有天然耐受性的菌株，在实际应用中能够很好的解决一些困难项目，提高生产效率。然而由于stable菌株的f因子中包含tn10(tetr)转座子，其中的ccda和tetr基因分别赋予菌株产生对ccdb致死基因和四环素的抗性，所以对转化到其中的四环素抗性载体或者基于ccdb负筛的载体构建不能起到筛选的效果，lb板上长出来的基本是背景克隆，导致阳性率低下，甚至无法筛选出阳性克隆。f质粒(fplasmid)，又称为f因子或致育因子，是一类存在于大肠杆菌等细菌中的单拷贝接合型质粒，通常为100多kb。带有f质粒的细胞为雄性细胞，与之对应的不含f质粒的为雌性细胞，雄性细胞可通过性菌毛介导的接合过程将f质粒转移到雌性细胞中，从而使雌性细胞转变为雄性细胞。该质粒以整合或游离的形式存在于菌株中，其中携带的特定基因能够改变菌株的特性。鉴于f质粒比较大，用常规的构建方法根本无法完成对其的改造，故在本发明中特引入一种基于rac噬菌体rece/rect或λ噬菌体redα/redβ/redγ的大肠杆菌体内dna同源重组系统--red/et同源重组技术。该技术的特点是在同源重组酶大量表达的情况下，两端带有50bp同源臂的目的序列可与靶同源区域产生同源重组反应，从而产生预期的特定位点缺失、插入、点突变等。pred/et(购自生物公司)是一种温度敏感型的同源重组酶表达载体，当温度为30℃时，可稳定存在于大肠杆菌中，当温度上升到37℃时，则会逐渐丢失。该载体另外一个重要成分包含pbad启动子及其下游与重组相关的三种重组酶表达基因。pbad启动子是一种l-阿拉伯糖诱导型的启动子，在l-阿拉伯糖存在的情况下，可诱导涉其下游三个重组蛋白的表达，从而引发重组反应。整个同源重组过程主要由三种蛋白来协同完成，redα蛋白来源于λ噬菌体,具有5’-3’核酸外切酶活性，可从5’到3’方向降解携带同源臂的双链外源dna的其中一条链，从而暴露出3’突出末端。redβ是一种退火蛋白，可结合到3’突出末端上，对该末端进行保护，同时可介导同源臂与骨架载体同源区域的重组。redγ蛋白可与大肠杆菌内源性的recbcd核酸外切酶结合，防止其对进入大肠杆菌中的外源dna进行降解。然而，redα在提高重组率的同时，对靶载体造成的非特异性切割会导致分子内大片段重排机会大大增加，从而使背景克隆增加，导致pcr阳性率不足1％。flpe是一种来源于酵母的dna位点特异性重组酶，由423个氨基酸组成的单体蛋白，其识别位点frt包括两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8bp的核心序列。flpe重组酶在没有其他辅助因子的条件下，可对重组酶特异识别位点frt之间的基因片段进行置换、倒置和删除等操作。707-flpe(购自生物公司)是一种温度敏感型的位点特异性flpe重组酶表达质粒，该载体中的重组酶基因由λr启动子驱动表达，并受到温度依赖型ci857阻遏物的调控，在30℃时该载体可稳定存在于大肠杆菌中。当温度从30℃上升到37℃时，flpe重组酶会产生短暂表达，同时由于该载体采用的是psc101ori复制起始点，导致其自身在37℃时会停止复制，从而随着大肠杆菌的复制而逐渐丢失。技术实现要素：基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有ccdb负筛作用的菌株及其构建方法，采用本发明的构建方法所得菌株适用于复杂片段的克隆。为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：在第一个方面，本发明提供了一种具有ccdb负筛作用的菌株，所述菌株为去掉了f因子中ccda基因和tetr基因的stable菌株。优选地，所述ccda基因和tetr基因由frt位点代替；更优选地，所述frt位点只有1个。需要说明的是，仅仅在同源重组区域留下了一个frt位点，该位点的残留并不会对菌株产生任何不良影响。在第二个方面，本发明提供了第一个方面所述具有ccdb负筛作用的菌株构建方法，包括以下步骤：(1)利用red/et同源重组技术将stable菌株中f因子上的ccda和tetr基因替换为frt-kancassette-frtdna序列，得到基因编辑后的f因子；(2)提供表达flp重组酶的质粒，通过所述质粒表达的flp重组酶介导重组反应，删除所述基因编辑后的f因子上两个frt位点中间的外源序列(即kancassette)，即得所述具有ccdb负筛作用的菌株。需要说明的是，构建的菌株为大肠杆菌克隆菌株nebstable(△ccda/b)，该菌株具有ccdb负筛作用，可应用于基于gateway和goldengate技术的载体构建；通过该构建方法所得菌株不具有ccdb及四环素抗性，同时能够稳定复制含有重复序列等复杂片段。优选地，所述red/et同源重组技术通过删除了redα基因的pred/et载体实现。需要说明的是，所述步骤(1)中同源重组技术是一种基于rac噬菌体rece/rect或λ噬菌体redα/redβ/redγ的大肠杆菌体内dna同源重组系统--red/et同源重组技术，该同源重组技术采用pred/et载体实现。优选地，所述pred/et载体中redβ基因的碱基序列经过优化，优化后的redβ基因的碱基序列如seqidno.1所示。优选地，所述pred/et载体中redγ基因的碱基序列经过优化，优化后的redγ基因的碱基序列如seqidno.2所示。需要说明的是，pred/et(购自生物公司)是一种温度敏感型的同源重组酶表达载体，通过删除red/et载体中的redα基因，并优化redβ和redγ基因序列，使得重组阳性克隆正确率提高到了接近100％，极大地提高了工作效率。优选地，所述表达flp重组酶的质粒为707-flpe。应当说明的是，flp重组酶由质粒707-flpe表达，707-flpe(购自生物公司)是一种温度敏感型的位点特异性flpe重组酶表达质粒。优选地，所述pred/et载体中四环素抗性基因替换为amp抗性基因。优选地，所述707-flpe质粒中四环素抗性基因替换为amp抗性基因。综上所述，本发明的有益效果为：本发明提供一种改良型的大肠杆菌克隆菌株，具有ccdb负筛作用，可应用于基于gateway和goldengate等技术的载体构建，该菌株对重复序列等复杂片段具有良好的稳定复制能力。附图说明图1为pred/et(δα-amp)载体图谱；图2为707-flpe(amp)载体图谱；图3本发明改良型菌株构建方法的流程示意图；图4为pdonr221转化stable和nebstable(△ccda/b)菌落生长状态图。具体实施方式由于stable具有其明显的缺陷：该菌株的f因子中包含tn10(tetr)转座子，其中的ccda和tetr基因分别赋予菌株产生对ccdb致死基因和四环素的抗性，该菌株显然不能应用于骨架载体包含ccdb和四环素抗性基因的克隆反应的，这就大大限制了其在载体构建中的应用范围。为了克服这一缺陷，本发明提供一种改良型的大肠杆菌克隆菌株nebstable(△ccda/b)的构建方法，首先利用同源重组的方法删除掉该菌株中f因子上的ccda和tetr基因，以获得不具有ccdb及四环素抗性，同时能够稳定复制含有重复序列等复杂片段的改良型菌株。在一些实施例中，本发明首先利用red/et同源重组技术将菌株中f因子上的的ccda和tetr基因替换为frt-kancassette-frt，再通过flp重组酶介导的位点特异性重组反应删除两个frt中间的外源序列(即frt之间的kancassette)，仅仅在同源重组区域留下了一个frt位点，该位点的残留并不会对菌株产生任何不良影响；在一些实施例中，本发明通过删除red/et载体中的redα基因，并优化redβ和redγ基因序列，使得重组阳性克隆正确率提高到接近100％，极大地提高了工作效率。为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂或载体均从市场或其它公共渠道获得，例如慢病毒骨架载体plv和腺相关病毒骨架载体paav；在本发明的实施例中，一些常规的分子生物学实验并未列出详细步骤以节省篇幅，本领域普通技术人员基于实施例中的数据，根据本领域公知常识即可完成这些分子生物学常规操作，不需要付出创造性劳动，例如菌株感受态的制备、转化、gibson反应等。实施例1本发明的具有ccdb负筛作用的菌株的构建方法的一种实施例，包括以下步骤：1.将构建该菌株过程中需要用到重组酶表达质粒进行改造：将pred/et载体(购于生物公司)中的redα基因删除，并根据不同物种间的密码子偏好性，针对redβ和redγ基因序列进行了密码子优化(优化后的redβ和redγ基因碱基序列如seqidno.1和2所示)，优化后的redγ基因序列如下：优化后的redβ基因序列如下：得到优化改良的pred/et(δα)载体，使其在大肠杆菌能获得更好的表达，进一步使重组过程中产生的非特异性分子内重组率显著降低，从而达到提高特异性重组效率的目的。同时，由于需要改造的菌株具有四环素抗性，故将pred/et(δα)和707-flpe(购于生物公司)重组酶表达质粒上的四环素抗性替换为amp抗性，从而构建出pred/et(δα-amp)和707-flpe(amp)，其结构示意图如图1和图2所示。2.将优化的pred/et(δα-amp)电转到stable感受态细胞中(该菌株本身含有四环素tc和链霉素str抗性)，加入soc培养基于30℃复苏培养1小时。3.复苏培养产物涂布到含有amp+str的lb板上，30℃培养两天，挑克隆pcr鉴定出含有pred/et(δα-amp)质粒的阳性克隆。4.挑取阳性克隆接种到含有amp+str抗性的lb液体培养基中30℃过夜培养。5.将步骤4中得到的阳性克隆菌加入l-阿拉伯糖诱导表达同源重组酶并制备成感受态细胞，将带同源臂的kan抗性表达盒pcr产物frt-kancassette-frt电转入其中进行重组反应。6.复苏培养产物涂布到含有kan+str的lb板上，37℃过夜培养，挑克隆pcr鉴定出重组阳性克隆。7.将步骤6中得到的阳性克隆分别接种到含有kan+str和tc+str的液体lb培养基中于37℃过夜培养，其中在kan+str抗性培养基中生长，而在tc+str抗性培养基中不能生长的克隆即为目的阳性克隆。8.将707-flpe(amp)电转到步骤7获得的阳性菌株感受态细胞中，加入soc培养基于30℃复苏培养1小时。9.将步骤8中复苏培养产物涂布到含有amp+str的lb板上，30℃培养两天。分别挑取几个克隆加入到含有str抗生素的lb培养液中，30℃培养2～3h。10.将步骤9中复苏培养产物在含有str抗生素的lb板上划线，37℃过夜培养。11.挑几个单克隆分别加入到分别含有kan+str、tc+str、str的3种lb液体中，37℃过夜培养。12.取在含kan+str和tc+str抗生素的lb中不长，而在含str的lb液体中生长的克隆进行pcr鉴定。pcr阳性克隆即为改造后f因子中不含ccda和tetr基因的改良型菌株nebstable(△ccda/b)(即本发明的具有ccdb负筛作用的菌株)。13.功能验证：a.将包含ccdb-cm表达盒的gateway或goldengate骨架载体转化到该改良型菌株感受态，并以改良前的菌株感受态做比较，结果发现转化后，前者几乎不长克隆，而后者长出密密麻麻的克隆，这说明该菌株改造成功，具有ccdb负筛作用；b.将含有高度重复序列的片段进行克隆，该菌株具有克隆复杂片段的能力。实施例2取gateway系统中的入门克隆pdonr221转化stable和实施例1构建的nebstable(△ccda/b)，该载体包含骨架的kan抗性基因、两个attp位点及两者中间的氯霉素(chl或cm)和ccdb基因。由图4可知，pdonr221在转化stable后的平板中长出密密麻麻的克隆菌，而转化改良型菌株nebstable(△ccda/b)后的平板则没有克隆长出来，这直接验证了如下结论：ccdb基因对nebstable(△ccda/b)菌株具有致死效应，因此，nebstable(△ccda/b)可直接应用于基于gateway和goldengate技术的载体构建中。实施例3为了验证实施例1构建的菌株改造后对复杂重复序列及高gc含量序列依然具有良好的稳定复制能力，故利用具有复杂序列而较不稳定的慢病毒骨架载体plv和腺相关病毒骨架载体paav(骨架本身也含有重复序列)分别与高gc含量片段a(碱基序列如seqidno.3所示，gc含量接近80％)和多重复序列片段b(碱基序列如seqidno.4所示)进行gibson反应(反应体系参见表2)，分别转化具有相同感受态效率的对照菌株dh5a、stbl3和测试菌株nebstable(△ccda/b)，然后对lb板上的克隆进行pcr鉴定，即在骨架上，需要克隆的片段的两端设计引物进行pcr鉴定，其中，pcr扩增涉及的引物序列如表3所示；pcr反应体系及程序如表4所示。结果如表1所示，相较于dh5a和stbl3菌株，nebstable(△ccda/b)菌株对片段a和b具有更优越的稳定复制能力。表1菌株克隆复杂片段的阳性率表2gibson反应体系表3pcr鉴定引物序列表4pcr反应体系及程序最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。sequencelisting<110>云舟生物科技(广州)有限公司<120>一种具有ccdb负筛作用的菌株及其构建方法<130>2018<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>417<212>dna<213>人工序列<400>1atggatattaacaccgaaaccgaaattaaacagaaacatagcctgaccccgtttccggtg60tttctgattagcccggcgtttcgcggccgctattttcatagctattttcgcagcagcgcg120atgaacgcgtattatattcaggatcgcctggaagcgcagagctgggcgcgccattatcag180cagctggcgcgcgaagaaaaagaagcggaactggcggatgatatggaaaaaggcctgccg240cagcatctgtttgaaagcctgtgcattgatcatctgcagcgccatggcgcgagcaaaaaa300agcattacccgcgcgtttgatgatgatgtggaatttcaggaacgcatggcggaacatatt360cgctatatggtggaaaccattgcgcatcatcaggtggatattgatagcgaagtgtaa417<210>2<211>786<212>dna<213>人工序列<400>2atgagcaccgcgctggcgaccctggcgggcaaactggcggaacgcgtgggcatggatagc60gtggatccgcaggaactgattaccaccctgcgccagaccgcgtttaaaggcgatgcgagc120gatgcgcagtttattgcgctgctgattgtggcgaaccagtatggcctgaacccgtggacc180aaagaaatttatgcgtttccggataaacagaacggcattgtgccggtggtgggcgtggat240ggctggagccgcattattaacgaaaaccagcagtttgatggcatggattttgaacaggat300aacgaaagctgcacctgccgcatttatcgcaaagatcgcaaccatccgatttgcgtgacc360gaatggatggatgaatgccgccgcgaaccgtttaaaacccgcgaaggccgcgaaattacc420ggcccgtggcagagccatccgaaacgcatgctgcgccataaagcgatgattcagtgcgcg480cgcctggcgtttggctttgcgggcatttatgataaagatgaagcggaacgcattgtggaa540aacaccgcgtataccgcggaacgccagccggaacgcgatattaccccggtgaacgatgaa600accatgcaggaaattaacaccctgctgattgcgctggataaaacctgggatgatgatctg660ctgccgctgtgcagccagatttttcgccgcgatattcgcgcgagcagcgaactgacccag720gcggaagcggtgaaagcgctgggctttctgaaacagaaagcggcggaacagaaagtggcg780gcgtaa786<210>3<211>1143<212>dna<213>人工序列<400>3cagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgagg60ggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaa120agtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggc180gggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgcc240gcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggccctt300ctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgc360gtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtg420cgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtg480agcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcgg540ccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggg600gtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccc660tgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacgg720ggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcg780gggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcg840ccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgaga900gggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgcc960gcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcg1020gggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggct1080gtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggc1140gtg1143<210>4<211>1889<212>dna<213>人工序列<400>4cactagaagctttattgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagtgcttc60tgacacaacagtctcgaacttaagctgcagtgactctcttaaggtagccttgcagaagtt120ggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaat180agaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttcggtcgactagggataacag240ggtaattgtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaa300cacttgctgggattacttcgacttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgct360gttgacagtgagcgacgacgtaaacggccacaagtttagtgaagccacagatgtaaactt420gtggccgtttacgtcgctgcctactgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaatt480atcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaa540ttaaaatggtataaattaaatcacttttttcaattcggcgctagctgctgatatcgcata600cgcgtctgattgcgtaaccggtaaattagggataacagggtaattgtttgaatgaggctt660cagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcgac720ttcttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgcacgtcta780tatcatggccgacatagtgaagccacagatgtatgtcggccatgatatagacgtttgcct840actgcctcggacttcaaggggctagaattcgagcaattatcttgtttactaaaactgaat900accttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaattaaatc960acttttttcaattcggcgctagctgctgatatcgcatacgcgtgagatctt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