一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法与流程

文档序号：16776472发布日期：2019-02-01 18:45阅读：245来源：国知局

本发明涉及戊二酸制备技术领域，具体涉及一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法。

背景技术：

戊二酸，别名：胶酸，α，γ一丙烷二竣酸，1，3一丙二竣酸，分子式为c5h8o4，是一种重要的有机化工原料和中间体，在化学、建筑、医药、农业等方面具有广泛的应用。在塑料工业中，戊二酸及其戊二酸烷基酯类主要作为增塑剂的中间体，是聚氯乙烯、聚酯、聚酰胺以及聚氯乙烯的聚酯增塑剂的组成成分。在医药方面，戊二酸主要用于合成戊二酸酐，而戊二酸酐又可以作为很多药物的中间体，可用于合成新一代降血脂类药匹伐他汀和瑞舒伐他汀钙片。由于其良好的广谱杀菌能力，可以用来合成各种杀菌消毒洗液和医用药品等等。戊二酸也可合成液态聚酯，用于改良pet纤维的分子结构，从而改进pet纤维的染色性，提高上染率。利用戊二酸配制粘合剂可广泛粘接纺织品、金属等。此外，戊二酸或其酯也可用于聚酯多醇的合成、去垢剂的配制、含硫等烟道气的洗涤。

合成戊二酸的传统方法有回收法，化学合成法。回收法生产戊二酸主要依赖从己二酸的副产物中分离提纯，此法操作繁琐流程长，回收率低且不稳定。合成法主要有环戊酮液相氧化法、，γ-丁内酯法、二氢吡喃法和戊二腈法。合成法大多原料昂贵不易得，试剂毒性大污染环境，产品收率低，合成路线复杂等缺点。

sijaepark等人采用过表达了davab和gabdt的重组e.coliwl3110菌株，在含有赖氨酸，葡萄糖和α-酮戊二酸的培养基里共同发酵生产了1.7g/l戊二酸。此法发酵周期长且转化率低，且需要添加昂贵的α-酮戊二酸作为氨基受体，大大增加了生产成本。

jia-leyu等人采用过表达了hgdh,、gctab、hgdabc、ter和tesb的重组e.coli菌株，以α-酮戊二酸为底物厌氧培养得到了3.8mg/l戊二酸。此法反应体系复杂，原料昂贵且有副产物生成，戊二酸摩尔收率低。

经检索，一种经济高效的双细胞耦合生产戊二酸的方法尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，该方法简单，催化效果好，且中间产物少。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建重组菌株e.colibl-22ab和e.colibl-ydt；

步骤2，选取重组菌株e.colibl-22ab和e.colibl-ydt混合后，催化l-赖氨酸反应生产戊二酸。

作为改进的是，步骤1中重组菌株e.colibl-22ab和e.colibl-ydt的构建方法，包括以下步骤：第一步，提取重组质粒pet22b–davba和pacyc-gabtd，并以酶切位点ndei进行酶切验证；第二步，将第一步中验证无误的重组质粒pet22b–davba导入e.colibl21（de3），得到重组菌株e.colibl-22ab；第三步，将第一步中验证无误的重组质粒pacyc-gabtd导入e.colibl21（de3）中，得到重组菌株e.colibl-ydt。

作为改进的是，步骤2中重组菌株e.colibl-22ab和e.colibl-ydt的od比例为1：3。

作为改进的是，步骤2中催化l-赖氨酸反应的温度为37℃，转速为200rpm。

作为改进的是，步骤2中催化l-赖氨酸反应的ph为7.4。

作为改进的是，步骤2中催化l-赖氨酸反应中还包括cu²⁺。

作为改进的是，步骤2中催化l-赖氨酸反应的底物浓度为20g/l。

有益效果：

与现有技术相比，本发明公开了一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，通过将davab和gabdt分开表达在两个细胞中，利用双细胞耦合催化生产的方式，使得中间产物5-氨基戊酸的积累减少，终产物戊二酸的产量提高。相比于将davab和gabdt共表达在一个细胞中，戊二酸的摩尔收率提高了19.2%。

其次，通过对细胞比例的优化，解决了中间产物5-氨基戊二酸的积累问题，使得戊二酸的产量有了一定的提升，再者通过对催化体系的优化，筛选出最适温度，最适ph以及cu²⁺,对酶的活性有进一步的提升。最后通过分批补料解决底物l-赖氨酸对酶活的抑制，最终得到了高效产戊二酸的方法。

附图说明

图1为e.colibl-22ab-ydt细胞od600=20单细胞与不同浓度l-赖氨酸的情况下催化产物的情况，（a）为戊二酸，（b）为底物l-赖氨酸，α-酮戊二酸以及中间产物5-氨基戊酸；

图2为e.colibl-22ab细胞od600=20与e.colibl-22ab-ydt细胞od600=20在浓度为20g/l的l-赖氨酸下催化情况，5-氨基戊酸的积累情况；

图3为e.colibl-ydt细胞od600=20与e.colibl-22ab-ydt细胞od600=20在5-氨基戊酸15g/l，α-酮戊二酸30g/l时，戊二酸的积累情况；

图4为e.colibl-22ab细胞od600=10，e.colibl-ydt细胞od600=10双细胞耦合催化与e.colibl-22ab-ydt细胞od600=20单细胞催化，在l-赖氨酸20g/l时戊二酸的积累情况；

图5为e.colibl-22ab细胞od600=10，e.colibl-ydt细胞od600=10，初始赖氨酸20g/l，多次补加赖氨酸高浓度母液后戊二酸和5-氨基戊酸的积累情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的发明方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。

实施例1重组菌株e.colibl-22ab-ydt的构建

（1）重组质粒pet22b–davba和pacyc-gabtd由本实验提供，质粒提取使用tiangen公司的质粒小提试剂盒进行质粒提取；

（2）将提取出来的重组质粒pet22b–davba和pacyc-gabtd以酶切位点ndei经相对应的快速内切酶以最适温度酶切30min；

（3）将（2）中的转化液取微量进行琼脂糖凝胶电泳验证，电压80v-120v，电泳15-30min，结束后，在透射紫外灯下观察成像；

（4）将（3）中验证无误的重组质粒pet22b–davba导入e.colibl21（de3）中，并涂布在含有100mg/l氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株e.colibl-22ab；

（5）将（3）中验证无误的重组质粒pacyc-gabtd导入e.colibl21（de3）中，并涂布在含有35mg/l氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株e.colibl-ydt；

（6）将（3）中验证无误的重组质粒pet22b–davba和pacyc-gabtd共同导入e.colibl21（de3），并涂布在含有100mg/l氨苄青霉素抗性和35mg/l氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株e.colibl-22ab-ydt。

实施例2

在大肠杆菌中共表达davba和gabdt催化生产戊二酸

（1）从实施例1中的平板上挑取重组菌株e.colibl-22ab-ydt的单菌落接种到含有100mg/l氨苄青霉素抗性和35mg/l氯霉素抗性的5mllb摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有100mg/l氨苄青霉素抗性和35mg/l氯霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至od600=0.6，加入0.5mmol的iptg，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株e.colibl-22ab-ydt的细胞，将其作为催化剂，4℃保存；

（2）将（1）中收集好的细胞用ph7.0的pbs重悬并浓缩共同加入到催化体系，使体系中e.colibl-22ab-ydt的细胞od600为20，并加入配制好的ph7.0的l-赖氨酸母液和α-酮戊二酸母液，改变体系中l-赖氨酸的终浓度，依次为10g/l、20g/l、30g/l、60g/l和80g/l（l-赖氨酸和α-酮戊二酸的摩尔比为1：1）；

（3）催化反应体系在37℃，转速200rpm条件下进行，并定期取样（样品12000rpm，离心2min），并用液相检测戊二酸的生成情况和5-氨基戊酸的积累情况。

其中戊二酸的检测方法为色谱柱：bio-radaminexhpx-87h(300mm*7.8mm)，柱温：55°c，流动相：8mmh2so4，流速：0.6ml/min，检测器：紫外。5-氨基戊酸的检测方法为色谱柱：gracec18（5ul，5μm，4.6mm×25mm），柱温：28.5ºc，流动相：0.7%（v/v）三氟乙酸水溶液，流速：1ml/min，检测器温度：115ºc，载气：氮气（纯度99.9%），载气流速：3.2l/min，检测器：蒸发光散射检测器（elsd）；

（4）经检测，当l-赖氨酸浓度为60g/l时，戊二酸产量最高为22.2g/l，当l-赖氨酸浓度为20g/l时，戊二酸摩尔收率最高仅为75.9%，在l-赖氨酸浓度增加至80g/l时，摩尔收率低至26.1%，且不论l-赖氨酸初始浓度如何，中间产物5-氨基戊酸都大量积累。见图1。

实施例3

双细胞耦合催化与单细胞催化生产戊二酸的对比

（1）从实施例1中的平板上挑取重组菌株e.colibl-22ab的单菌落接种到含有100mg/l氨苄青霉素抗性的的5mllb摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有100mg/l氨苄青霉素抗性的的100ml摇瓶里，37℃培养至od600=0.3，加入1mmol的iptg，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株e.colibl-22ab的细胞，将其作为催化剂，4℃保存；

（2）从实施例1中的平板上挑取重组菌株e.colibl-ydt的单菌落接种到含有35mg/l氯霉素抗性的5mllb摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有35mg/l氯霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至od600=1.0，加入0.5mmol的iptg，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株e.colibl-ydt的细胞，将其作为催化剂，4℃保存；

（3）从实施例1中的平板上挑取重组菌株e.colibl-22ab-ydt的单菌落接种到含有100mg/l氨苄青霉素抗性和35mg/l氯霉素抗性的5mllb摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有100mg/l氨苄青霉素抗性和35mg/l氯霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至od600=0.6，加入0.5mmol的iptg，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株e.colibl-22ab-ydt的细胞，将其作为催化剂，4℃保存；

（4）将（1）中收集好的细胞用ph7.0的pbs重悬并浓缩加入到催化体系，使体系中e.colibl-22ab的细胞od600为20，并加入配制好的ph7.0的l-赖氨酸母液，使体系中l-赖氨酸的终浓度为20g/l。将（3）中收集好的细胞用ph7.0的pbs重悬并浓缩加入到催化体系，使体系中e.colibl-22ab-ydt的细胞od600为20，并加入配制好的ph7.0的l-赖氨酸母液，使体系中l-赖氨酸终浓度都为20g/l；

（5）将（2）中收集好的细胞用ph7.0的pbs重悬并浓缩加入到催化体系，使体系中e.colibl-ydt的细胞od600为20，并加入配制好的ph7.0的α-酮戊二酸母液和5-氨基戊酸，使体系中α-酮戊二酸母液和5-氨基戊酸的终浓度分别为30g/l和15g/l；

（6）将（3）中收集好的细胞用ph7.0的pbs重悬并浓缩加入到催化体系，使体系中e.colibl-22ab-ydt的细胞od600为20，并加入配制好的ph7.0的α-酮戊二酸母液和5-氨基戊酸，使体系中α-酮戊二酸母液和5-氨基戊酸的终浓度分别为30g/l和15g/l；

（7）使得（4）和（5）中的催化反应都在在37℃，转速200rpm条件下进行，并定期取样（样品12000rpm，离心2min），并用液相检测戊二酸的生成情况和5-氨基戊酸的积累情况；

经检测，20g/ll-赖氨酸浓度下，e.colibl-22ab积累了14.18g/l5-氨基戊酸而e.colibl-22ab-ydt仅积累了11g/l5-氨基戊酸。15g/l5-氨基戊酸浓度下，e.colibl-ydt积累了15.32g/l戊二酸，而e.colibl-22ab-ydt仅积累了10.36g/l戊二酸。见图2和图3。

实施例4

双细胞耦合催化与单细胞催化生产戊二酸的对比

（1）按照实施例3中（1），（2），（3）收集细胞，作为催化剂，4℃保存；

（2）将按照实施例3中（1）和（2）收集好的细胞用ph7.0的pbs重悬并浓缩共同加入到催化体系，使体系中e.colibl-22ab和e.colibl-ydt的细胞od600都为10，并加入配制好的ph7.0的l-赖氨酸母液和α-酮戊二酸母液，使体系中l-赖氨酸和α-酮戊二酸的终浓度都为20g/l。将按照实施例3（3）中收集好的细胞用ph7.0的pbs重悬并浓缩加入到催化体系，使体系中e.colibl-22ab-ydt的细胞od600为20，并加入配制好的ph7.0的l-赖氨酸母液和α-酮戊二酸母液，使体系中l-赖氨酸和α-酮戊二酸的终浓度都为20g/l；

（3）催化反应体系在37℃，转速200rpm条件下进行，并定期取样（样品12000rpm，离心2min），并用液相检测戊二酸的生成情况和5-氨基戊酸的积累情况；

经检测，重组菌株e.colibl-22ab和重组菌株e.colibl-ydt双细胞耦合催化生产戊二酸与重组菌株e.colibl-22ab-ydt单细胞催化生产戊二酸相比，降低了中间产物5-氨基戊酸的积累，并且提高了戊二酸的产量，双细胞体系下，最终戊二酸积累了17.18g/l，见图4。

实施例5

双细胞耦合催化生产戊二酸催化温度条件优化