一种HLA-0201限制性PADI4表位多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种hla-0201限制性padi4表位多肽及其应用。
背景技术：
：在哺乳动物中，肽基精氨酸去亚胺基酶家族一共有5个成员，分别是padi1、2、3、4和6，它们都具有去亚胺基酶活性，能以依赖于ca2+离子的方式将精氨酸转化为瓜氨酸，其中padi1、2、3和6主要分布在细胞质中，而padi4在n端含有核定位信号，主要分布于细胞核中，这也是它参与组蛋白修饰的前提条件，padi4另一个不同之处在于它能够将单甲基化的精氨酸转化为瓜氨酸，多余的亚胺基和甲基以氨基甲烷(nh2ch3)的形式除去。padi4对h2a，h3，h4三种组蛋白具有催化活性，对h2a和h4的修饰位点位于第三位的精氨酸上，并且这两个位点具有sgrgk的序列保守性；而对h3的修饰位点较多，包括：h3r2、r8、r17和r26，它们并不具有序列上的保守性。其中h3r8、h3r17以及h4r3是padi4在体内的主要作用位点。padi4对组蛋白h3上精氨酸的修饰会抑制激素受体介导基因的转录，当激素刺激引起基因转录下调时，padi4会被募集到ps2基因的启动子上，并引起h3上相应位点的去亚胺基化，这种修饰会阻止carm1对h3精氨酸的催化，后者被认为是激素介导基因转录所必需的，padi4就是通过去亚胺基化作用拮抗了carm1，从而抑制了转录的进行。padi4在各种恶性肿瘤组织中有很高的表达，尤其是在各种腺癌。westernblot和抗瓜氨酸化蛋白抗体的免疫组化也证实了padi4在肿瘤癌细胞中的表达。因此，如果以padi4为靶标，对机体进行免疫，将会使机体产生针对padi4蛋白的特异性免疫应答，从而使机体能有效地抑制、清除肿瘤细胞，为相关肿瘤的预防及治疗提供措施。合成肽疫苗是近年来随着分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，而且其副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用与抗肿瘤及抗病毒免疫治疗，己有证据表明，合成肽能直接与mhc-i类分子结合，而不需要apc的加工、处理，它和天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有同等的效力。多肽疫苗己成为目前抗恶性肿瘤的一项新策略，也是目前研究最多的肿瘤治疗性疫苗。尽管在研究肿瘤特异性肽疫苗方面已取得了重大的进步，但由于目前已鉴定出来的t细胞表位十分局限，主要集中在hla-a2，缺少a33、a24、a11限制性表位。而随着人种的不同，其hla-i类分子呈现多态性，除a2外，a33、a24、a11也占据了很大的比重。hla-0201是一种在我国人群中具有较高分布的一种mhc-i类分子。因此，鉴定新的hla限制性的肿瘤抗原显得极为必要和重要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种hla-0201限制性padi4表位多肽及其应用，以解决上述技术问题。本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：第一方面，本发明提供一种hla-0201限制性padi4表位多肽，其氨基酸序列选自下述(a)-(c)：(a)yltgveisl，即seqidno.1；(b)cleekvcsl，即seqidno.2；(c)ellkrelgl，即seqidno.3。根据本发明，编码所述padi4表位多肽的基因。第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第一方面中的padi4表位多肽的基因。第三方面，本发明提供一种抗原递增细胞，所述抗原递增细胞是被第一方面中的padi4表位多肽负载的。第四方面，本发明提供一种特异性免疫效应细胞，所述特异性免疫效应细胞针对第一方面中所述的padi4表位多肽。第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面中padi4表位多肽或第三方面的抗原递增细胞或第四方面中的特异性免疫效应细胞，所述hla-0201限制性padi4表位多肽的药物组合物用于治疗或预防hla-0201阳性对象的肿瘤。根据本发明，所述药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。第六方面，本发明第一方面中padi4表位多肽或第三方面中的抗原递增细胞或第四方面中的特异性免疫效应细胞均在制备治疗或预防肿瘤药物中应用。根据本发明，所述治疗或预防的肿瘤为共同表达hla-0201和padi4蛋白的肿瘤，为胃癌、结肠癌、肺癌、食管癌、头颈部鳞癌胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤和胶质母细胞瘤中的任意一种。本发明的有益效果是：本发明的hla-0201限制性padi4表位多肽与hla-0201具有强亲合力，对其免疫原性进行评价，发现其可以在hla-0201阳性健康人外周血中诱导出特异性的、hla-0201限制性的细胞毒t淋巴细胞，而且是一个被细胞自然加工、递呈的免疫原性多肽。hla-0201限制性padi4表位多肽诱导的抗原特异的细胞毒t淋巴细胞具有高杀伤活性和高ifn-γ分泌能力。附图说明图1为p109-117肽致敏的树突状细胞(dc)体外诱导hla-0201阳性结肠癌病人外周血抗原特异性ctl细胞的ifn-γ分泌的elispot检测结果。图2为p109-117肽致敏的树突状细胞(dc)体外诱导hla-0201阳性结肠癌病人外周血抗原特异性ctl细胞的ifn-γ分泌的流式细胞仪检测结果。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。一种hla-0201限制性padi4表位多肽，其氨基酸序列选自下述(a)-(c)：(a)yltgveisl，即seqidno.1；(b)cleekvcsl，即seqidno.2；(c)ellkrelgl，即seqidno.3。编码padi4表位多肽的基因，包含上述padi4表位多肽基因的表达载体。一种抗原递增细胞，抗原递增细胞是被上述padi4表位多肽负载的。一种特异性免疫效应细胞，特异性免疫效应细胞针对上述padi4表位多肽。一种药物组合物，药物组合物包括上述padi4表位多肽或上述抗原递增细胞或上述特异性免疫效应细胞，hla-0201限制性padi4表位多肽的药物组合物用于治疗或预防hla-0201阳性对象的肿瘤，药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。上述padi4表位多肽或上述抗原递增细胞或上述特异性免疫效应细胞均在制备治疗或预防肿瘤药物中应用，治疗或预防的肿瘤为共同表达hla-0201和padi4蛋白的肿瘤，为胃癌、结肠癌、肺癌、食管癌、头颈部鳞癌胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤和胶质母细胞瘤中的任意一种。实施例1对于hla-0201高亲和力肽的筛选在对padi4进行计算机模拟分析的基础上，选择性地合成有可能与hla-0201结合并诱导机体产生ctl的padi4特异的抗原肽(如表1)，通过稳定表达hla-0201分子的rma-s细胞(tap缺陷型)的肽结合实验，筛选出与hla-0201具有强亲合力的表位肽。应用肽结合实验筛选与hla-0201高亲和力的表位肽具体如下：(1)收集稳定表达hla-0201分子的t2细胞，用冰pbs洗三次后，调细胞浓度至1×106/ml，铺于96孔板中，100μl/孔。(2)与50um的候选多肽，2.5μg/ml的β2微球蛋白于37℃，5％co2孵箱中共孵育18h。(3)收集孵育好的细胞，用冰pbs洗三遍，加入2μlfitc标记的hla-0201特异性的单克隆抗体，放置4℃冰箱,孵育30min。(4)pbs洗三遍，用流式细胞仪检测平均荧光强度。结果判定：免疫荧光法检测肽与hla-0201分子的结合情况，是基于外源性多肽与rma-s细胞表面mhc-i类分子的结合可使其表面的mhc-i类分子的表达量增加，两者结合越稳固，则可检测到的mhc-i类分子的表达量越多，以平均荧光强度为检测指标。结果以荧光系数(fi)作为衡量指标，多肽的fi>1被认为是高亲和力的表位。荧光系数(fi)＝(样本平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度其中表位肽p109-117与hla-0201具有高亲和力，其序列为yltgveisl(如表1)表1与t2-hla-0201-结合的padi4多肽的亲和力的结果起点位置序列fi1109yltgveisl1.672611cleekvcsl0.863551ellkrelgl0.67实施例2如图1-2所示，结肠癌病人外周血淋巴细胞padi4来源的hla-0201限制性多肽抗原特异性ctl的体外诱导hla-0201+/padi4+结肠癌病人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液(ficoll-histopaque1.077)密度梯度离心(室温，400×g，30分钟)，取界面细胞，置入50ml离心管中，用无钙镁pbs(ph7.2)－edta(2mm)洗细胞3次，获得外周血单个核细胞(pbmc)。所获得的单个核细胞用完全培养基(含10％胎牛血清的rpmi1640)悬浮pbmc，按1×107细胞/孔铺于6孔板，37℃、5％co2孵育2小时后，轻晃板子，吸出非贴壁细胞,冻存备用。贴壁细胞用含人重组rhgm-csf(500u/ml)和人重组rhil-4(10ng/ml)的dc无血清培养基液，在37℃、5％co2培养箱中进行培养。培养到第七天，用肽p109-117致敏4小时。同时复苏冻存的非贴壁细胞(富含淋巴细胞)，悬浮于10％胎牛血清的rpmi1640培养基中，调整细胞浓度为4×106细胞/ml，分别取0.5ml加入至上述经肽p109-117致敏的自体dcs中，于37℃、5％二氧化碳条件下共培养(t：dcs＝10:1)，此为第一轮的刺激。之后于共培养的第五天加入20u/mlrhil-2，培养7天后收集上述淋巴细胞，同样以10：1的比例再与新鲜制备的2×105/ml肽致敏的同体dcs用10％胎牛血清rpmi1640培养液共培养进行第二轮的刺激。同样的刺激每周一次共刺激三次。培养过程中每隔3天加入一次20u/mlrhil-2，2－3天半量更换新鲜培养基，并依据需要进行细胞的分孔扩增，末次刺激后的7天收集细胞，使用免疫磁珠阳性选择分选cd8+t细胞，方法严格依照厂商提供的说明书进行。分选出的cd8+t效应细胞：(1)elispot检测(结果如图1所示，纵轴表示106个cd8+t细胞中ifn-γ+斑点形成单位数，横轴表示刺激细胞；ram-s-p109-117表示用p109-117肽负载的靶细胞；ram-s表示没有负载肽的靶细胞)经免疫磁珠分选出的cd8+t细胞悬浮于10％胎牛血清的rpmi1640培养基中作为反应细胞，调整细胞浓度为5×106/ml，细胞悬液直接转入包被有抗ifn-γ抗体的elispot检测板，100μl/孔。rma-s细胞用4000rad钴60照射去增殖后作为刺激细胞，结合padi4抗原肽，调整细胞浓度为5×106/ml，然后将细胞悬液分别加入已含有反应细胞的检测孔中，100μl/孔。参照ifn-γelispot检测试剂盒说明书的方法检测分泌ifn-γ的t细胞集落。图1a是磁珠分选出的p109-117肽特异的cd8+t细胞，用负载有p109-117肽的反应细胞rma-s-p109-117及对照反应细胞刺激后，检测到的分泌ifn-γ的t细数；图1b是磁珠分选出的p611-619肽特异的cd8+t细胞，用负载有p611-619肽的反应细胞rma-s-p611-619及对照反应细胞刺激后，检测到的分泌ifn-γ的t细数；图1是磁珠分选出的p551-559肽特异的cd8+t细胞，用负载有p551-559肽的反应细胞rma-s-p551-559及对照反应细胞刺激后，检测到的分泌ifn-γ的t细数。(2)肽特异性ctl胞内ifn-γ染色所诱导的效应细胞中加入20μm相应的肽，48小时后，常规胞内染色(结果如图2所示，其中左图的效应细胞来自无抗原肽负载的dc体外诱导的细胞毒t淋巴细胞；右图的效应细胞来自p109-117肽致敏的dc体外诱导的细胞毒t淋巴细胞)。在此实施例中我们从肿瘤相关抗原padi4筛选出一个hla-0201限制性的高免疫源性的表位肽p109-117(其序列为yltgveisl)，由该肽诱导的抗原特异的细胞毒细胞具有高杀伤活性和高ifn-γ分泌能力。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12