用于rs1801177检测的电化学DNA生物传感器制备方法与流程

本发明涉及一种用于lpl基因snp(rs1801177)检测的电化学免疫传感器的制备方法及应用，尤其基于氮掺杂石墨烯纳米复合材料的夹心型电化学dna生物传感器，用于rs1801177的检测，属于电化学检测领域。

背景技术：

心血管疾病(cardiovasculardisease，cvd)全球高发，严重危害人类健康。动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是心血管疾病的病理学基础，也是导致患者死亡的重要原因之一。早期鉴定和干预动脉粥样硬化的发生是降低心血管疾病发病率和死亡率的重要手段。研究表明，脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase，lpl)基因包括10外显子和9个内含子组成，全长约36kb，其中肽的编码区大约有23kb。lpl基因存在单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)(rs1801177，asp9asn，d9n，g280a)。当该基因片段中发生g＞a单碱基突变时，可导致天冬氨酸代替天冬酰胺，从而影响lpl的活性，增大动脉粥样硬化的发生风险，进而发生冠状狭窄。因此，针对rs1801177目标基因片段的检测对于动脉粥样硬化的辅助诊断和预防有重要意义。

目前，对rs1801177目标基因片段的检测主要是通过基因测序、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(pcr-rflp)、荧光定量分析(taqmanassays)和高分辨率熔体分析(hrm)等分析技术。上述检测方法操作繁琐、耗时，且均需要提取分离dna并进行pcr扩增，无法实现快速对rs1801177目标基因片段进行定量分析。尤其是对样品中痕量dna检测时，传统的检测方法就难以应对。近年来，电化学dna生物传感器因其方便快捷、灵敏等特点而备受关注，并且已广泛应用于生化分析、环境监测、临床研究和食品质量检测等领域。

在电化学dna生物传感器的应用中，为了达到简便、快速的实现对目标物质进行检测的目的，应选择合适的电极修饰材料。目前，人们研究最多的是碳纳米管、sio2、fe3o4纳米粒子等。1985年英国的克洛托(sirharoldwalterkroto)发现继金刚石、石墨之后的第三种同素异形体就是富勒烯(fullerene，c60)，这一发现不仅使碳材料家族更加丰富，并且有力的推动了人们对碳材料的认识，引起了科学家们巨大的研究兴趣。c60分子具有一个大的共轭离域π键，亲电子能力很强，可作为电子受体。同时，c60具有较大的比表面积，具有良好的稳定性以及较好的电化学性能等优点，呈现出令人期待的应用前景。尽管c60有许多的优点，但c60只易溶于苯、甲苯、烷烃和二硫化碳等非极性有机溶剂而在水中不分散，并且表面不含官能团。为了增加c60在水中的分散性，并且使其功能化，本项目将设计，利用相转移的方法将c60与聚酰胺-胺(pamam)聚合。pamam是一种富含大量氨基的树枝状聚合物，具有树状分子的特性，例如精确的分子结构、高度的集合对称、大量的表面端基官能团、分子内存在疏水空腔、相对分子可控性、分子具有纳米尺寸等优点。在c60与pamam结合后，不仅保留了c60固有的优点，而且使其表面增加了大量氨基，从而增加c60在水中的分散性。这样合成的纳米聚合物可增加固载基质的比表面积，也为材料的进一步修饰奠定基础，为固载材料的稳定奠定物理基础。这个设计是增强电化学dna传感器的灵敏度极佳策略。为了进一步稳定地固载大量的捕获探针dna，首先，利用pamam表面富含的大量氨基，通过金氨键固载更多的金纳米粒子(aunps)。因为aunps具有优良的导电性，能促进电子在电极表面的转移，也具有较大的比表面积，能通过稳固的金硫键固载大量的用巯基标记的dna分子。进一步增加了电化学dna传感器的稳定性和灵敏度。pamam功能化的c60与aunps复合材料的合成，将成为一种性能极佳的固载dna分子的优良材料。

为了实现信号放大的目的，提高电化学dna生物传感器的灵敏度，本发明合成了氮掺杂的石墨烯(n-g/钯铂(pdpt)双金属纳米粒子/聚苯胺(pani)纳米复合材料，并用来标记信号探针。石墨烯，石墨烯具有二维蜂窝状网格结构，是一种单层原子厚度的石墨。因此石墨烯具有质量轻，导热效果好，比表面积大(2630m²·g^-1)等优点。由于石墨烯片平面内π轨道的存在，电子可在晶体中自由移动，使得石墨烯片具有优良的转移电子的能力。因此，与以往经常使用的碳纳米管相比，石墨烯具有更好的热、力、电等性能，所以备受青睐。与石墨烯相比，n-g引入了氮原子，在氮原子的掺杂作用下，氮原子能够有效地改变相邻碳原子的自旋密度和电荷分布，使得氮掺杂石墨烯表面上的碳原子活化，增加了其导电性能。此外，氮原子的加入，不仅形成了碳氮微环境，增加了生物相容性；同时增加了更多的活性位点，可以用于固载金属纳米粒子和提高金属纳米粒子的电催化活性。因此，使电信号增强，电化学dna生物传感器的灵敏度得到提高。虽然氮掺杂石墨烯与钯铂合金形成的纳米复合材料确实有助于电信号的放大，增强灵敏度的效果，但是dna分子本身不具有电化学活性。因此，在电流型dna传感器的设计中通常需要考虑引入氧化还原探针(电子媒介体)作为示踪物质，以得到可以用于定量检测的电信号。聚苯胺(pani)，是一种具有高导电性的聚合物，具有良好的环境稳定性和合成成本低的特点。此外，它还是一个直接的有效的电子媒介体。当在原位聚合制备聚苯胺过程中加入质子酸或纳米材料时，能使其稳定性增强，同时提高其导电性，进而能进一步提高传感器灵敏度。同时，聚苯胺富含大量氨基，在edc和nsh的活化作用下，与羧基标记的dna结合，形成具有电化学指示作用及对其信号放大作用的信号探针dna。

因此本发明采用c60/pamam/au纳米复合材料作为固载材料，n-g/pdpt/pani用于标记信号探针dna，构建了一种夹心型信号增强模式的电化学dna生物传感器，用于rs1801177的定量检测。不仅为rs1801177的检测提供了一种简单、快速、高效、灵敏的新方法，而且还为心血管疾病的临床诊断与预防提供了理论依据和实验基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于生物样品中的rs1801177定量检测的电化学dna生物传感器的制备方法，其特征包括以下步骤：

(1)富勒烯(c60)/聚酰胺树枝状聚合物(pamam)/金纳米粒子(au)纳米复合材料的制备；

(2)氮掺杂石墨烯(n-g)/钯铂双金属(pdpt)/聚苯胺(pani)纳米复合材料的制备；

(3)建立电化学dna生物传感器，测定rs1801177，绘制标准曲线。

本发明所述c60/pamam/au纳米复合物的制备过程，其特征包括以下步骤：

(1)c60/pamam纳米复合材料的制备

c60/pamam纳米复合材料通过相转移的方法制备，其具体操作步骤如下：称取1.08mgc60粉末，加入1ml甲苯超声30min，使其完全分散形成均匀的紫色溶液。在磁力搅拌条件下，将其转入8ml小烧杯中，加入25ulpamam、1ml超纯水、4m乙醇。反应36h后，离心洗涤多次以除去多余的物质后，将其分散在2ml超纯水中。

(2)c60/pamam/au纳米复合材料的制备

在不断搅拌条件下，将400μl氯金酸(1％)加入到上述合成的2mlc60/pamam纳米复合溶液中，接着将4ml硼氢化钠(2mgml^-1)溶液逐滴加入混合溶液中，室温下搅拌半小时后，离心洗涤，将得到的c60/pamam/au纳米复合材料重新分散在2ml超纯水中，储存在4℃条件下备用。

本发明所述n-g/pdpt/pani纳米复合物的制备过程，其特征包括以下步骤：

(1)n-g/pdpt纳米复合材料的制备

首先，称取10mgn-g粉末，向其加入2.6mlh2ptcl6·6h2o(3.5mm)和3mlnapdcl4(3mm)超声1h后，用0.05mnaoh将其ph调至9.5-10搅拌10min，在搅拌的条件下加入25mlnaoh(0.4mgml^-1)搅拌3h后，离心水洗多次，获得制备好的n-g/pdpt纳米复合材料溶解于10ml超纯水中。

(2)n-g/pdpt/pani纳米复合材料的制备

取5mln-g/pdpt纳米复合材料溶液，在搅拌条件下，加入5mlh2so4(0.5m)溶液，随后加入100μl苯胺，接着加入5mlk2s2o8(0.5m)，反应6h后，离心洗涤，将获得的n-g/pdpt/pani纳米复合材料分散在10ml超纯水中，储存在4℃条件下备用。

(3)n-g/pdpt/pani/ssdna复合物的制备

将200μl羧化的单链dna(2μm)加入到含有2mledc(400mm)和2mlnhs(100mm)的溶液中，接着加入2mln-g/pdpt/pani溶液，在4℃条件下搅拌12小时，用超纯水离心洗涤。随后，将己硫醇(mch，1mm)加入到上述混合物中，在4℃条件下搅拌4小时，以封闭n-g/pdpt/pani表面的非特异性结合位点。用超纯水离心洗涤后，将合成的n-g/pdpt/pani/ssdna复合物重新分散在2ml杂交液中，4℃保存备用。

本发明中所述的建立电化学dna生物传感器，测定生物样品中的rs1801177浓度，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤：

(1)分别用0.3μm和0.05μm的al2o3粉末将电极抛光至镜面，然后分别用适量超纯水、无水乙醇、超纯水按上述顺序将电极各超声5min，室温干燥备用；

(2)将8μl制备好的c60/pamam/au纳米复合物溶液滴加在电极表面，室温干燥；

(3)将20μl的捕获探针dna溶液滴加在经过c60/pamam/au纳米复合物修饰的电极表面后，置于37℃孵育12h；

(4)用超纯水将电极表面未牢固结合的捕获探针dna冲洗之后，滴加20μlmch(1mm)溶液，置于37℃孵育1h以封闭电极表面的非特异性结合位点；

(5)用超纯水将孵育后的电极表面多余的mch冲洗之后，将20μl不同浓度的目标dna分别滴加在电极表面，置于37℃孵育2h；

(6)用超纯水将未与捕获探针dna结合的目标dna冲洗之后，将10μl被标记的信号探针dna(n-g/pdpt/pani/ssdna)复合物溶液滴加在电极表面，置于37℃孵育2h；

(7)用超纯水将未与目标dna结合的信号探针dna冲洗之后，置于0.1mmpbs缓冲溶液(ph＝7.0)中进行表征，用差分脉冲伏安法(dpv)测量其电流响应值。

(8)根据所得峰电流差值与rs1801177浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线。

与现有技术相比，本发明是一种用于生物样品中rs1801177定量检测的电化学免疫传感器的制备方法，其突出的特点是：

(1)将c60/pamam/au纳米复合材料作为基底引入到电化学免疫传感器的制备中，不仅增强了导电性，加快了电子传递，而且增加了生物分子的固载量，进而提高了电化学免疫传感器的灵敏度和生物相容性；

(2)n-g/pdpt/pani纳米复合材料作为新型氧化还原纳米探针和催化剂，不仅能产生电化学信号而且在h2o2存在的条件下能实现信号放大；

(3)本方法制备的电化学dna生物传感器通过碱基互补配对进行识别，具有良好的特异性，其制备过程简单、检测步骤较少，检测速度较快，便于实现商品化。

(4)本方法制备的电化学免疫传感器可为临床对心血管疾病的预防和诊断提供有效信息，有助于心血管疾病的诊断和预防。

附图说明：

图1为本发明中电化学dna生物传感器的构建示意图。

图2为本发明中信号材料的不同合成步骤的tem图、xps图、ftir图和uv-vis图。

图3为本发明的电化学免疫传感器在检测rs1801177时得到的dpv曲线及其峰电流差值与浓度对数的线性关系、特异性和重现性。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

步骤1.c60/pamam纳米复合材料通过相转移的方法制备，其具体操作步骤如下：称取1.08mgc60粉末，加入1ml甲苯超声30min，使其完全分散形成均匀的紫色溶液。在磁力搅拌条件下，将其转入8ml小烧杯中，加入25ulpamam、1ml超纯水、4m乙醇。反应36h后，离心洗涤多次以除去多余的物质后，将其分散在2ml超纯水中；

步骤2.在不断搅拌条件下，将400μl氯金酸(1％)加入到上述合成的2mlc60/pamam纳米复合溶液中，接着将4ml硼氢化钠(2mgml^-1)溶液逐滴加入混合溶液中，室温下搅拌半小时后，离心洗涤，将得到的c60/pamam/au纳米复合材料重新分散在2ml超纯水中，储存在4℃条件下备用；

步骤3.称取10mgn-g粉末，向其加入2.6mlh2ptcl6·6h2o(3.5mm)和3mlnapdcl4(3mm)超声1h后，用0.05mnaoh将其ph调至9.5-10搅拌10min，在搅拌的条件下加入25mlnaoh(0.4mgml^-1)搅拌3h后，离心水洗多次，获得制备好的n-g/pdpt纳米复合材料溶解于10ml超纯水中；

步骤5.取5mln-g/pdpt纳米复合材料溶液，在搅拌条件下，加入5mlh2so4(0.5m)溶液，随后加入100μl苯胺，接着加入5mlk2s2o8(0.5m)，反应6h后，离心洗涤，将获得的n-g/pdpt/pani纳米复合材料分散在10ml超纯水中，储存在4℃条件下备用；

步骤6.将200μl羧化的单链dna(2μm)加入到含有2mledc(400mm)和2mlnhs(100mm)的溶液中，接着加入2mln-g/pdpt/pani溶液，在4℃条件下搅拌12小时，用超纯水离心洗涤。随后，将己硫醇(mch，1mm)加入到上述混合物中，在4℃条件下搅拌4小时，以封闭n-g/pdpt/pani表面的非特异性结合位点。用超纯水离心洗涤后，将合成的n-g/pdpt/pani/ssdna复合物重新分散在2ml杂交液中，4℃保存备用；

步骤7.分别用0.3μm和0.05μm的al2o3粉末将电极抛光至镜面，然后分别用适量超纯水、无水乙醇、超纯水按以上顺序将电极各超声5min，室温干燥备用；

步骤8.取上述制备好的8μl的c60/pamam/au纳米复合材料滴加在电极表面，室温干燥；

步骤9.将20μl的捕获探针dna溶液滴加在经过c60/pamam/au纳米复合物修饰的电极表面后，置于37℃孵育12h；

步骤10.用超纯水将电极表面未牢固结合的捕获探针dna冲洗之后，滴加20μlmch(1mm)溶液，置于37℃孵育1h以封闭电极表面的非特异性结合位点；

步骤11.用超纯水将孵育后的电极表面多余的mch冲洗之后，将20μl不同浓度的目标dna分别滴加在电极表面，置于37℃孵育2h；

步骤12.用超纯水将未与捕获探针dna结合的目标dna冲洗之后，将10μl被标记的信号探针dna(n-g/pdpt/pani/ssdna)复合物溶液滴加在电极表面，置于37℃孵育2h；

步骤13.用超纯水将未与目标dna结合的信号探针dna冲洗之后，置于0.1mmpbs缓冲溶液(ph＝7.0)中进行表征，用差分脉冲伏安法(dpv)测量其电流响应值；

步骤14.根据所得峰电流值求得其差值与rs1801177浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；测定结果表明scd40l浓度在10fmto10nm范围内成线性关系，线性相关系数平方(r²)为0.99778，检测限为3.33fm(s/n＝3)

步骤14.将本发明用于检测rs1801177以及血浆中的干扰物质，结果表明血浆中的干扰物质的电流响应值远远低于rs1801177的电流相应值，说明传感器的特异性好，抗干扰能力强，能够排除其他物质的干扰；

步骤15.将本发明中上述传感器置于于冰箱中4℃保存，间断检测传感器电流响应，储存28天后电流响应仍为初始电流的92.15％，表明传感器具有良好的稳定性；

步骤16.将本发明的同一批次的5个电化学dna生物传感器用于检测同一浓度(10pm)的rs1801177，其相对标准偏差为0.9585％，同时在5批次的电化学dna生物传感器中每取一个电化学dna生物传感器用于检测同一浓度(10pm)的rs1801177，其相对标准偏差为1.9966％，表明此传感器有良好的重现性。