新疆伊犁株马驽巴贝斯虫Bc48蛋白单克隆抗体制备方法与流程

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及新疆伊犁株马驽巴贝斯虫蛋白bc48单克隆抗体杂交瘤细胞株11f-4、h1-2和7f-4及单克隆抗体，特别是新疆伊犁株马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体制备方法。

背景技术：

马类家畜驽巴贝斯虫病是由马驽巴贝斯虫(babesiacaballi)寄生于马类家畜的红细胞内由蜱传播引起的一类血液原虫病。引起患病马发烧、贫血、黄疸、水肿等症状，甚至引起死亡，对马产业的发展带来了巨大的经济损失。马驽巴贝斯虫在国际贸易中也产生严重的消极影响，对纯种马及幼畜危害极大，新疆作为半农半牧地区，有大量珍贵的马资源，马驽巴贝斯虫病对当地的马产业造成了极大的经济损失。

目前对于驽巴贝斯虫病的检测手段主要有临床诊断、血液涂片、血清学诊断及普通pcr方法等。随着近代分子生物学的发展，pcr诊断以其高敏感性和特异性越来越受到人们的关注,套式pcr、常规pcr和荧光定量pcr等均有报道。补体结合试验（cft）是常用于检测马驽巴贝斯虫病的方法，但其灵敏度较低且检测速率慢。间接荧光抗体试验（ifat）也可用于诊断马驽巴贝斯虫的感染，但受到马泰勒和马驽巴贝斯交叉反应的影响；除cft和ifat外，基于马驽巴贝斯虫裂殖子抗原的elisa已被用于抗体检测。马驽巴贝斯虫bc48基因是该虫重要的保守基因，经研究表明该蛋白是一种重要的免疫蛋白质，可作为诊断马驽巴贝斯虫病的重要抗原，且涉及入侵红细胞，对于疫苗的研制存在重要的意义。因此制备出bc48基因的单克隆抗体具有十分重要的意义，可为建立快速诊断方法及该蛋白功能的研究奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新疆伊犁株马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体制备方法，利用上述方法获得能够稳定分泌高效抗马驽巴贝斯虫bc48蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为今后建立快速的诊断方法，和该蛋白功能的深入研究提供工具。

本发明的目的是这样实现的：一种新疆伊犁株马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体制备方法，（1）从含有新疆伊犁马驽巴贝斯虫bc48重组质粒的大肠杆菌中纯化his-bc48重组蛋白，使用蛋白含量测定仪测定其蛋白浓度，在﹣80℃保存备用；（2）取健康6~8周龄balb/c小鼠若干只，在其背部皮下多点注射免疫纯化的his-bc48重组蛋白，his-bc48重组蛋白是剂量为100μg/只且二免和三免免疫相同剂量的抗原；将小鼠免疫间隔2周，三免后10天在其尾尖采血测试抗体效价，选37℃且5％的co2效价在10⁵以上的小鼠在融合前3天腹腔注射100μg重组蛋白加强免疫；（3）无菌对小鼠脾脏局部进行提取，将从中提取出的小鼠脾脏新鲜样本制成脾细胞，使脾细胞和骨髓瘤细胞（sp2/0）按5:1~10:1的质量比混合于一支离心管中，加入1ml体积分数为50%的聚乙二醇（peg4000）进行融合，用含有15%胎牛血清的1640培养液（代号1640已知的市售培养液）重悬细胞，加至96孔细胞培养板中（每孔约有10⁵个细胞），每孔100μl，将培养板放到37℃且5％的co2培养箱内培养，在融合第2天，添加1%hat培养液，每孔100μl，放入37℃且5％的co2培养箱中培养；(4)在培养5~7天后，hat培养基全换液一次，4~5天后，吸取培养液，用包被his-bc48蛋白的间接elisa及bc48转染293t细胞的间接免疫荧光方法进行筛选，选择其中的阳性株进行亚克隆，4~5次亚克隆后，即可获得稳定分泌马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

通过本发明制备方法获得杂交瘤细胞，即获得抗马驽巴贝斯虫bc48蛋白的单克隆抗体，利用如下方法进行鉴定：（1）利用间接elisa进行细胞上清效价的鉴定；（2）利用间接免疫荧光的方法对细胞上清与真核表达蛋白的反应性检测；（3）利用单克隆亚型分型试剂盒对单克隆进行亚型鉴定；（4）利用间接免疫荧光对单克隆抗体与自身蛋白反应性进行鉴定。

发明用马驽巴贝斯虫his-bc48重组蛋白免疫小鼠，通过间接elisa及间接免疫荧光对杂交瘤细胞株进行筛选，获得了针对马驽巴贝斯虫bc48蛋白的单克隆抗体，并验证了单克隆抗体与自身蛋白的反应性。

本发明公开了新疆伊犁株马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体的制备方法。本发明以his-bc48重组蛋白免疫6周龄balb/c雌性小鼠，无菌取其脾脏与骨髓瘤细胞（sp2/0）细胞融合，经间接elisa和间接免疫荧光方法，共筛选获得3株分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为11f-4、h1-2和7f-4，对其反应性进行鉴定，发现有2株细胞分泌的单克隆抗体能够与虫体天然蛋白发生反应，为马驽巴贝斯虫血清学快速检测方法的建立及对该基因的基础研究提供了工具。

附图说明

图1本发明实施的单抗隆抗体的纯化鉴定示意图；其中，m为蛋白分子质量标准；1为纯化的腹水；

图2本发明实施的杂交瘤细胞7f-4、h1-2和11f-4株的抗体亚型鉴定示意图；

图3a为本发明杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体7f-4株与自身蛋白的反应鉴定示意图（10×200）；

图3b为本发明杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体h1-2株与自身蛋白的反应鉴定示意图（10×200）；

图3c为本发明杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体11f-4株与自身蛋白的反应鉴定示意图（10×200）；

图3d为本发明3株杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体都不于马泰勒和阴性血清发生反应的阴性对照示意图。

具体实施方式

(1)马驽巴贝斯虫his-bc48重组蛋白纯化，蛋白含量测定仪测定其蛋白浓度，﹣80℃保存备用。(2)取健康6~8周龄balb/c小鼠5只，背部皮下多点注射免疫，剂量为每只100μg二免100μg，三免100μg，免疫间隔2周，三免后10天在其尾尖采血测试抗体效价，选效价在10⁵以上的小鼠在融合前3天腹腔注射100μg蛋白加强免疫。(3)无菌摘取小鼠脾脏局部作为样本，将其制成脾细胞，使脾细胞和骨髓瘤细胞（sp2/0）按5:1~10:1的质量比混合于一支离心管中，缓慢加入1ml体积分数为50%的聚乙二醇（peg4000）进行融合，用含有15%胎牛血清的1640培养液重悬细胞，加至96孔细胞培养板中，每孔100μl，加至96孔细胞培养板中，将培养板放到37℃5％co2培养箱内培养。融合第2天，添加1%hat培养液，每孔100μl，放入37℃5％co2培养箱中培养。(4)培养5~7天后，hat培养基全换液一次，4~5天后，吸取培养液，用包被his-bc48的间接elisa及间接免疫荧光进行筛选，选择阳性株进行亚克隆，4~5次亚克隆后，即可获得稳定分泌马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体。(5)取10周龄健康balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡0.3ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞0.3ml（含有5x10⁶个杂交瘤细胞）/只，待小鼠腹腔明显增大时抽取腹水，用辛酸硫酸铵法纯化腹水，在﹣80℃保存备用。制备的腹水与重组蛋白和虫体蛋白均有明显的反应性。将获得的杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔，可从小鼠腹水中获得大量效价高的单克隆抗体。

在所述的制备方法步骤（2）中，his-bc48重组蛋白稀释用细胞用pbs。

在所述的制备方法步骤（3）中，细胞离心时转速不要超过1000rpm/min。

下列实施例旨在举例说明而不是限制发明。

实施例：一种马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体的制备方法

1.材料与方法

1.1重组质粒、虫株、细胞及实验动物

马驽巴贝斯虫pet-28a-bc48重组质粒及马驽巴贝斯虫新疆伊犁株由新疆伊犁获得分离，保存于新疆农业大学寄生虫实验室。骨髓瘤细胞sp2/0保存于浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，balb/c小鼠购于浙江大学实验动物中心。

1.2主要试剂

胎牛血清，1640培养基，hat培养基，ht培养基，佐剂购于sigma公司；辣根过氧化物酶（hrp）标记的羊抗鼠igg及fitc标记的羊抗鼠igg均购自kpl公司。

1.3抗原的制备

从含有马驽巴贝斯虫pet-28a-bc48重组质粒的大肠杆菌中纯化his-bc48重组蛋白，蛋白含量测定仪测定其蛋白浓度，﹣80℃冻存备用。

1.4动物免疫

取健康6~8周龄balb/c小鼠5只，背部皮下多点注射免疫，首次免疫蛋白与弗氏完全佐剂完全乳化，剂量为每只100μg，二免及三免等量的蛋白与弗氏不完全佐剂完全乳化，二免100μg，三免100μg，免疫间隔2周，三免后10天在其尾尖采血测试抗体效价，选效价在10⁵以上的小鼠在融合前3天腹腔注射100μg蛋白加强免疫。

1.5细胞融合

无菌摘取小鼠脾脏局部作为样本，制成脾细胞，将脾细胞和骨髓瘤细胞（sp2/0）按5:1~10:1混合于一支离心管中，1000rpm/min离心10min后，弃去上清液，在37℃的温度缓慢加入1ml体积分数为50%的聚乙二醇（peg4000）进行融合，用含有15%胎牛血清的1640培养液重悬细胞，每孔100加至96孔细胞培养板中，每孔100μl加至96孔细胞培养板中（每孔约有10⁵个细胞），将培养板放入37℃5％co2培养箱内培养。融合第2天，添加1%hat培养液，每孔100μl，放入37℃5％co2培养箱中培养。培养5天后观察细胞发现大量没有融合细胞死亡，并有葡萄簇样的杂交瘤细胞株的生长。

1.6杂交瘤细胞的筛选及克隆

约5~7天后，96孔板中融合细胞生长且培养基变黄，全换液一次，4~5天后待培养基再度变黄时，吸取培养液，用包被bc48蛋白的间接elisa方法进行筛选，选择强阳性细胞株进行亚克隆。4次亚克隆后，即可得到能产生抗体的细胞株。本实验共获得了3株能稳定分泌抗体且效价高的细胞株，命名为11f-4、h1-2和7f-4将其连续传代及冻存复苏后仍然能保持分泌抗体的能力。

1.7单抗腹水的制备

取10周龄健康balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡0.3ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞0.3ml（含有5x10⁶个杂交瘤细胞）/只，待小鼠腹腔明显增大时抽取腹水，用辛酸硫酸铵法纯化腹水，用sds-page进行鉴定，﹣80℃保存，结果如图1所示：。

1.8马驽巴贝斯虫bc48蛋白单克隆抗体的鉴定

单克隆抗体效价检测利用间接elisa及间接免疫荧光的方法对杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水检测（结果见表1），由表1可以发现，利用包被的bc48蛋白间接elisa对单抗隆抗体进行检测，小鼠腹水效价明显高于细胞上清液。表1发明实施的11f-4、h1-2和7f-4杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体的滴度鉴定记录表。

表1

1.9单克隆抗体亚型鉴定

利用sigma单克隆抗体分型试剂盒进行亚型鉴定，如图2所示：亚型鉴定结果表明，11f-4和7f-4为igg2a、h1-2为igg1，且三株单克隆抗体均为κ链。

2.0单克隆抗体与自身蛋白反应性鉴定

准备马驽巴贝斯虫、马泰勒阳性血涂片及阴性血涂片，血涂片用甲醇丙酮1：1在﹣20℃固定20min，烘干后，加入单克隆抗体，37℃孵育40min，同时用小鼠阴性血清进行对照，取出用pbst洗涤3次，然后用1:400fitc标记的羊抗鼠或兔抗马，37℃避光孵育40min，取出后用pbst洗3次，荧光显微镜进行观察。（结果见图3a、图3b、图3c、图3d）

结果如图3a、图3b、图3c、图3d所示：本发明中杂交瘤细胞11f-4、h1-2和7f-4株制备的单克隆抗体均可以与马驽巴贝斯虫裂殖子发生反应，且3株杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体都不与马泰勒和阴性血清发生反应。