乙基己基甘油的制备方法与流程

本发明涉及生物催化技术领域,更具体地说，它涉及一种乙基己基甘油的制备方法。

背景技术：

2-乙基己基甘油（casno：70445-33-9）也叫异辛基甘油醚或辛氧基甘油，是一个两性分子，具有润滑、抗菌、保湿和除臭等效果。乙基己基甘油是一种全世界广泛使用的日化产品，用于各种沐浴产品，清洁产品，除臭剂，眼妆，粉底，护发产品和防晒产品等。乙基己基甘油能够在提高润肤剂、保湿剂配方滋润效果的同时增加柔滑的肤感，添加到膏霜体系中，可以提高皮肤对膏霜的吸收效率，同时克服发粘及涂白等肤感上的缺点。乙基己基甘油的抑菌活性可以抑制皮肤表面引发异味的细菌的滋生和繁殖，具有除臭效果。此外，乙基己基甘油与传统的防腐剂如苯氧乙醇等混合使用具有显著的防腐增效功能。这一特性可有效地降低传统防腐剂的加入量，显著降低防腐体系的毒害性，让消费者在使用化妆品的时候更加安全放心。乙基己基甘油已成为绿色防腐剂重要品种，用途广泛，用量巨大。

乙基己基甘油虽然是一种绿色防腐剂，公告号为cn108191614a的中国专利公开了一种制备乙基己基甘油的方法，包括以下步骤：(1)以三氟化硼乙醚溶液作为催化剂，在搅拌条件下，使异辛醇和缩水甘油酯类在室温下搅拌反应，生成中间体；(2)在步骤(1)得到的中间体中加入酸作催化剂，再加入水或者醇类，在常压或者减压条件下反应，使步骤(1)得到的中间体水解或者醇解；(3)将步骤(2)所得产物水洗分液后，蒸馏得到乙基己基甘油。

但该方法反应合成过程中有副反应发生，杂质多。化学合成过程中杂质的存在会导致生产的乙基己基甘油色泽深，有异味等现象产生，有些杂质还引发毒性反应。为了去除这些杂质，需要在后处理过程中增加脱色除杂等步骤，进一步增加了生产成本。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种乙基己基甘油的制备方法，达到减少杂质，节约成本的目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种乙基己基甘油的制备方法，包括：

（1）全细胞催化剂催化水解的底物是乙基己基缩水甘油醚，底物浓度范围5-50%(w/v)；

（2）用缓冲液为50mm的磷酸盐缓冲液重悬，ph范围6.0～9.0，加入乙基己基缩水甘油醚；

（3）每毫升反应体系中全细胞催化剂的用量为0.3～0.5g；

（4）转化反应温度为30～50℃；反应时间为4～8小时，生成乙基己基甘油。

通过采用上述技术方案，可以将500g/l乙基己基缩水甘油醚8小时内全部转化乙基己基甘油，且无任何副产物生成，显示了良好的工业利用潜力，达到减少杂质，节约成本的目的。

本发明的另一个目的是提供一种制备如上述所述乙基己基甘油的制备方法中的全细胞催化剂的方法，包括：将高产环氧化物水解酶的基因工程菌经种子培养基37℃过夜活化后，按10%比例接种到发酵培养基，37℃、200rpm培养至对数中期，加入诱导剂乳糖至终浓度1mm，25～30℃、180rpm诱导培养4～6小时左右，离心收集菌体。

通过采用上述技术方案，全细胞催化剂具有高活性和耐受高底物浓度的特点，使得底物转化反应效率高，底物转化率为100%。

本发明进一步设置为，所述种子培养基是常规的lb培养基，配方如下：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l；nh3·h2o调节至ph7.0，平板培养基为lb培养基再加入15g/l琼脂粉，在121℃灭菌20min。

本发明进一步设置为，所述发酵培养基是常规的tb培养基，配方如下：蛋白胨12g/l、酵母膏24g/l、甘油4ml/l、定容到900ml，同时配制100ml0.17m的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾溶液，115℃灭菌20min，灭完菌两种溶液混合后待用。

本发明的另一个目的是提供一种制备如上述所述的制备全细胞催化剂的方法中高产环氧化物水解酶的基因工程菌的方法，通过基因工程pcr的方法得到novosphingobiumaromaticivorans的naeh基因，基因产物序列号为abd26703.1，并在基因两端加上ndei和bamhi酶切位点，并将基因构建到pet30a中，获得基因的高表达载体pet30naeh，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌bl21(de3)中，即得到所述的高产环氧化物水解酶的基因工程菌。

通过采用上述技术方案，高产环氧化物水解酶的基因工程菌表达出的目的蛋白能达到全蛋白的20～40％，实现了目的蛋白的高效异源表达。

本发明进一步设置为，所述的供体菌为含有naeh基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、酵母菌属，镰刀霉菌属。

本发明的另一个目的是提供一种如上述所述的高产环氧化物水解酶的基因工程菌，在全细胞转化生产合成乙基己基甘油的方法中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：全细胞催化剂催化底物转化率为100%，与目前工业上通过化学法制备乙基己基甘油的方法相比，工艺简单，绿色环保，无副产物生成，可大幅降低酸碱和有机溶剂的使用，生产效率高。

附图说明

图1为naeh的纯度；

图2为利用工程菌转化浓度为20%的乙基己基缩水甘油醚制备的乙基己基甘油的气相分析图；

图3为利用工程菌转化浓度为30%的乙基己基缩水甘油醚制备的乙基己基甘油的气相分析图；

图4为利用工程菌转化浓度为40%的乙基己基缩水甘油醚制备的乙基己基甘油的气相分析图；

图5为利用工程菌转化浓度为50%的乙基己基缩水甘油醚制备的乙基己基甘油的气相分析图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明中所使用的试剂和耗材都为市购获得的常规产品。

实施例1：一种制备高产环氧化物水解酶的基因工程菌的方法

根据novosphingobiumaromaticivorans的naeh基因的序列设计引物：

正向引物：cgccatatgaatgttgcgcctttcgt，下划线序列为酶切位点ndei。

反向引物：ccggatccgcacatcagggaaaacgcggccc，下划线序列为hindiii酶切位点。基因产物序列号为abd26703.1。

pcr得到的基因序列两端带有ndei、hindiii两个位点，将基因插入到pet30a载体中，得到的高表达的基因工程载体质粒命名为pet30naeh，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌bl21(de3)中，得到高产环氧化物水解酶的基因工程菌。得到的基因工程菌表达出的蛋白在c端带有his-tag标签蛋白。

此外供体菌为含有naeh基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、酵母菌属，镰刀霉菌属等菌属。

高表达菌株的获得：将制备得到的重组载体用常规方法导入大肠杆菌bl21(de3)以构建重组酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌bl21(de3)为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于30％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。

具体转化方法如下：从冰箱中取出100μl的感受态细胞。细胞在冰上融化2-5分钟。融解后轻弹管壁1-2次以重悬细胞。将1μl的pet30naeh质粒加入感受态细胞中。轻微摇动混和随后将管重置于冰中。冰浴30min。42℃水浴90秒。然后迅速将管转移到冰上放置2分钟，使细胞冷却。向每个离心管中加入500μl无菌无抗的lb培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min(150rpm/min)，使菌体复苏。混匀吸取100μl加到含有卡那霉素（kan100μg/ml）的lb固体培养基上，用玻璃刮轻轻涂匀，将平板放置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。获得高表达的基因工程菌：大肠杆菌bl21(de3)（pet30naeh）。

实施例2：实施例1中的高产环氧化物水解酶的基因工程菌，在全细胞转化生产合成乙基己基甘油的方法中的应用。

实施例3：环氧化物水解酶naeh的表达和纯化

(1)种子培养基活化挑取培养皿上的单菌落于5mllb(kan100μg/ml)培养基中，37℃、200rpm过夜活化。

(2)发酵培养将过夜活化的种子液分别按10%比例接种到800mllb发酵培养基(kan100g/ml)，37℃、200rpm培养至对数中期od600＝0.6左右。

(3)诱导培养对数中期时加入乳糖进行诱导，使其终浓度为1mm，25～30℃、180rpm诱导培养4～6小时。

(4)sds-page取将诱导完成的发酵液4ml，12000rpm离心90sec，加入800μl去离子水，超声破碎5min。12000rpm离心10min。取离心后上清20μl加入5μl上样缓冲液；离心后沉淀用去离子水洗剂1次，加入800μl去离子水后取20μl加入5μl上样缓冲液。sds-page分离胶浓度为12.5％，每孔上样10μl。

(5)纯化工作在aktapurifier10仪器中进行，纯化条件如下：用缓冲液a（50mmtris-hcl，0.5mnacl，5%甘油，20mm咪唑，ph7.5）平衡柱子histraphp-5，将（4）中制备的含酶的上清液上柱，洗脱除去杂蛋白，目标蛋白用缓冲液b（50mmtris-hcl，0.5mnacl，5%甘油，0.5m咪唑，ph7.5）洗脱，透析脱盐，酶液经过超滤膜浓缩，保存于-80℃备用。

（6）naeh的纯度见附图1。

实施例4：一种制备全细胞催化剂的方法以及利用全细胞催化剂转化乙基己基缩水甘油醚产生乙基己基甘油实验：

(1)种子培养基活化挑取培养皿上的单菌落于5mllb(kan100μg/ml)培养基中，37℃、200rpm过夜活化。种子培养基是常规的lb培养基，配方如下：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l；nh3·h2o调节至ph7.0，平板培养基为lb培养基再加入15g/l琼脂粉，在121℃灭菌20min。

(2)发酵培养将过夜活化的种子液分别按10%比例接种到1ltb发酵培养基(kan100μg/ml)，37℃、200rpm培养至对数中期od600＝0.6～1左右。发酵培养基是常规的tb培养基，配方如下：蛋白胨12g/l、酵母膏24g/l、甘油4ml/l、定容到900ml，同时配制100ml0.17m的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾溶液，115℃灭菌20min，灭完菌两种溶液混合后待用。

(3)诱导培养对数中期时加入乳糖进行诱导，使其终浓度为1mm，25～30℃、180rpm诱导培养4～6小时。8000rpm，10min离心收菌。

(4)称取0.6g菌体，用2ml50mmpbs缓冲液（ph7.0）重悬，加入终浓度为50g/l的底物乙基己基缩水甘油醚，转化反应温度为37℃，200rpm下转化3小时，生成乙基己基甘油。每毫升反应体系中全细胞催化剂的用量为0.3～0.5g。

实施例5：利用全细胞催化剂转化乙基己基缩水甘油醚产生乙基己基甘油实验：

（1）全细胞催化剂的培养及制备同实施例4。

（2）称取0.6g菌体，用2ml50mmpbs缓冲液（ph7.0）重悬，加入终浓度为100g/l的底物乙基己基缩水甘油醚，37℃，200rpm下转化4小时，生成乙基己基甘油。

实施例6：利用全细胞催化剂转化乙基己基缩水甘油醚产生乙基己基甘油实验：

（1）全细胞催化剂的培养及制备同实施例4。

（2）称取0.6g菌体，用2ml50mmpbs缓冲液（ph7.0）重悬，加入终浓度为200g/l的底物乙基己基缩水甘油醚，37℃，200rpm下转化8小时，生成乙基己基甘油。

使用气相色谱分析检测转化率和生成的产品乙基己基甘油的纯度，结果见附图2。

实施例7：利用全细胞催化剂转化乙基己基缩水甘油醚产生乙基己基甘油实验：

（1）全细胞催化剂的培养及制备同实施例4。

（2）称取1.0g菌体，用2ml50mmpbs缓冲液（ph7.0）重悬，加入终浓度为300g/l的底物乙基己基缩水甘油醚，37℃，200rpm下转化6小时，生成乙基己基甘油。

使用气相色谱分析检测转化率和生成的产品乙基己基甘油的纯度，结果见附图3。

实施例8：利用全细胞催化剂转化乙基己基缩水甘油醚产生乙基己基甘油实验：

（1）全细胞催化剂的培养及制备同实施例4。

（2）称取1.0g菌体，用2ml50mmpbs缓冲液（ph7.0）重悬，加入终浓度为400g/l的底物乙基己基缩水甘油醚，37℃，200rpm下转化8小时，生成乙基己基甘油。

使用气相色谱分析检测转化率和生成的产品乙基己基甘油的纯度，结果见附图4。

实施例9：利用全细胞催化剂转化乙基己基缩水甘油醚产生乙基己基甘油实验：

（1）全细胞催化剂的培养及制备同实施例4。

（2）称取1.0g菌体，用2ml50mmpbs缓冲液（ph7.0）重悬，加入终浓度为500g/l的底物乙基己基缩水甘油醚，37℃，200rpm下转化8小时，生成乙基己基甘油。

使用气相色谱分析检测转化率和生成的产品乙基己基甘油的纯度，结果见附图5。

所述气相色谱分析所用的色谱柱为agilenthp-5（0.2mm×30m），起始温度100℃，升温速度25℃/min，进样量2μl。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

核苷酸序列表

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<110>南京盛德生物科技研究院有限公司

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