本发明涉及基因治疗领域。具体的,本发明涉及一种用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的重组腺病毒、其制备及应用,所述重组腺病毒包含编码杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeablityincreasingprotein,bpi)和免疫球蛋白重链恒定区fc的融合蛋白的bpi-fc嵌合基因。本发明还涉及所述重组腺病毒在制备用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物组合物中的用途。
背景技术:
抗生素耐药对公共卫生及人类健康构成重大威胁,近年来who呼吁并引起全世界重视应对全球耐药感染问题,警示人类将进入后抗生素时代[antimicrobialresistanceglobalreportonsurveillance2014,who]。who引用英国jimo’neill发表的[antimicrobialresistanceontheglobalagenda.dec1,2015]估计,在全世界范围内每年大约有70万人死于耐药性细菌感染,如果不采取有效的措施,预计到2050年每年会有1000万人死于耐药性细菌感染。细菌多重耐药和超级耐药问题日益突出,其中作为引起人类感染性疾病的主要病原之一的革兰氏阴性菌(gram-negativebacteria,gnb)对临床常用抗生素有很强的耐药性,是当前最受关注的耐药菌[https://en.wikipedia.org/wiki/antimicrobial_resistance]。2017年who首次公布对人类健康构成最大威胁的12种耐药细菌名单,其中9种为革兰氏阴性菌[nature543,15(02march2017)doi:10.1038/nature.2017.21550][https://news.un.org/zh/story/2017/02/271472]。特别指出:2009年在肺炎克雷伯菌中发现了质粒介导的超级碳青霉烯耐药基因ndm-1和2015年在大肠埃希氏菌中发现了质粒介导的超级黏菌素耐药基因mcr-1[antimicrobagentschemother.2009;53(12):5046][lancetinfectdis.2010;10(9):597][lancetinfectdis.2016;16(2):161],几乎使临床治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素最后防线全线失守。随着抗生素耐药日益严重和即将到来的后抗生素时代,研发抗生素替代生物药物具有紧迫性和巨大应用前景。
技术实现要素:
本发明的一个方面,提供了一种重组腺病毒,其包含编码bpi-fc融合蛋白的嵌合基因,其中所述嵌合基因包含人bpi功能片段的编码序列和人免疫球蛋白重链恒定区fc基因,其中所述人bpi功能片段的编码序列的3’端直接或通过人免疫球蛋白铰链区连接至fc基因。
在一个实施方式中,本发明所述腺病毒为选自如下血清型的腺病毒载体:ad5、ad2和ad55血清型;优选为ad5血清型。
在一个优选实施方式中,本发明所述人bpi功能片段选自人bpi1-199片段和人bpi1-193片段,优选为人bpi1-199片段。
在一个实施方式中,本发明所述人免疫球蛋白重链恒定区fc基因选自cγ1、cγ2、cγ3、cα1、cα2和cμ基因或其等位体基因,优选为cγ1基因。
在本发明的另一个实施方式中,所述编码bpi-fc融合蛋白的嵌合基因从5'至3'依次具有:人bpi信号肽编码序列、bpi1-199编码序列、人免疫球蛋白铰链区和fcγ1的编码序列,优选地,在5’端和3’端分别连接有cmv启动子和sv40polya表达控制元件。在一个具体实施方式中,编码所述的bpi-fcγ1融合蛋白的bpi-fcγ1嵌合基因的核苷酸序列如seqidno:1所示,优选地,其中bpi1-199的第4-24氨基酸残基的编码序列经修饰改变为seqidno:2。
在优选实施方式中,本发明提供了ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒,其能够感染动物细胞并表达bpi-fcγ1融合蛋白,用于直接杀伤、并通过激活补体和调理吞噬快速高效杀伤多重耐药革兰氏阴性菌,并且所述重组腺病毒在体内多重耐药革兰氏阴性菌感染模型动物治疗中取得了成功。
本发明的又一方面提供了所述的重组腺病毒用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的用途,其中所述的耐药革兰氏阴性菌包括多重耐药革兰氏阴性菌,具体涉及多重耐药机制的耐药革兰氏阴性菌。具体地,所述耐药革兰氏阴性菌包括大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌。在具体的方面,所述耐药革兰氏阴性菌携带耐药基因,所述耐药基因是超广谱耐药基因esbls或超级耐药基因ndm-1。
在另一个方面,本发明提供了用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物组合物,所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的重组腺病毒,以及药学可接受的载体。
本发明的又一方面提供了所述的重组腺病毒在制备用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物中的用途,其中所述的耐药革兰氏阴性菌包括多重耐药革兰氏阴性菌,具体涉及多重耐药机制的耐药革兰氏阴性菌。具体地,所述耐药革兰氏阴性菌包括大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌。在具体的方面,所述耐药革兰氏阴性菌携带耐药基因,所述耐药基因是超广谱耐药基因esbls或超级耐药基因ndm-1。
在本发明的另一个方面中,提供了一种制备重组腺病毒的方法,该重组腺病毒包含编码bpi和fc的融合蛋白的核苷酸序列,该方法包括如下步骤:
(a)提供腺病毒骨架载体;
(b)提供携带bpi和fc的融合蛋白编码序列表达盒的穿梭表达载体;
(c)使步骤(a)的腺病毒骨架载体与步骤(b)的穿梭表达载体共转染宿主细胞进行同源重组,以获得重组腺病毒。
在一个优选实施方式中,所述方法还包括如下步骤:
(d)用步骤(c)中所得的重组腺病毒感染宿主细胞,和
(e)从被感染的宿主细胞中获得重组腺病毒。
发明详述
杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeablityincreasingprotein,bpi)是1978年weiss等首次在人多形核中性粒细胞中发现的一种分子量约为55kd阳离子抗菌蛋白,该抗菌蛋白由456个氨基酸残基组成;其n端功能片段(n端区域第1-199个氨基酸残基的bpi1-199片段及其c端截短6个氨基酸的第1-193氨基酸残基的bpi1-193片段)具有与人天然bpi相同的高亲和力结合革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide,lps)和类脂a、中和内毒素(endotoxin)和直接杀伤革兰氏阴性菌的作用。xoma公司自1990s开始研发重组人bpin端功能片段(
免疫球蛋白(immunoglobulin,ig)包括一个具有许多相似结构但重要结构不同的蛋白家族,这些不同的重要结构导致不同的抗原结合特性和其他生物学活性。人ig可分为igg、iga、igm、igd和ige五类,其中igg,iga和igm这三类还有亚类、在抗感染免疫防御中起重要作用。igg的重链恒定区fc(fragmentcrystallizable,fc;fc的编码序列称为fc基因):cγ1、cγ2和cγ3具有激活补体和介导调理吞噬双重功能;iga的重链恒定区fc:cα1、cα2具有介导调理吞噬功能;igm的重链恒定区fc:cμ具有强大的激活补体功能并能通过c1b与巨噬细胞结合以促进吞噬(虽不能独立调理吞噬)。[medicalimmunologyisbn:9787117208215]
由bpi或其n端功能片段与ig重链恒定区fc或其等位体嵌合组成的ig样bpi-fc融合蛋白,可兼备bpi和免疫球蛋白fc双重功能,即具有bpi靶向结合lps和类脂a并直接杀伤革兰氏阴性菌,还具有通过fc激活补体和调理吞噬快速杀伤革兰氏阴性菌,其作用机制能克服革兰氏阴性菌耐药。
基因治疗(genetherapy)是将功能基因导入体内器官、组织或细胞中表达进行疾病治疗的方法。基因治疗载体分为两大类:病毒载体(主要包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体,另外还有使用较少的牛痘病毒载体、痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体等)和非病毒载体(主要包括裸露dna、脂质体、纳米载体等)。腺病毒载体具有宿主细胞范围广,能有效感染分裂细胞和非分裂细胞,dna不与宿主细胞基因组整合、不存在插入突变风险,目的基因在体内持续表达2~3周,有较强的免疫原性、难以重复治疗等特点。[anderson,nature,392:25(1998)][franciss.collins,scottgottlieb.thenextphaseofhumangene-therapyoversight.2018(https://doi.org/10.1056/nejmp1810628)]。
在pct/cn2005/000986、cn200580000538.1公开了一种包含bpi-fc嵌合基因的重组腺伴随病毒,用于在小鼠体内革兰氏阴性菌[e.colio111:b4(cmcc(b)no.44101-9;抗生素敏感]感染模型动物治疗。鉴于临床上重症革兰氏阴性细菌感染会发展为对抗生素严重耐药并急需得到有效中短期治疗,本发明人经过深入研究,进一步提供了本发明技术方案:构建了一种包含bpi-fc嵌合基因的重组腺病毒,证实其在多重耐药(携带耐药基因)革兰氏阴性菌体外实验模型和体内感染模型动物治疗中取得了成功,同时率先明确提出运用腺病毒载体介导目的基因不与宿主细胞基因组整合、在体内持续高效表达2~3周的特点,将其作为耐药革兰氏阴性菌感染的中短期抗生素替代治疗药物,具有显著的优势和实用性。
下面就本发明的目的和实施做进一步阐述,本领域的技术人员对本发明的所涉及的范围、内容和优点是显而易见的。尽管本发明提供了优选的实施例,本领域的技术人员将认识到各种修改和变化也在本说明的范围内。
基因治疗病毒载体主要包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体等。其中腺病毒载体主要有ad5、ad2和ad55等常用血清型,具有宿主细胞范围广,能有效感染分裂细胞和非分裂细胞,dna不与宿主细胞基因组整合、不存在插入突变风险,目的基因在体内持续表达2~3周。鉴于临床上重症革兰氏阴性菌感染会发展为对抗生素严重耐药,有效的中短期抗生素替代治疗药物具有巨大优势和应用前景。本发明构建了一种包含bpi-fc嵌合基因的重组腺病毒作为耐药革兰氏阴性菌感染的中短期抗生素替代治疗药物。
bpin端功能片段bpi1-199及其c端截短6个氨基酸的bpi1-193具有与人天然bpi相同的中和内毒素和直接杀伤革兰氏阴性菌的作用,本发明实施例中优选bpi1-199。
iggfc:cγ1、cγ2和cγ3具有激活补体和介导调理吞噬双重功能;igafc:cα1、cα2具有介导调理吞噬功能;igmfc:cμ具有强大激活补体功能并能通过c1b与巨噬细胞结合以促进吞噬(但不能独立调理吞噬)。本发明实施例中优选抗感染中起重要作用、具有激活补体和介导调理吞噬双重功能的igg1重链恒定区fcγ1。
在优选实施方式中,本发明提供了一种ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒,其包含编码bpi和fc的融合蛋白的核苷酸序列,该编码序列从5'至3'依次具有:人bpi信号肽编码序列、bpi1-199编码序列、人免疫球蛋白铰链区和fcγ1的编码序列,优选地,在5’端和3’端分别连接有cmv启动子和sv40polya表达控制元件。在一个具体实施方式中,编码所述的bpi-fcγ1融合蛋白的bpi-fcγ1嵌合基因的核苷酸序列如seqidno:1所示,优选地,其中bpi1-199第4-24氨基酸残基的编码序列经修饰改变为seqidno:2。
本发明的ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒感染动物细胞介导表达的bpi-fcγ1融合蛋白(在以下实施例和附图中称为bpi-fcγ1蛋白)在体外可直接杀伤、并通过激活补体和调理吞噬快速高效杀伤耐药革兰氏阴性菌,并且在小鼠和人新鲜全血中(模拟体内血液血清补体和吞噬细胞环境)杀伤多重耐药(携带耐药基因)革兰氏阴性菌;所述的ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒在体内多重耐药(携带耐药基因)革兰氏阴性菌感染模型动物治疗中取得了成功。
本发明实施例中例示的耐药革兰氏阴性菌如下:
1.e.colipbr322/bl21(de3)
耐药基因(抗生素抗性基因):ampr和tetr
耐药抗性:ampicillin、tetracycline
2.e.colipet28a-egfp/bl21(de3)
耐药基因:kanr
耐药抗性:kanamycin
3.鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii)atccbaa-1605(多重耐药)
耐药抗性:ceftazidime、gentamicin、ticarcillin、piperacillin、aztreonam、cefepime、ciprofloxacin、imipenem和meropemem
4.肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)atcc700603(具有荚膜)(多重耐药,esbls)
耐药基因:klebsiellapneumoniaeplasmid-encodedextended-spectrumbeta-lactamase(blashv-18)gene
耐药抗性:ampicillin、aztreonam、cefoxitin、cefpodoxime、ceftazidime、chloramphenicol、piperacillin、tetracycline
5.大肠埃希氏菌(escherichiacoli)(ndm-1)atccbaa-2469
耐药基因:newdelhimetallo-beta-lactamase(ndm-1)(blandm-1超级耐药基因)
耐药抗性:carbepenem-resistant(imipenem和ertapenem)
2017年2月27日who发表了全球首份抗生素耐药“重点病原体”清单,即对人类健康构成最大威胁的12种细菌种族(families)的目录,以指导和促进新型抗生素的研究与开发,努力解决日益严重的全球抗微生物药物耐药性问题。who根据对新型抗生素的迫切需求程度将清单分为极为重要、十分重要和中等重要三个类别。最为重要的一组包括在医院、养老院以及需要用通气机和血液导管等装置进行护理的患者中带来特定威胁的一些耐多药细菌,包括不动杆菌属、假单胞菌属和各种肠杆菌科,包括克雷伯氏菌属、大肠杆菌、沙雷氏菌属和变形杆菌属。这些细菌可引起严重且常常致命的感染,例如血流感染和肺炎,而且已经对大量抗生素产生了耐药性,包括碳青霉烯类和目前用于治疗耐多药细菌的最佳可用抗生素——第三代头孢菌素类药物。清单中的第二和第三个层级中含有其他一些日益出现耐药并引起更常见疾病的细菌,例如淋病和由沙门氏菌引起的食物中毒。本发明实施例中优选的耐药革兰氏阴性菌及其耐药机制符合上述极为重要类别,并具有各类别多重耐药(包括耐药基因)的广泛代表性;其中,多重耐药涉及:resistanttoampicillin,tetracycline(四环素类),kanamycin(氨基糖甙类),aztreonam,cefoxitin,cefpodoxime,ceftazidime,chloramphenicol,piperacillin,gentamicin(氨基糖甙类),ticarcillin,cefepime,ciprofloxacin(喹诺酮类),meropemem,imipenem,ertapenemandcarbepenem;耐药基因涉及:ampr,tetr,kanr,extended-spectrumbeta-lactamaseblashv-18,newdelhimetallo-beta-lactamasendm-1。
综上,本发明所述的重组腺病毒,具有作为耐药革兰氏阴性菌感染治疗药物的广泛用途。根据腺病毒载体介导目的基因在体内持续表达2~3周的特点,本发明的所述的重组腺病毒作为耐药革兰氏阴性菌感染中短期抗生素替代治疗药物和免疫功能低下患者中短期预防革兰氏阴性菌感染药物,具有巨大优势和应用前景。
附图说明
图1.ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒液相层析纯化图谱。其中:a、source30q阴离子交换层析图谱;b、captotmcore700复合模式介质层析图谱;c、captotmcore700复合模式介质层析cip在位清洗图谱。
图2.bpi-fcγ1蛋白液相层析纯化及鉴定结果。其中:a、sp
图3.bpi-fcγ1蛋白体外结合lps。其中:a、凝胶半定量法检测结果;b、终点显色法定量检测结果。
图4.bpi-fcγ1蛋白体外杀伤并通过激活补体增强杀伤耐药革兰氏阴性菌。其中:a、体外杀菌及小鼠血清补体增强杀菌作用;b、体外杀菌及人血清补体增强杀菌作用。
图5.bpi-fcγ1蛋白体外调理balb/c小鼠腹腔吞噬细胞吞噬e.colipet28a-egfp/bl21(de3)示踪实验。其中:a、吞噬(荧光)示踪实验。b、各组实验吞噬现象统计结果。
图6.bpi-fcγ1蛋白体外调理人单核细胞系u937细胞吞噬e.colipet28a-egfp/bl21(de3)示踪实验。
图7.bpi-fcγ1蛋白体外调理人外周血白细胞吞噬e.colipet28a-egfp/bl21(de3)示踪实验。
图8.bpi-fcγ1蛋白体外调理吞噬杀伤e.colipbr322/bl21(de3)。其中:a、balb/c小鼠腹腔吞噬细胞吞噬杀菌结果;b、u937细胞吞噬杀菌结果。
图9.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤耐药基因e.colipbr322/bl21(de3)。
图10.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤多重耐药鲍曼不动杆菌。其中:a、小鼠全血实验;b、人全血实验。
图11.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤多重耐药(包括耐药基因)肺炎克雷伯菌。其中:a、小鼠全血实验;b、人全血实验。
图12.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤超级耐药基因大肠埃希氏菌(ndm-1)。
图13.ad5-bpi-fcγ1感染小鼠血清表达bpi-fcγ1蛋白westernblot检测结果。
下面结合实施例和附图进一步说明本发明的技术方案,但不限于本实施例。更具体地说,实施例一涉及ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒的构建。实施例二涉及ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒介导哺乳动物细胞表达bpi-fcγ1蛋白。实施例三涉及bpi-fcγ1蛋白体外直接杀伤并通过激活补体和调理吞噬增强杀伤耐药革兰氏阴性菌。实施例四涉及bpi-fcγ1蛋白在小鼠和人全血中杀伤耐药革兰氏阴性菌。实施例五涉及ad5-bpi-fcγ1重组病毒对耐药革兰氏阴性菌感染模型动物的保护作用。
实施例一包含bpi-fc嵌合基因的一种ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒的构建
1.pdc316-bpi-fcγ1腺病毒穿梭表达载体的构建
按常规分子克隆实验技术,用ecori/sali双酶切(其中ecori部分酶切)pscm-bpim23-fcγ1质粒(本发明人构建),回收的1.39kbecori/sali酶切片段(为bpi-fcγ1嵌合基因,其序列如seqidno:1所示,从5'至3'依次具有编码人bpi信号肽、bpi1-199、人免疫球蛋白铰链区和fcγ1的核苷酸序列;其中bpi1-199第4-24氨基酸残基的天然编码序列经基因合成修饰改变为seqidno:2);将回收的酶切片段构建插入到pdc316穿梭质粒(microbix)的ecori/sali酶切位点上,转化到e.colidh5α;经鉴定正确构建得到穿梭表达载体pdc316-bpi-fcγ1。
所述穿梭表达载体pdc316-bpi-fcγ1业已于2018年11月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc,中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏号为cgmccno.:16719,分类命名为大肠埃希氏菌escherichiacoli。
2.ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒的包装及其制备
简述如下:参照admaxtmsystem(kitd)手册(microbix),用常规
实施例二ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒介导哺乳动物细胞表达bpi-fcγ1蛋白及其提纯
cellspin&spinnerflask(integrabiosciencesag)中接种cho-dg44细胞(gibco)与ad5-bpi-fcγ1重组腺病毒(moi=40)(于无血清培养基cddg44medium,37℃,8%co2,静置培养2h),再加适量sp
实施例三bpi-fcγ1蛋白的生物功能:体外结合lps、直接杀伤并通过激活补体和调理吞噬增强杀伤耐药革兰氏阴性菌。
e.colipbr322/bl21(de3)(经氨苄青霉素选择培养)和e.colipet28a-egfp/bl21(de3)(经卡那霉素选择培养,并经1mmiptg在30℃下诱导16h表达egfp)开展体外杀伤耐药革兰氏阴性菌研究。
1.bpi-fcγ1蛋白体外结合lps
1.1于无内毒素的96孔酶标板中,每孔加入200μl0.5μg/mlpbs稀释的羊抗人igg-fc(novex),4℃包被过夜,用pbst(含0.1%tween-20的pbs)清洗平板(5分钟/次,共3次);然后每孔加入200μl含5%bsa的pbst溶液,37℃封闭1h,再用pbst清洗平板(5分钟/次,共3次);于每孔中加入200μlbpi-fcγ1蛋白(0μg/ml和8μg/ml)和lps(内毒素标准品,8eu/ml)的孵育混合物(涡旋混匀,37℃,30min),37℃孵育1h。按鲎试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)说明书凝胶半定量实验方法操作。结果如图3a所示:bpi-fcγ1蛋白能有效结合lps。
1.2于无内毒素的96孔酶标板中,每孔加入200μl0.5μg/mlpbs稀释的羊抗人igg-fc(novex),4℃包被过夜,用pbst清洗平板(5分钟/次,共3次);然后每孔加入200μl含5%bsa的pbst溶液,37℃封闭1h,再用pbst清洗平板(5分钟/次,共3次);于每孔中加入200μl含不同浓度bpi-fcγ1蛋白(0.025μg/ml和0.1μg/ml;阴性及阳性对照均以等量无内毒素pbs替代)和lps(内毒素标准品,0.05eu/ml;阴性对照以细菌内毒素检查用水替代)的孵育混合物(涡旋混匀,37℃,30min),37℃孵育1h。于每孔取100μl孵育样品按toxinsensortm内毒素检测试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司,l00350)说明书进行显色反应,测定od545nm值并计算样品内毒素含量。结果如图3b所示:bpi-fcγ1蛋白能有效结合lps,且其结合能力呈现剂量依赖关系。
2.bpi-fcγ1蛋白体外杀菌并通过激活补体杀伤耐药革兰氏阴性菌
2.1bpi-fcγ1蛋白体外杀菌及小鼠血清补体增强杀菌作用
取50μle.colipbr322/bl21(de3)菌液(2.5×105cfu/ml,稀释于10%hanks40mmtris-hcl0.1%酪蛋白氨基酸ph7.5;阴性对照以等量该缓冲液替代)与50μlbpi-fcγ1蛋白(0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照均以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃水浴3h;再加入100μl4%balb/c小鼠血清(pbs稀释;对照组以等量pbs替代),37℃水浴1h;菌液稀释后倾注法计数。结果如图4a所示:bpi-fcγ1蛋白在体外可有效杀伤革兰氏阴性菌,并可通过与小鼠血清补体交叉作用、激活小鼠补体增强杀菌效应,其杀菌效率与剂量呈正相关。
2.2bpi-fcγ1蛋白体外杀菌及人血清补体增强杀菌作用
方法如上(2.1),采用4%人血清进行实验(同时将bpi-fcγ1蛋白浓度改为1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml)。结果如图4b所示:bpi-fcγ1蛋白在体外可有效杀伤革兰氏阴性菌,且可通过激活人血清补体增强杀菌效应,其杀菌效率与剂量呈正相关。
3.bpi-fcγ1蛋白体外通过调理吞噬杀伤耐药革兰氏阴性菌
3.1bpi-fcγ1蛋白调理吞噬耐药革兰氏阴性菌示踪实验
3.1.1分离balb/c小鼠腹腔吞噬细胞:小鼠脱椎处死,75%乙醇浸泡5-10min;去除小鼠腹腔皮毛,保持腹膜完整;取适量dmem培养基注射入小鼠腹腔,轻轻按摩5min;抽出小鼠腹腔细胞悬液,300g,5min离心收集细胞;完全培养基(含10%nbs的dmem培养基)重悬后接种于24孔板(含细胞爬片),37℃,8%co2培养3-7天。以dii(beyotime)染色20min,pbs洗涤3次备用;取50μle.colipet28a-egfp/bl21(de3)菌液(pbs洗涤并制备成2×109cfu/ml悬液;阴性对照以等量pbs替代)与50μlbpi-fcγ1蛋白(20μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照均以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃孵育10min,后均匀覆盖于细胞上,37℃孵育60min;pbs洗涤3次,固定液(乙酸:甲醇为1:3的混合液)固定5min,pbs洗涤3次,将爬片反置于载玻片上,封片,荧光显微镜下观察。结果如图5a所示:dii标识小鼠腹腔吞噬细胞(dii,红色荧光),诱导表达的egfp标识e.colipet28a-egfp/bl21(de3)(egfp,绿色荧光),并进行两种标识图像叠加处理(dii+egfp),箭头标示吞噬现象(细胞膜或胞内见egfp绿色荧光),可见bpi-fcγ1蛋白可与小鼠种属fc受体交叉作用并显著促进小鼠吞噬细胞吞噬e.colipet28a-egfp/bl21(de3);图5b统计结果显示添加bpi-fcγ1蛋白促使吞噬率由25%提高至92.5%。
3.1.2收集人单核细胞系u937细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,4×106cells),以dii染色30min,pbs洗涤2次备用;取110μle.colipet28a-egfp/bl21(de3)菌液(pbs洗涤并制备成2×109cfu/ml悬液;阴性对照以等量pbs替代)与110μlbpi-fcγ1蛋白(40μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照均以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃孵育20min;取200μl混合物与u937细胞混匀,37℃,150rpm震荡孵育2.5h;200g,1min离心弃上清,并以pbs洗涤2次;4%组织细胞固定液(solarbio)固定10min;pbs和超纯水依次各洗涤1次,取适量封片液重悬细胞后滴加于载玻片上,封片,荧光显微镜下观察。结果如图6所示:标识同上(3.1.1),可见bpi-fcγ1蛋白可显著促进u937细胞吞噬e.colipet28a-egfp/bl21(de3)。
3.1.3采用人外周血白细胞分离液试剂盒(solarbio)分离并收集人白细胞(4×106cells)。方法如上(3.1.2),其中变为:取150μl混合物与人白细胞混匀,37℃,200rpm震荡孵育1h。结果如图7所示:标识同上(3.1.1),由于人白细胞为非单一组成的细胞,不同类型的吞噬细胞dii着色效果及荧光淬灭时间不同,dii未能均匀标识出所有吞噬细胞,因此增加可见光拍摄图以便对照,结果如图7所示:bpi-fcγ1蛋白可显著促进人白细胞吞噬e.colipet28a-egfp/bl21(de3)。
3.2bpi-fcγ1蛋白体外通过调理吞噬杀伤耐药革兰氏阴性菌
1)分离balb/c小鼠腹腔吞噬细胞(同上3.1.1方法)接种于96孔板,37℃,8%co2培养1-3天备用(汇合度>80%);取30μle.colipbr322/bl21(de3)菌液(pbs洗涤并制备成2×107cfu/ml悬液;阴性对照以等量pbs替代)与30μlbpi-fcγ1蛋白(4μg/ml、2μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃水浴10min,后均匀覆盖于细胞上,37℃孵育60分钟;各孵育样品混匀后取20μl进行倍比稀释(10-1~10-5),并将各稀释样分别取100μl进行倾注法菌落计数;同时以cho-dg44细胞作为对照,进行以上操作。
2)收集人单核细胞系u937(2×106cells),pbs洗涤2次备用;取60μle.colipbr322/bl21(de3)菌液(pbs洗涤并制备成2×107cfu/ml悬液;阴性对照以等量pbs替代)与60μlbpi-fcγ1蛋白(2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃水浴20min;取100μl混合物与u937细胞混匀,37℃200rpm震荡孵育1h(96孔板中);各孵育样品300g,5min离心收集上清,并分别取20μl进行倍比稀释(10-1~10-5),并将各稀释样分别取100μl进行倾注法菌落计数;同时以cho-dg44细胞作为对照,进行以上操作。
结果如图8所示:bpi-fcγ1蛋白体外可通过调理小鼠腹腔吞噬细胞(图8a)和u937细胞(图8b)吞噬杀伤耐药革兰氏阴性菌,其吞噬杀菌率与bpi-fcγ1蛋白浓度呈正相关。
实施例四bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤耐药革兰氏阴性菌
e.colipbr322/bl21(de3)、鲍曼不动杆菌atccbaa-1605、肺炎克雷伯菌atcc700603(具有荚膜)和大肠埃希氏菌(ndm-1)atccbaa-2469(分别经氨苄青霉素、亚胺培南、头孢西丁和亚胺培南选择培养)开展新鲜全血(含血清补体和吞噬细胞)杀伤耐药革兰氏阴性菌研究。
1.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤耐药基因e.colipbr322/bl21(de3)
鉴于(健康志愿者)新鲜人全血对e.colipbr322/bl21(de3)产生强抵抗(如血清型反应和吞噬清除),本研究开展在小鼠全血中杀伤e.colipbr322/bl21(de3)。
取20μle.colipbr322/bl21(de3)菌液(5×105cfu/ml,pbs稀释;阴性对照以等量pbs替代)与20μl不同浓度的bpi-fcγ1蛋白(5μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃孵育10min;加入80μl新鲜0.4%柠檬酸钠抗凝babl/c小鼠全血,混匀并于37℃孵育3h;适当稀释后各取100μl进行倾注法计数。结果如图9所示:bpi-fcγ1蛋白在全血中对耐药基因e.colipbr322/bl21(de3)具有显著杀伤效果,其杀菌效率与蛋白剂量呈正相关;其中当蛋白浓度为0.5和5μg/ml时,相应杀菌率分别为71.5%和99.5%。结合图4及图8结果可知bpi-fcγ1蛋白在全血中可通过激活补体及调理吞噬高效杀伤革兰氏阴性菌。
2.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤多重耐药鲍曼不动杆菌(atccbaa-1605)
2.1在小鼠全血中杀伤鲍曼不动杆菌
取20μl鲍曼不动杆菌(atccbaa-1605)菌液(1×104cfu/ml)与20μl不同浓度的bpi-fcγ1蛋白(50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃孵育10min;加入80μl新鲜0.4%柠檬酸钠抗凝babl/c小鼠全血,混匀并于37℃孵育1h;适当稀释后各取100μl进行倾注法计数。结果如图10a所示:bpi-fcγ1蛋白在小鼠全血中对多重耐药鲍曼不动杆菌具有明显杀伤效果,其杀菌效率与蛋白剂量呈正相关;其中当蛋白浓度为50μg/ml时,相应杀菌率为25.4%。
2.2在人全血中杀伤鲍曼不动杆菌
方法如上(2.1),采用人血进行实验。结果如图10b所示:bpi-fcγ1蛋白在人全血中对多重耐药鲍曼不动杆菌具有显著杀伤效果,其杀菌效率与蛋白剂量呈正相关;其中当蛋白浓度为0.5、5和50μg/ml时,相应杀菌率分别达到6.9%、13.2%和43.4%。
3.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤多重耐药(包括耐药基因)肺炎克雷伯菌(atcc700603)
3.1在小鼠全血中杀伤肺炎克雷伯菌
取50μl肺炎克雷伯菌(atcc700603)(1×104cfu/ml,pbs稀释;阴性对照以等量pbs替代)与50μl不同浓度的bpi-fcγ1蛋白(1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃孵育3h;加入100μl新鲜0.4%柠檬酸钠抗凝babl/c小鼠全血,混匀并于37℃孵育1h;适当稀释后各取100μl进行倾注法计数。结果如图11a所示:当bpi-fcγ1蛋白达到较高有效浓度时,在小鼠全血中对具有荚膜(可抵抗吞噬作用和阻碍bpin端功能片段结合lps)的多重耐药(包括耐药基因)肺炎克雷伯菌具有明显杀伤效果,其杀菌效率与蛋白剂量亦呈正相关;其中当蛋白浓度为500和1000μg/ml时,相应杀菌率分别达到82.5%和98.3%。
3.2在人全血中杀伤肺炎克雷伯菌
方法如上(3.1),采用人血进行实验。结果如图11b所示:同小鼠全血杀伤效果,当bpi-fcγ1蛋白达到有效浓度时,bpi-fcγ1蛋白在人全血中对多重耐药(包括耐药基因)肺炎克雷伯菌具有明显杀伤效果,其杀菌效率与蛋白剂量亦呈正相关;其中当蛋白浓度为500和1000μg/ml时,相应杀菌率分别达到76.7%和94.0%。
4.bpi-fcγ1蛋白在全血中杀伤超级耐药基因大肠埃希氏菌(ndm-1)
鉴于(健康志愿者)新鲜人全血对大肠埃希氏菌(ndm-1)产生强抵抗(如血清型反应和吞噬清除),本研究开展在小鼠全血中杀伤大肠埃希氏菌(ndm-1)。
取20μl大肠埃希氏菌(ndm-1)(atccbaa-2469)(1×104cfu/ml)与20μl不同浓度的bpi-fcγ1蛋白(50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml,稀释于蛋白保存液;阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀,37℃孵育1h;加入80μl新鲜0.4%柠檬酸钠抗凝babl/c小鼠全血,混匀并于37℃孵育1h;适当稀释后各取100μl进行倾注法计数。结果如图12所示:bpi-fcγ1蛋白在全血中对超级耐药基因大肠埃希氏菌(ndm-1)具有显著杀伤效果,其杀菌效率与蛋白剂量呈正相关;其中当蛋白浓度为5和50μg/ml时,相应杀菌率分别达到21.8%和70.7%。
实施例五ad5-bpi-fcγ1重组病毒介导bpi-fcγ1蛋白在小鼠体内表达及对耐药革兰氏阴性菌感染模型动物的保护作用
1.ad5-bpi-fcγ1重组病毒介导bpi-fcγ1蛋白在小鼠血清中表达
5-6周龄balb/c小鼠腹腔注射ad5-bpi-fcγ1重组病毒(5×108iu/100μl/每只)(实验设ad5-null对照组),分别于注射病毒后第3天和第5天摘除眼球采血获得血清。用饱和硫酸铵沉淀法处理血清获得粗提免疫球蛋白沉淀物,简述如下:1)取0.5ml血清中加入等量生理盐水混匀,搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵1ml,4℃静置1h,3000rpm离心20min,弃上清;2)以生理盐水溶解沉淀至1ml,再逐滴加入饱和硫酸铵0.5ml,4℃静置3h,3000rpm离心20min,弃上清;3)重复2)1次,得到粗提免疫球蛋白沉淀物;4)用1mlpbs将其溶解后转至透析袋中用pbs充分透析,后将透析袋包埋于聚乙二醇中吸水浓缩至50ul血清免疫球蛋白浓缩液备用。常规elisa检测:用人iggelisa试剂盒(1750)(购自alphadiagnostic)检测;结果显示:在注射ad5-bpi-fcγ1后的第3天和第5天,小鼠血清中bpi-fcγ1蛋白表达水平分别为21.4±0.2ng/ml(n=3)和30.5±7.4ng/ml(n=3)(注:ad5-null对照组未检测到)。常规westernblot检测:用hrp标记羊抗人iggfc多抗(购自英国kpl公司)检测,按westernblot发光试剂盒(购自pierce)操作说明,用x光胶片曝光显影;结果如图13所示:在96kd出现预期的ad5-bpi-fcγ1感染小鼠血清表达bpi-fcγ1蛋白谱带(非还原),而ad5-null对照组没有(注:在140kd出现的谱带被认为是羊抗人iggfc多抗与小鼠igg发生交叉的谱带)。
2.ad5-bpi-fcγ1重组病毒对耐药革兰氏阴性菌感染小鼠的保护作用
从前述实施例涉及的耐药革兰氏阴性菌中选取e.colipbr322/bl21(de3)(ampr和tetr基因)和肺炎克雷伯菌(atcc700603)(分别经氨苄青霉素和头孢西丁选择培养)开展研究。
2.1耐药革兰氏阴性菌感染balb/c小鼠的最低致死量测定
用含5%高活性干酵母
2.2ad5-bpi-fcγ1重组病毒对耐药基因e.colipbr322/bl21(de3)感染小鼠的保护作用
对随机分组(每组10只)的6-7周龄balb/c小鼠每只腹腔注射5×108iu/100μlad5-bpi-fcγ1重组病毒(实验设pbs对照组和ad5-null对照组),于第3天对每只小鼠腹腔注射mld致死量耐药革兰氏阴性菌进行感染攻击,观察小鼠72小时内的死亡情况。结果如表1所示:ad5-bpi-fcγ1重组病毒转染小鼠对致死量耐药基因e.colipbr322/bl21(de3)(ampr和tetr基因)感染攻击具有显著保护作用。
表1.对致死量耐药基因e.colipbr322/bl21(de3)感染攻击的保护作用
(与ad5-null和pbs组相比:#p<0.05)
2.3ad5-bpi-fcγ1重组病毒对多重耐药肺炎克雷伯菌感染小鼠的保护作用
方法如上(2.2),结果如表2所示:ad5-bpi-fcγ1重组病毒转染小鼠对致死量多重耐药(包括耐药基因)肺炎克雷伯菌(atcc700603)感染攻击具有显著保护作用。
表2.对致死量多重耐药肺炎克雷伯菌感染攻击的保护作用
注:*mld为1×106cfu/0.5ml,**mld为2.5×106cfu/0.5ml。
(与ad5-bpi-fcγ1组相比:#p<0.05,##p<0.01)
序列表
<110>厦门联合安金生物工程有限公司
安君(北京)基因科技有限责任公司
<120>包含bpi-fc嵌合基因的重组腺病毒及其用途
<130>idc180251
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1389
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
aattcggtaccatgagagagaacatggccaggggcccttgcaacgcgccgagatgggtgt60
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