源于草酸青霉的iso-PenicillixanthoneA及在淋巴瘤方面的应用的制作方法

本发明涉及一种源于草酸青霉的iso-penicillixanthonea及其在淋巴瘤方面的应用，属于生物医药领域。

背景技术：

随着科技的发展，我们的医疗水平已提高许多，但是癌症的发病率呈现日益增长的趋势，是造成全球死亡的第二大原因。恶性淋巴瘤（malignantlymphoma，ml）是一组起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤的总称，是发病率增长最快的血液系统，其早期症状不典型，其首发症状个体差异大，病变可发生在身体的任何部位，称得上是肿瘤中的“变色龙”。恶性淋巴瘤常发生于青壮年，发病原因至今不明。

青霉蒽酮是一类由真菌次级代谢产生的蒽醌类有机化合物，自2002年青霉蒽酮a首次从penicilliumthomii中发现至今，已经过去了十多年。该类化合物至今被报道了2个，分别是青霉蒽酮a、b且都是2-4’连接。该类化合物对肿瘤细胞抑制明显，是开发抗肿瘤药物或者肿瘤细胞增殖抑制剂的理想原料。但是对于他们对映体的抗肿瘤活性研究还是空白。

本发明人研究得知，草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，武汉大学，保藏编号是：cctccno：m2013714)的发酵产物的粗提取物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示青霉蒽酮类化合物具有抗人淋巴瘤活性，目前尚未见该化合物对人淋巴瘤细胞的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种源于草酸青霉的iso-penicillixanthonea及其在淋巴瘤方面的应用。该化合物具有抑制淋巴瘤细胞增殖作用，具有抗人淋巴瘤活性。其结构式为：

。

该化合物的制备方法，是通过发酵培养草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，获取发酵菌丝体，然后从菌丝体中分离纯化出该化合物。具体步骤如下：

1发酵生产

培养微生物的常规方法，取草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6接种到平板固体培养基上在28℃培养箱中培养2-3d，然后接种到真菌培养基中，28℃静止培养30d后，经多层纱布过滤获得菌丝体和发酵液；所述真菌培养基成分：葡萄糖10.0g、麦芽糖20.0g、甘露醇20.0g、味精10.0g、酵母膏3.0g、nacl15.0g、kh2po40.5g、mgso4·7h2o0.3g、超纯水定容至1l。

2浸膏的获得

用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到含丙酮和水的菌丝体的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再以水溶液与乙酸乙酯体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，浓缩蒸干获得菌丝体浸膏36.5g。

3化合物的分离精制

菌丝体浸膏通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析、合并、分离成组分a-e。组分c(12.7g)以二氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（sephadexlh-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分c1-c4。亚组分c3(4.9g)通过半制备液相色谱(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分离流速为5ml/min，流动相为55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(510mg，tr22.8min)。

所述草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，武汉大学，保藏编号是：cctccno：m2013714。

本发明还包括了所述的化合物在制备抑制人淋巴瘤细胞增殖药物中的应用，及该化合物在制备抗人淋巴瘤药物中的应用。

本发明的显著优点：研究所示该青霉蒽酮化合物具有显著的抑制人淋巴瘤细胞增殖活性，目前尚未见该化合物对人淋巴瘤细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。

附图说明

图1iso-penicillixanthonea主要的cosy，hmbc和noe信号。

具体实施方式

在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：

实施例1该化合物的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，武汉大学，保藏编号是：cctccno：m2013714)适量，接种到平板固体培养基上在28℃培养箱中培养2-3d。

取平板培养2-3d的草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6适量，接种到装有400ml培养液[培养液组成（克/升）：葡萄糖10.0、麦芽糖20.0、甘露醇20.0、味精10.0、酵母膏3.0、nacl15.0、kh2po40.5、mgso4·7h2o0.3，超纯水定容至1l]，28℃静止培养30d后，获得菌丝体和发酵液。

2浸膏的获得

用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到含丙酮和水的菌丝体的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再水溶液与乙酸乙酯以体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏36.5g。

3化合物的分离精制

菌丝体浸膏通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分a-e。组分c(12.7g)以二氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（sephadexlh-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分c1-c4。亚组分c3(4.9g)通过半制备液相色谱(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分离流速为5ml/min，流动相为55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(510mg，tr22.8min)。

化合物：常温下为黄色粉末，[α]²⁰d+105.6°(c1,pyridine);[α]²⁰d+3.1°(c1,me2co);高分辨电喷雾质谱hresi-ms在m/z：661.1550处给出分子离子峰[m+na]⁺（calcdforc32h30nao14，661.1533）；提示分子量为638，结合波谱信息推测分子式为c32h30o14。¹h和¹³c-nmr数据见表1，主要的cosy，hmbc和noe信号见图1。

表1化合物的¹h和¹³c-nmr数据（500mhz¹hand126mhz¹³c,indmso-d6）

实施例2体外抗肿瘤活性的测试

1实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用dmso配制成100mm的母液，滤膜过滤除菌，保存于-20℃备用。dmso比例控制在1‰以下。

从液氮中取出冻存的细胞株，在37℃水浴锅中迅速溶化，1200rpm离心5min，弃去冻存液，加入1ml培养基吹打后吸入培养瓶中，加入5ml新鲜dmem或rpmi1640培养基，轻轻摇动使细胞在培养基中均匀悬浮，置37℃、5%co2的培养箱中培养。当细胞密度达到90%左右时进行传代，去旧培养基，pbs洗2遍，加入300μl胰酶（确保胰酶能覆盖瓶底），在37℃培养箱中消化至细胞变圆即将脱落时，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化，吹打混匀后分至2-3个新的培养瓶中，补充培养基使细胞在培养箱中继续生长。

细胞增殖抑制活性测试方法（wst-1法）

抗肿瘤细胞活性评价采用wst-1试剂盒检测法，取对数生长期的肿瘤细胞消化后调整细胞浓度为3×10⁴/ml的单细胞悬液，将细胞悬液混匀后取100μl接种于96孔板中，每个浓度设置5个复孔。然后置于37℃、5%co2培养箱内培养过夜。去上清液，用培养基将药物稀释成不同的浓度加到相应的96孔板内，对照组加入含有相同量dmso的培养基。培养72h后，每孔加入10μl的wst-1溶液37℃孵育2h后，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定其在450nm吸光值。计算5孔的平均od值并按照公式：细胞增殖抑制率=（od对照组-od空白组）/（od实验组-od空白组）×100%算出每个浓度的药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，采用graphpadprism5.0软件计算出半数抑制率ic50。

2实验结果

细胞增殖抑制活性测试结果见表2。

表2化合物对人淋巴瘤细胞增殖的抑制活性

3结论

该化合物对人淋巴瘤细胞具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备淋巴瘤细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于淋巴瘤的研究。