一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种重组慢病毒载体、重组慢病毒、含有该重组慢病毒的中国仓鼠卵巢细胞及其应用。
背景技术：
：慢病毒(lentivirus)是逆转录病毒的一种，具有目的片段容量大、感染率高、安全性高，可以感染静止细胞与不产生嵌合体动物等优点，目的基因可以在宿主细胞中长期有效地表达。慢病毒载体已经成为转基因的一种有效的媒介。hofmann等(2003)使用广泛性启动子(lv-pgk)的慢病毒载体把带有绿色荧光蛋白基因(gfp)为目的基因病毒颗粒注入猪的胚胎内。liu等(2013)把egfp基因以慢病毒载体为媒介，注射到46个受精卵的卵周隙中，而后结合胚胎转移技术诞生了8只转基因小羊，egfp在所有组织中均有表达。2017年，brigid等人通过对慢病毒载体进行改造，表达出更高水平的micrornas和蛋白。现在，慢病毒的应用已经延伸到不同的医学和生物学领域，如用于肿瘤治疗，用于hiv感染的治疗，用于研发新药物和新疫苗，用于生产活性蛋白，并取得了良好的效果。opn(osteopontin)是骨桥蛋白，是一种分泌型糖基化磷蛋白，含有264～303个氨基酸，经过剪切和翻译后，会出现25kda～70kda的蛋白带，在不同物种中长度会有差异。研究发现它在哺乳动物的生殖系统中广泛表达，在猪的再生组织，如输卵管、子宫、胎盘和睾丸中，发现opn蛋白的表达。2005年，殷莉等人发现opn在人子宫内膜和滋养细胞有表达，参与受精、胚泡着床及胎盘形成，并对子宫和胎盘的连接起着重要作用。hernandez(2013)等人研究发现，在腺上皮、腔上皮和胎盘中，都有opn的表达，且梅山猪远远高于大白猪。kim(2007)等人利用兔抗人opn抗体在做westernblot检测时，发现opn蛋白在6月龄的公猪睾丸上分别以32kda和66kda的两条带存在，同时，通过免疫荧光检测，在不同阶段的精母细胞中均发现了opn蛋白的存在，在猪的支持细胞上也有少量的存在。这些发现表明opn蛋白存在于大部分生殖细胞中，且与精子发生有密切的关系。opn蛋白属于精液蛋白，早期它就被认定为人类男性生殖能力的一个指标。2006年，lin等人研究发现opn蛋白除了与仔猪成活率有关外，还与公猪的精子活力呈显著正相关，所以，opn可能会成为繁育种群提高精子质量的指标。hao(2006,2008)等人把大鼠的opn蛋白加入猪体外受精体系的液体中，发现opn蛋白可以减少多精入卵，改善胚胎的发育以及减少细胞凋亡。2007年，goncalves等人在做牛体外受精时，在培养液中，让精子和兔抗牛opn抗体共孵育，然后再与卵母细胞结合，研究结果表明opn参与体外受精，且可以阻止多精入卵，结果与hao等人一致。鉴于opn功能的影响，它成为筛选猪繁殖性状中的候选基因之一。有报道表明，猪8号染色体上存在与繁殖性状有关的数量性状定点，猪opn基因刚好位于8号染色体的长臂末端，由6个外显子和5个内含子组成，其cds区为1002bp，编码303个氨基酸(kingetal.,2003；ellegrenetal.,1993)。英、美、欧和pic公司研究发现8号染色体上的opn基因的一个微卫星标记与出生窝仔数有关(shortetal.,1997)。1999年，liaw等人通过微卫星和pcr技术研究母猪opn基因与新生仔猪出生率的关系时发现，opn基因与新生大白猪的成活率显著正相关。孟庆利等人(2005)在研究不同猪种的opn基因型对产仔性状的影响时，发现opn基因与二花脸和苏种猪的产仔数显著相关，可以作为提高猪产仔数的一个遗传标记。对于opn基因来说，不同物种间的同源性差异还是存在的。目前为止，在人、恒河猴、牛、猪、大鼠、小鼠及鸡等多种动物中，他们的opncdna序列具有中度同源性，猪opn和人opn的核酸相似度是78％，与恒河猴opn的序列相似度是79％，与牛的核酸相似度为80％，与大鼠opn的核酸相似度是52.1％，与小鼠opn的核酸相似度是46.7％，与鸡opn的核酸相似度为31.2％，不同物种间的核酸差异也会导致基因在物种间的功能存在差异。在蛋白形成过程中，mrna经过一系列的转录、剪切和成熟后，翻译成蛋白。但是有报道说重组蛋白的mrna水平与蛋白水平是不相关的(barnesetal.,2004)，young和rance(2008)发现分泌蛋白会易位到在细胞的内质网中，降低了表达量，然而替代了信号肽后，蛋白的分泌量大大提高(knappskogetal.,2007；koberetal.,2013；)。无论在原核载体还是真核载体上，不同物种的信号肽功能都是互换的。在cho-k1细胞系中，研究用不同物种的信号肽对重组蛋白表达量的影响时，发现来源于人血清蛋白的hsa(serumalbuminpreproprotein)信号肽可以最大限度的提高分泌蛋白的分泌量(koberetal.,2013；youetal.,2018)。目前上市的大部分重组蛋白都是由cho细胞表达(kimetal.,2010；deleoetal.,2011)，据peces等人统计，截止到2004年，全世界治疗性重组蛋白近70％都是用cho细胞表达系统生产。2011年，何太平等人通过重组真核表达质粒转染cho细胞，建立稳转工程细胞株，成功获得重组人促卵泡激素蛋白。对于opn重组蛋白的表达，原核表达仍是最常见的手段之一，刘祥(2015)等人通过原核表达小鼠骨桥蛋白，成功制备了多克隆抗体。但原核表达的蛋白大部分是包涵体，纯化不方便，对诱导时间和水平无法掌控。在猪上，对受精蛋白opn的研究还有很大空间，需要逐步深入。对于猪源的opn蛋白，无论是原核表达还是真核表达，市面上没有成品出现，在国内外还没有相关报道。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种重组慢病毒载体。本发明的另一目的在于提供一种重组慢病毒。本发明的另一目的在于提供一种转染有上述重组慢病毒的中国仓鼠卵巢细胞。本发明的再一目的在于提供上述重组慢病毒载体、重组慢病毒或转染有重组慢病毒的中国仓鼠卵巢细胞的应用。本发明对慢病毒真核表达载体和opn基因进行改装和重组。对于真核载体的改装，首先，体外合成一段含有hsa序列和6×his序列的碱基双链，连接在pmd18-t载体上。其次，利用限制性内切酶对慢病毒真核表达质粒线性化，pcr扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5′端添加同源重组序列,使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5′和3′最末端的序列分别与线性化克隆载体两末端序列完全一致。最后，以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化，在慢病毒表达载体的多克隆位点上游区域加入hsa信号肽，下游区域加入6×his序列。对于opn基因，通过信号肽预测软件signalp4.1server预测信号肽，去除自身信号肽，在基因序列前面加入6′his序列，即最终序列为6′his-opn序列。hsa信号肽的引导分泌能力比opn自身信号肽分泌能力强，his-tag是蛋白纯化标签，这一方法大大提高了opn蛋白的分泌效率，同时也为鉴定和纯化带来了便利。另外，本发明通过慢病毒包装和转染cho细胞系方案解决猪源opn重组蛋白的空缺状态，首次建立表达猪源opn基因的稳转细胞系，纯化和浓缩上清液，获得目的基因蛋白粉末。本发明提供一种猪源opn重组蛋白，等电点为4.3，蛋白分子大小为33.7kda，预测的等电点为4.3，纯度>92％，属于蛋白生产领域。将该蛋白添加在在猪体外受精体系中，可以显著提高受精卵的卵裂率，为在精液中添加受精蛋白提高猪的繁殖效率奠定了基础，同时，也弥补了猪源opn蛋白在市面上的空缺。本发明提供了一种猪源opn重组蛋白，内容包括载体改造，基因获得，供体细胞系的建立、蛋白鉴定和功能鉴定。本发明体外通过真核细胞系表达更接近天然结构的猪源opn重组蛋白，及获得蛋白的长期途径。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种重组慢病毒载体，在慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro多克隆位点的上游插入hsa信号肽，下游插入纯化标签6×his序列，得到改装的慢病毒载体pcdh-cmv-hsa-mcs-6his-ef1-gfp+puro，然后将6′his-opn片段插入到改装的慢病毒载体的xbai和bamhi酶切位点之间，得到重组慢病毒载体pcdh-cmv-hsa-6′his-opn-6his-ef1-gfp+puro；所述的hsa信号肽的氨基酸序列如seqidno：4所示；优选的，其核苷酸序列如seqidno：5所示。所述的6′his-opn片段的核苷酸序列如seqidno：3所示。本发明提供一种重组慢病毒，是将上述重组慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染宿主细胞后得到的包装体。所述的慢病毒包装质粒包括pmd2.g和pspax2。所述的宿主细胞为293ft细胞。本发明还提供一种转染有上述重组慢病毒的中国仓鼠卵巢细胞。所述的中国仓鼠卵巢细胞为cho-k1细胞。上述重组慢病毒载体、重组慢病毒或转染有重组慢病毒的中国仓鼠卵巢细胞在opn重组蛋白表达中的应用。一种猪源opn重组蛋白的制备方法，采用上述转染有重组慢病毒的中国仓鼠卵巢细胞表达并纯化浓缩得到猪源opn重组蛋白。本发明的机理是：在重组蛋白生产方面，信号肽很大程度上决定了蛋白分泌的效率和产量。hsa信号肽(genbankaccessionnumber：np_000468)是来源于人类血清蛋白，含有57个碱基，2018年，you等人在研究信号肽、密码子和utp在cho细胞系表达体系中对单抗生产效率的影响时发现，在众多种类的信号肽中，hsa信号肽对单抗的分泌提高能力是最强的。将hsa信号肽和6×his蛋白标签分别插入到慢病毒载体多克隆位点的上游和下游，在提高目的蛋白的分泌量的同时，使蛋白的纯化更加方便。在蛋白表达方面，现在最成熟的是原核生物表达体系，原核生物结构简单，可以完成简单的转录翻译表达蛋白，短时间内获得基因表达产物，成本低廉，但存在着许多难以克服的缺点：表达系统无法对表达时间和水平进行调控，目的蛋白以内涵体的形式存在，纯化困难。另外，系统加工修饰体系不完善，导致蛋白的活性较低，蛋白结构不能折叠成空间结构。本发明是通过真核细胞系的途径获得重组蛋白，真核细胞表达系统具有翻译后的加工修饰体系，表达的外源蛋白更接近于天然蛋白，活性更高，功能方面更加的全面。本发明建立稳转opn基因的cho细胞系后，在上清液中收集样品，纯化得到opn重组蛋白，在猪体外受精体系中，加入猪源opn重组蛋白，对其功能进行鉴定。这是首次利用真核细胞系生产出猪源opn重组蛋白，且可以长期生产。另外，此蛋白可以应用到生产中，一方面将opn重组蛋白直接加到猪精液中，提高受精率；另一方面将opn抗体包被到96孔板底部，制成检测试剂盒，来检测精液的品质好坏。本发明解决了猪源opn蛋白缺乏的问题，把opn蛋白的功能及作用机制研究推向了一个崭新的阶段，同时，生产应用上，会提高猪场的繁育工作效率，大大提升猪场的经济效益。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过稳转cho细胞系，收集上清液，纯化后得到opn重组蛋白，表达时间和水平可以人为的控制，纯化便捷，结构更接近于天然蛋白，本身更加有活性，功能更全面。该蛋白加入到猪体外受精培养系中，可以大大提高受精率，改善胚胎的发育。猪源opn重组蛋白可以进一步应用到猪精液中，提高种猪的繁殖率。现国内外上还未出现直接加入精液中就可以提高受精率的蛋白，此蛋白的出现会给猪场带来更好的发展前景，将养猪业推向新的发展阶段。附图说明图1是获得opn重组蛋白的路线；图2是稳转细胞系的慢病毒穿梭质粒图谱；图3是慢病毒穿梭质粒的改装过程图。其中，a是指含hsa序列和6×his序列的扩增条带图；b是指重组克隆后的慢病毒穿梭质粒的菌液鉴定图，1、2和3是同一目的条带，另图中的dnamarker均为250bpdnaladder。图4是本发明获得猪源opn的稳转细胞系的过程图。其中，a是指6′his-opn基因扩增条带图；b是指重组目的质粒的酶切图，1和3是目的质粒条带，2和4是目的质粒酶切条带，上面的是慢病毒载体带，下面的是目的条带；c是获得的opn基因的阳性单克隆团图；d是克隆团扩大培养后的细胞图；e是克隆中的opn基因mrna的表达图，1是阳性对照，即重组质粒的pcr结果，2和3是空白对照(未转染的cho细胞)的β-actin和opn基因的pcr结果，4和5是阳性克隆细胞的β-actin基因和opn基因的pcr结果；f是opn重组蛋白表达的sds-page检测结果图；g是opn重组蛋白的westernblot结果图。图5是本发明获得的opn重组蛋白对猪体外受精分裂率的影响，其中1是指空白对照组，2是opn重组蛋白组。图6是兔抗opn对猪体外受精分裂率的影响，其中1是抗体稀释液组，2是opn抗体组。图7是猪源opn重组蛋白的质谱鉴定结果；其中，图中1和2代表对蛋白进行正库质谱和反库质谱检测的结果，1代表正库检测的结果：猪源opn蛋白的含量，2代表反库检测的结果：反库猪源opn蛋白的含量。图8是猪源opn重组蛋白的质谱鉴定二级图谱。图9是猪源opn基因细胞系的免疫荧光鉴定图；其中，a、d：白光镜下的图；b、e：荧光镜下的图；c、f：hoechst染细胞核图。图10是猪源opn基因细胞系的westernblot检测图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在以下实施例中，兔抗人opn抗体(ab8448)来源于abcam公司，鼠源β-actin(60008-1-ig)来源于proteintech公司，嘌呤霉素(puro)、猪体外受精培养体系中用到的药品均购于sigma公司，培养液购于gibco公司，293ft细胞和cho-k1细胞系来源于atcc公司，pmd2.g、pspax2、pires2-egfp和pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro购于优宝生物。实施例1重组慢病毒载体的构建对慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro进行改装，首先，体外合成一段160bp含有hsa序列-酶切位点-6×his序列的双链(seqidno：1所示)，连接在pmd18-t载体上；然后，通过同源重组的方法，设计引物hh-f和hh-r，扩增出含有hsa序列-酶切位点-6×his序列的片段，分子量大小为160bp(图3a)，同时，用内切酶xbai和bamhi线性化慢病毒载体。最后，通过无缝连接的方式，在慢病毒载体的多克隆位点上游插入hsa信号肽(其核苷酸序列见seqidno：5)，下游插入纯化标签6×his。通过慢病毒载体通用引物cmv-f和ef1-α-r对重组克隆后的质粒进行菌液鉴定(图3b)，成功得到改装的慢病毒载体pcdh-cmv-hsa-mcs-6his-ef1-gfp+puro(图2)。从猪睾丸中用引物opn-f/r克隆出opn片段，分子量大小为909bp，如seqidno：2所示(不含酶切位点及终止密码子)，连接在pires2-egfp载体上，通过引物6′his-opn-f和6′his-opn-r进一步扩增出目的片段：无opn信号肽和无终止子tga的6′his-opn片段(如seqidno：3所示)(图4a)，分子量大小为885bp。将目的片段(6′his-opn片段)载入改装的慢病毒载体pcdh-cmv-hsa-mcs-6his-ef1-gfp+puro中的xbai和bamhi酶切位点之间，重组质粒经过双酶切检测得两条带，泳道2和4上面的是载体条带，分子量大小为8278bp，下面的是目的条带，分子量大小为885bp，成功获得慢病毒重组质粒pcdh-cmv-hsa-6′his-opn-6his-ef1-gfp+puro(图4b)。实施例2，猪源opn重组蛋白的获得方法请参阅图1，是opn重组蛋白获得的线路图，第一步是猪源opn细胞系的建立与检测，第二步是猪源opn重组蛋白的获得与鉴定。具体的方法如下：1)将慢病毒包装质粒pmd2.g，慢病毒包装质粒pspax2和实施例1制备的慢病毒重组质粒共转染293ft细胞，转染48h后，观察荧光，然后收集48h和72h的上清液，1500rpm离心3min，0.45μm的滤器过滤，进行浓缩和纯化，得到滴度为108tu/ml的慢病毒液体。2)复苏cho-k1细胞，当细胞长到80～90％的时候，进行传代和铺板。24h后，细胞数量大约长到1×105，在完全培养基(10％fbs和1％l-glutamine的dmem培养基)加入6μg/mlpolybrene和100μl浓缩的病毒颗粒，然后将配好的液体加入到细胞中。孵育6h后换成完全培养液，24h进行换成含有6μg/ml嘌呤霉素(puro)的完全培养液，通过嘌呤霉素进行药物筛选，2～4天换液一次，一周后得到阳性细胞系。3)利用96孔板稀释法对步骤2)中的细胞系进行稀释至单细胞培养，45天后得到单克隆细胞团(如图4c)。对单克隆团细胞扩培(图4d)，嘌呤霉素的浓度降低为3μg/ml，冻存细胞留种，为以后的研究和检测留用。对扩培的细胞进行免疫荧光、rt-pcr和westernblot检测(如图9、图4e和图10)，结果证明细胞系稳定表达opn基因。4)收集阳性细胞系的上清液，1500rpm离心3min，用0.45μm的滤器过滤细胞碎片，通过浓缩管浓缩，将50ml的原液浓缩成2ml，对浓缩液进行蛋白浓度检测，以1μg/μl的最终浓度进行蛋白变性，进行sds-page(图4f)和westernblot检测(如图4g)，结果证明上清液中含有猪源opn重组蛋白，条带大小分别为33.7kda和67.4kda。5)扩大培养细胞系，收集上清液，通过his蛋白标签对上清进行纯化，浓缩后成蛋白粉末，取20μg，送公司做质谱检测，结果如图7和图8，质谱结果证明：预测的等电点为4.3；预测的蛋白分子大小为33.7kda；总蛋白中opn蛋白的纯度>92％。6)取一部分opn重组蛋白粉末，用含0.1％bsa的pbs溶解，浓度为1μg/ml。在做猪体外受精时，用受精液稀释成3个梯度：1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml，做成受精液，得到最合适的浓度为0.1μg/ml。最后，将实验组分成四组：空白对照组(未加蛋白或抗体)、抗体稀释液组、opn重组蛋白组和兔源opn抗体组，研究蛋白和抗体对受精率的影响。精卵结合48h后，发现猪源opn重组蛋白提高卵裂率(图5)，兔源opn抗体显著降低卵裂率(图6)。7)猪体外受精体系中加入浓度为0.1μg/ml的猪源opn重组蛋白，精卵结合48h后，对卵裂率进行统计分析，结果如表1所示；在猪体外受精体系中加入稀释比例1:1000的兔源opn抗体，精卵结合48h后，对卵裂率进行统计分析，结果如表2所示。表1分组卵母细胞数2-cell数2-cell率(％)空白对照组27613143.61±3.53aopn重组蛋白组28717960.56±4.19b注：同一列中，小写字母反应的是5％显著水平(p＝0.011)，大写字母反应的是1％极显著水平。相同字母上标表示差异不显著(p>0.05)，不同字母上标为差异显著(p<0.05)。表2分组卵母细胞数2-cell数2-cell率(％)抗体稀释液组25114758.51±2.98aopn抗体组30614540.06±3.25b注：同一列中，小写字母反应的是5％显著水平，大写字母反应的是1％极显著水平(p＝0.001)，相同字母上标表示差异不显著(p>0.05)，不同字母上标为差异显著(p<0.05)。从表1、表2中可知，说明猪源opn蛋白在猪精卵结合和受精卵发育中发挥着积极的作用，可以显著提高受精卵的分裂率。本发明中涉及到的基因的pcr及rt-pcr引物信息，如表3。表3上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及其应用<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>160<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgttttgacctccatagaaggccaccatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttc60tctttagctcgagcagccgcgcctctagagctagcgaattcgaatttaaatcggatccca120tcatcaccatcaccattaagcggccgcgaaggatctgcga160<210>2<211>909<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>opn基因序列<400>2atgagaattgcagtgatagccttctgcctctggggcttcgcctctgcccttccagttaaa60cagactaattctggcagctcggaggaaaagctgctttccaacaaatacacagatgctgta120gccacattgctaaagcctgacccatctcagaagcagactttcctagcgccacagaatact180atttcctcggaggaaacggacgacttcaaacaagagaccctgccaagcaagtccaacgaa240agccctgagcaaacagacgatgtggacgacgacgacgacgaagaccacgtggacagcagg300gacacggactccgaggaagctgatcacgctgacgacgctgaccgatccgacgagtctcat360cactccgatgaatccgatgagctggtcaccgatttccccaccgacaccccagcaaccgac420gtcactccggctgtccccacgggagaccccaatgatggccgcggggatagtgtggtctat480ggactgaggtcaaaatctaagaagttccgcagatccgaagcccagcagctggatgccaca540gaggaagacctcacgtcacatgtggaaagtgaggagacggatggtacccccaaggccatc600ctcgttgcccagcgcctgcacgtggcttctgacttggacagccaagagaaggacagtcag660gagacgagtcagccggatgaccgcagtgtggaaacccgcagccaggagcagtccaaagaa720tacacgatcaagacctatgatgggagcaatgagcattccaatgtgattgagagtcaggaa780aatcccaaagtcagccaagaattccacagccatgaagacaagctggtcccagactctaag840agcgaagaagacaaacacctgaaacttcgagtttctcatgaattagagagtgcgtcttct900gagatcaac909<210>3<211>885<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>6′his-opn基因序列<400>3atgcatcatcatcatcatcatatgcttccagttaaacagactaattctggcagctcggag60gaaaagctgctttccaacaaatacacagatgctgtagccacattgctaaagcctgaccca120tctcagaagcagactttcctagcgccacagaatactatttcctcggaggaaacggacgac180ttcaaacaagagaccctgccaagcaagtccaacgaaagccctgagcaaacagacgatgtg240gacgacgacgacgacgaagaccacgtggacagcagggacacggactccga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