一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种产磷脂酶d的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于酶工程
技术领域：
。
背景技术：
：磷脂酶d(pld)属于磷脂酰二酯合成酶类，具有该家族的明显特征，即含有两个间隔出现的h(x)k(x)4d(h代表组氨酸；k代表赖氨酸；d代表天冬氨酸；x代表任意氨基酸)保守序列。磷脂酶d可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，是合成磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等稀有磷脂的良好工具酶之一。利用该酶的高度专一性，对现有来源广泛的粗品磷脂进行转化和改性，可以制备一些稀有磷脂，在医药及食品保健品领域具有很大的应用价值。目前，磷脂酶d主要通过从大豆等植物或动物脑中分离提取得到，生产成本高，环境污染代价大，售价昂贵，不能满足市场需求。而现有的通过微生物法构建基因工程菌来发酵生产磷脂酶d的方法，结果都不理想。在大肠杆菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母及链霉菌中异源表达磷脂酶d均出现过报道，但均存在一定的缺陷。如在大肠杆菌中磷脂酶d蛋白易形成包涵体，且磷脂酶d对大肠杆菌的生长有抑制作用，导致分泌量很低；酵母为真核生物，发酵周期通常较长，如张莹等以毕赤酵母为宿主时，获得的重组磷脂酶d酶活仅为1u/ml，且发酵时间长达3天(张莹.在不同宿主中表达链霉菌磷脂酶d的研究[d].华东理工大学,2013)，且在酵母中磷脂酶d的酶活和蛋白表达量均不显著，并不适用于工业化生产；链霉菌的克隆表达系统已经比较成熟，但相比于原核表达系统，外源基因的引入相对复杂，部分链霉菌还存在一定的限制修饰系统，会导致转化率过低，且链霉菌生长过程较为复杂且易发生遗传突变，成熟的表达系统数量也有限，以上瓶颈限制了链霉菌表达系统的广泛应用。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别，且具有清晰的生理和遗传背景，我们尝试以枯草芽孢杆菌为表达宿主来表达磷脂酶d。但是，链霉菌属于放线菌目的一科，枯草芽孢杆菌则属于芽孢杆菌属的一种，两者属于不同的菌种，遗传上可能存在一些隔阂，导致链霉菌来源的目的基因可能并不能被枯草所识别，在枯草芽孢杆菌中表达磷脂酶d存在一定的难点。另外，采用枯草芽孢杆菌进行磷脂酶d的工业化生产，若能够成功获得胞外酶，可直接将发酵上清液添加到底物中进行产物磷脂酰丝氨酸(ps)的生产。但是，ps多添加在奶粉，保健品等食品中，因而对抗生素的残留有严格限制。发酵过程中为了防止质粒丢失，通常会在接种时添加一定浓度的抗生素，导致有一部分抗生素残留到产品中。因此，质粒的稳定性尤为重要。因此，提供一种成本低、环保、可溶性表达量高且质粒稳定性高的产磷脂酶d的基因工程菌，对于工业生产磷脂酶d具有重要的意义。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种产磷脂酶d的重组枯草芽孢杆菌，将如下dna片段融合后表达：spovg启动子、rbs及spacer区、amye信号肽、与来源于链霉菌(streptomycesracemochromogenes)10-3的磷脂酶d基因；所述spovg启动子的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述rbs及spacer区的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述amye信号肽的核苷酸序列如seqidno.7所示。在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶d基因的核苷酸序列如seqidno.8所示。在本发明的一种实施方式中，以pp43nmk、pstop1622或pma系列载体为表达载体。在本发明的一种实施方式中，以bacillussubtiliswb600为宿主。本发明的第二个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，将如下dna片段融合后表达：spovg启动子、amye信号肽、rbs及spacer区与来源于链霉菌(streptomycesracemochromogenes)10-3的磷脂酶d基因；所述spovg启动子的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述rbs及spacer区的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述amye信号肽的核苷酸序列如seqidno.7所示；将融合后的基因连接到表达载体上，转入枯草芽孢杆菌中表达。本发明的第三个目的是提供一种生产磷脂酶d的方法，是应用上述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵。在本发明的一种实施方式中，将35-38℃、200-220rpm条件下培养5-10h的重组枯草芽孢杆菌以1-10％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、200-220rpm条件下发酵20-28h。在本发明的一种实施方式中，将35-38℃、200-220rpm条件下培养5-10h的重组菌，接入装液量30-40％的200l发酵罐，以氨水控制ph为6-7，培养温度35-38℃，溶氧控制在20-40％左右，发酵过程中通过流加糖控制在0.3-0.7％，通气比1:0.5-1:1vvm，罐压控制在0.5-1pa。本发明的第四个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌在制备磷酯酰丝氨酸或磷脂酰肌醇中的应用。本发明的第五个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌在食品、保健品或制药领域内的应用。本发明通过对重组质粒上的启动子进行优化，成功使链霉菌来源的磷脂酶d在枯草芽孢杆菌中的胞外异源分泌表达量从26.3u/ml提高到34.7u/ml，并将发酵周期缩短到24h，通过质粒稳定性检测，在传代5次后，质粒持有率依然达到100％，避免了因为后期抗生素的添加，而出现质粒大量丢失的情况。在200l罐上放大生产，酶活比摇瓶培养提高近5倍，达到171.5u/ml，可用于磷脂酶的工业化生产及转酯产物磷酯酰丝氨酸的生成。采用枯草芽孢杆菌作为宿主菌产磷脂酶d，发酵工艺简单，周期较短，且避免酶形成包涵体，有很大的应用前景。附图说明图1：pp43-lytr-pld构建过程示意图。图2：质粒图谱。图3：不同启动子构建的重组菌的酶活测定结果，对照为含出发质粒的重组菌。图4：第5次传代后，抗性平板和无抗平板上重组菌生长情况。图5：200l罐上不同时期酶活测定结果。具体实施方式(一)实验材料和试剂1、菌株与载体枯草芽孢杆菌wb600，枯草芽孢杆菌168，商业化载体pp43nmk。2、酶与试剂盒高保真primestarmaxdna扩增酶、限制性内切酶购自takara公司，质粒提取、胶回收试剂盒购自上海生工。(二)培养基250ml摇瓶种子培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。发酵培养基(g/l)：甘油15，胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸二氢钾2.31，三水磷酸氢二钾16.42。200l罐上种子罐培养基为葡萄糖1％，酵母浸粉0.5％，骨蛋白胨1％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钠0.2％，消泡剂0.02％。发酵罐培养基：葡萄糖1％，酵母浸粉1.5％，骨蛋白胨3％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钠0.2％，消泡剂0.02％。(三)酶活测定方法：100μl反应液1：0.5％(w/v)蛋黄卵磷脂，0.1％(w/v)曲拉通x-100，40mmtris-hcl(ph7.4)，2μl酶液(50×)，37℃反应10min。50μl反应终止液：50medta，200mtris-hcl(ph7.4)。500μl反应液2：20mm磷酸钾缓冲液(ph7.4)，21mm苯酚，0.60mm4-att，5μl10u/ml胆碱氧化酶，3μl10u/ml过氧化物酶。向100μl反应液1中加50μl反应终止液，震荡混匀，95℃加热10min。冷却至室温后，向反应体系中再加入500μl反应液2，混匀，37℃反应2h，505nm波长下检测吸光值。(四)pp43-pld-amye构建方法质粒pp43-pld-amye的载体骨架为pp43nmk载体，启动子为hpaii启动子，通过rbscaculator软件优化获得rbs及spacer区，信号肽为来源于枯草芽孢杆菌168的淀粉酶amye信号肽，目的基因序列为密码子优化后的来源于链霉菌10-3的pld基因序列(如seqidno.8所示)。分别合成hpaii启动子、rbs及spacer区、信号肽、pld基因片段(见表1)，将这些片段进行融合，与载体pp43nmk进行酶切连接。质粒pp43-pld-amye构建示意图见图1。实施例1：含不同启动子的质粒以载体pp43-lytr-pld构建过程为例，以bacillussubtilis168基因组为模板，用引物f1和r1(见表2)克隆出lytr启动子片段；再以质粒pp43-pld-amye为模板，用引物f11和r11克隆出对酶活起主要作用的元件(rbs及spacer区、信号肽及pld基因)。将两者分别纯化回收后，同摩尔比混合后充当模板，再以f1和r11为上下游引物，将lytr启动子片段和rbs及spacer区、信号肽及pld基因片段融合，克隆出全长基因。片段前后酶切位点如图2所示。纯化回收所需大小的片段后，与载体pp43nmk分别用内切酶bamhi和hindiii双酶切，再次纯化回收，进行酶切连接操作。将连接后的质粒转化至大肠杆菌e.colijm109中，在抗性lb平板上筛选，经测序验证正确的载体，转化入bacillus.subtiliswb600菌株中，即得重组菌株。其他三条启动子apre、ylb、spovg也分别用引物f2/r2、f3/r3、f4/r4从bacillus.subtilis168上扩增下来，与其对应相连的目的基因片段用引物f22/r11、f33/r11、f44/r11从质粒pp43-lytr-pld上扩增下来。所构建的重组质粒分别命名为pp43-lytr-pld，pp43-apre-pld，pp43-ylb-pld，pp43-spovg-pld。含不同启动子的质粒图谱见图2。表1主要元件序列表2引物表引物序列f1cgggatccaggatcaaggaataggatgaaaaaaggr1ctcctttagtaagttaggtggcacaaacccaaaaggatacattcagtf11taaacgaactgaatgtatccttttgggtttgtgccacctaacttactr11cccaagcttttagtggtggtggtggtgf2cgggatccctaaccctacataagtaccttcttttgtttcar2ctcctttagtaagttaggtggcacaaactttcattatgagttaaattf22gttgtatttattggaaatttaactcataatgaaagtttgtgccacctaacttactf3cgggatcctatgggaagtgctccgtaatacgcr3ctcctttagtaagttaggtggcacaaacactacatttattgtacaacf33gggctcgtgttgtacaataaatgtagtgtttgtgccacctaacttactf4cgggatccaatatatacatacgccctgaaaaagaataattr4ctcctttagtaagttaggtggcacaaaatccttaccttcatagcataf44aaaccttgttatgctatgaaggtaaggattttgtgccacctaacttact注：划横线部分为酶切位点实施例2：发酵生产磷脂酶d将实施例1获得的含不同质粒的重组菌接种于含卡那抗生素50mg/ml的种子培养基中，于37℃、200rpm下培养对数生长期，作为种子液；再将种子液以3％的接种量转入到含卡那抗生素50mg/ml的20ml发酵培养基中，于37℃、200rpm条件下发酵。发酵12h、24h、36h、48h后，将发酵液于4℃，8000r/min离心10min取上清得到磷脂酶d粗酶液，测定粗酶液酶活。如图3所示，发酵24h后，含pp43-lytr-pld的重组菌发酵液酶活为23.1u/ml，含pp43-spovg-pld的重组菌发酵液酶活为34.7u/ml，含pp43-apre-pld的重组菌发酵液酶活为27.5u/ml，含pp43-ylb-pld的重组菌发酵液酶活为32.1u/ml。其中，含pp43-spovg-pld的重组菌发酵液酶活最高，较含出发质粒的重组菌发酵液，酶活提高约31.9％。实施例3：重组菌质粒稳定性实验将实施例2中获得的含质粒pp43-spovg-pld的重组菌划无抗平板，挑单菌落于100ml含卡那抗生素的lb液体培养基，培养12h后，3％接种量接种到20ml无抗lb液体培养基，每隔12h转接培养一次。卡那抗性lb液体培养基中重组菌的遗传稳定性记为100％，转接一次记为传一代，共传5代。每次转接培养12h时，取待测菌液稀释6-10倍后，涂布100μl菌液于无抗lb平板上培养，挑取100个单菌落分别对应点接于无抗lb平板和含卡那的lb平板；在无抗平板上的100个菌落都长出之后，再统计在含卡那的lb平板上形成的菌落数。能在含卡那的lb平板上生长则该菌落持有重组质粒，以重组质粒的持有率来判断重组菌的遗传稳定性，结果见表3。传代5次，无抗和有抗平板上菌落的生长情况见图4，重组质粒的持有率仍有100％。表3重组质粒的持有率传代次数12345无抗平板100100100100100卡那平板100100100100100实施例4：200l发酵罐上放大实验将实施例2中获得的含质粒pp43-spovg-pld的重组菌划平板，培养12h，挑单菌落接斜面培养12h，接摇瓶培养8h，火焰接种上种子罐培养6h，作为种子液；再将6l种子液转接入装液量30-40％的200l发酵培养基中，以氨水控制ph为6-7，培养温度37℃，溶氧控制在30％左右，发酵过程中通过流加糖控制在0.5％左右，通气比1:0.5-1:1vvm，罐压控制在0.5pa。于37℃、200rpm条件下培养48h，每隔12h取样检测酶活(图5)。24h后，酶活比摇瓶培养提高近5倍，达到171.5u/ml。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种产磷脂酶d的重组枯草芽孢杆菌及应用<160>21<170>patentinversion3.3<210>1<211>270<212>dna<213>人工合成<400>1gatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaa60cccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaa120agaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgacagcctcgcagagcaca180cactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgccggaaaga240gcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaa270<210>2<211>300<212>dna<213>人工合成<400>2ctaaccctacataagtaccttcttttgtttcaatgttactgtctggcgatacatcttcac60cttgactcttttgactattaaccccgcaacccgaaagaagcaatataaagaacagtaaag120caataaattttttcatttttttcacctcattatattttatcgtcaacctattttatattt180taaagaaaaattaagaaacaatgaaacttttttttataaaaaacgactattttaggattt240cattcttgtattaaatagagttgtatttattggaaatttaactcataatgaaagtaattt300<210>3<211>122<212>dna<213>人工合成<400>3gagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaa60aaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtctttta120ag122<210>4<211>79<212>dna<213>人工合成<400>4acttctcaaagatcccatgtgcttaaaattaaagtttaaatatttggattttttaaataa60agcgtttacaatatatgta79<210>5<211>300<212>dna<213>人工合成<400>5tgcggaagtaaacgaagtgtacggacaatattttgacactcacaaaccggcgagatcttg60tgttgaagtcgcgagactcccgaaggatgcgttagtcgagatcgaagttattgcactggt120gaaataataagaaaagtgattctgggagagccgggatcacttttttatttaccttatgcc180cgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattt240taaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttatatag300<210>6<211>15<212>dna<213>人工合成<400>6aaaggaggttattat15<210>7<211>99<212>dna<213>人工合成<400>7atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgct99<210>8<211>1536<212>dna<213>人工合成<400>8atggaattcgcatcacctacacctcatctggatagcgtcgaacaaacactgagacaagtg60tcaccgggacttgaaggatcagtttgggaacgcacagcaggcaattcacttggagcatca120gcaccaggaggatcagattggcttctgcaaacaccaggttgttggggagatccttcttgc180acagatagaccgggatcaagacgtctgctggataaaacacgccaggatatcgcacaagcg240agacaaagcgtcgatattagcacactggcaccttttccgaacggaggatttcaggatgca300gttgttgcaggcctgaaagaagcagttgcgaaaggcaatagactgcaagtcagaatttta360gtcggagcagcgccgatttatcatgcaaacgtcattccgagctcatatcgcgatgaaatg420gtcgcaagattaggaccggcagcagcaaacgttacacttaacgtcgcaagcatgacgaca480agcaaaacgggcttctcttggaatcatagcaaactggtcgtcgttgacggcggaagcgtc540attacaggcggcattaatagctggaaggacgactatctggatacagcgcatccggttaac600gacgtcgatcttgcactttcaggaccagcagcaggatcagcaggaagatatctggatacg660ctttgggattggacttgcagaaacaagagctcttggagcagcgtttggttcgcaagctca720aataacgcaggttgcatgcctacattacctagaccagcagcaccagcaggaggaggagac780gttccagcattagcagttggaggactgggagttggcattagacaaagcgatccggcatca840gcatttaaaccggtcttacctacagcaccggatactaagtgcggcattggagttcatgat900aacacgaacgcggatcgcgattacgatacagtcaatccggaagaaagcgcgcttagagca960ctggttgcatcagcgaatagccacgtcgaaattagccagcaggatctgaacgctacatgc1020cctcctttaccgagatacgatatccgcctgtacgatacactggcagcaaaactggcagca1080ggcgttaaagtcagaattgtcgtctcagatccggcaaatagaggagcagttggatcagac1140ggctatagccagatcaaaagcctgaatgaagtctcagacgcactgagaggaagacttaca1200gcactgacaggcgacgaaagaacaagcaaagcagccatgtgccagaaccttcaactggca1260acgtttcgcgcaagcgataaagcaacttgggcagacggaaaaccttacgcacagcatcat1320aaactggtcagcgtcgacgatagcgcattttacatcggcagcaagaacctgtatccgtct1380tggctgcaggactttggatacgttgtggaatcaccggcagcagcaaatcaacttaaagat1440agcctgcttgcacctcagtggaaatatagccaggcgacagcgacatacgactatgcaaga1500ggcctttgccaggcgcaccaccaccaccaccactaa1536<210>9<211>35<212>dna<213>人工合成<400>9cgggatccaggatcaaggaataggatgaaaaaagg35<210>10<211>47<212>dna<213>人工合成<400>10ctcctttagtaagttaggtggcacaaacccaaaaggatacattcagt47<210>11<211>47<212>dna<213>人工合成<400>11taaacgaactgaatgtatccttttgggtttgtgccacctaacttact47<210>12<211>27<212>dna<213>人工合成<400>12cccaagcttttagtggtggtggtggtg27<210>13<211>40<212>dna<213>人工合成<400>13cgggatccctaaccctacataagtaccttcttttgtttca40<210>14<211>47<212>dna<213>人工合成<400>14ctcctttagtaagttaggtggcacaaactttcattatgagttaaatt47<210>15<211>55<212>dna<213>人工合成<400>15gttgtatttattggaaatttaactcataatgaaagtttgtgccacctaacttact55<210>16<211>32<212>dna<213>人工合成<400>16cgggatcctatgggaagtgctccgtaatacgc32<210>17<211>47<212>dna<213>人工合成<400>17ctcctttagtaagttaggtggcacaaacactacatttattgtacaac47<210>18<211>48<212>dna<213>人工合成<400>18gggctcgtgttgtacaataaatgtagtgtttgtgccacctaacttact48<210>19<211>40<212>dna<213>人工合成<400>19cgggatccaatatatacatacgccctgaaaaagaataatt40<210>20<211>47<212>dna<213>人工合成<400>20ctcctttagtaagttag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