一种稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤内标试剂的制备方法与流程

本发明涉及一种食品安全检测用稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤内标试剂的制备方法，属于食品安全检测用标准物质研发领域。
背景技术：
：6-苄基腺嘌呤(6-benzyladenine，casno.：1214-39-7)，是第一个人工合成的细胞分裂素，主要用于促进细胞分裂、细胞增大、种子发芽和果实生长等，我国曾经允许在豆芽生产上的应用，俗称的“无根粉”其主要成分就是6-苄基腺嘌呤。6-苄基腺嘌呤作为植物生长调节剂，其安全性目前没有结论，并且缺乏食品添加剂工艺必要性，目前我国的标准gb2760已经禁止6-苄基腺嘌呤作为食品用加工助剂生产经营和使用。国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会在2015年4月13日发布的《关于豆芽生产过程中禁止使用6-苄基腺嘌呤等物质的公告》(2015年第11号)中重申了“生产者不得在豆芽生产过程中使用6-苄基腺嘌呤，豆芽经营者不得经营含有6-苄基腺嘌呤的豆芽”。目前，相关的检测标准方法为高效液相色谱法《gb/t23381-2009食品中6-苄基腺嘌呤的测定高效液相色谱法》和液相色谱串联质谱法《db33/t625.3-2007(2016)无公害豆芽第3部分：6-苄基腺嘌呤残留量和4-氯苯氧乙酸钠残留量的测定》、《db64/t1493-2017豆芽中赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴的测定液相色谱-串联质谱法》，因无相应的稳定同位素标记内标化合物，目前只能用外标法来进行检测。从理论上讲，内标法最好是使用该化合物对应的稳定同位素标记内标化合物。因此，本发明所涉及食品安全检测用稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的研制，填补了此类检测领域的空白。目前全球尚未发现有该结构稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的制备文献，研制稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤对我国相关的食品安全监管检测工作具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种适用于食品安全检测用6-苄基腺嘌呤的内标试剂-稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的制备方法。该合成方法原料易得，产品收率高，并且同位素丰度不稀释，有效降低了产品成本。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种食品安全检测用稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的制备方法，该稳定同位素标记的6-苄基腺嘌呤的化学结构如式(i)所示：其中，(i)中r为h或d，*为12c或13c，其合成步骤总路线为：其中，r为h或d，*为12c或13c(1)在有机溶剂存在条件下，加入稳定同位素标记苯甲醛，然后加入对甲苯磺酰肼，在氮气保护下，在20℃～120℃条件下，反应0.5～6小时。tlc跟踪反应原料反应完全后，无需处理，直接进行下一步反应。(2)将邻苯二甲酰亚胺、无机碱和催化剂加入步骤(1)得到的溶液中，在氮气保护下，在80℃～150℃条件下，反应1～10小时。tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥。减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记n-苯甲基邻苯二甲酰亚胺。(3)将步骤(2)所得稳定同位素标记n-苯甲基邻苯二甲酰亚胺溶于有机溶剂中，加入水合肼，在氮气保护下，在80℃～150℃条件下继续反应1-8小时。tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用酸淬灭，过滤，滤液再用碱的水溶液洗涤，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥。减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到纯品稳定同位素标记苄胺。(4)在有机溶剂中，加入步骤(3)得到的稳定同位素标记苄胺，加入6-氯嘌呤，在氮气保护下，在80℃～150℃条件下继续反应6-24小时。tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，残留物用有机溶剂洗涤，得到稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的粗品。(5)在混合有机溶剂中，加入步骤(4)得到的稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的粗品，室温搅拌12-36小时，过滤，滤饼真空干燥得到稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的纯品。所述步骤(1)中，稳定同位素标记的苯甲醛为氘标记的苯甲醛、13c标记的苯甲醛或氘和13c双标记的苯甲醛，有机溶剂为四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二氧六环、甲苯、乙腈、甲基叔丁基醚等无水非质子性溶剂中的一种或几种。所述步骤(2)中，无机碱为氢氧化锂、氢氧化钠，氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠、叔丁醇钾等中的一种或几种；催化剂为氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜、氧化亚铜、醋酸铜等中的一种或几种。所述步骤(3)中，有机溶剂为四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二氧六环、甲苯、乙腈、甲基叔丁基醚等无水非质子性溶剂中的一种或几种；所用酸为盐酸、硫酸、醋酸等的一种或几种；所用碱为氢氧化锂、氢氧化钠，氢氧化钾等的一种或几种。所述步骤(4)中，所用稳定同位素标记苄胺为氘标记的苄胺、13c标记的苄胺或氘和13c双标记的苄胺；所用有机溶剂为正戊烷、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙腈等中的一种或几种。所述步骤(5)中，所用有机溶剂为正戊烷、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙腈等中的两种或几种。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的食品安全检测用稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤的制备，方法所使用的原料简单易得，合成步骤简单，收率高且稳定同位素标记试剂使用率高，同位素丰度基本上不稀释，该化合物结构及制备路线及方法均未有文献报道，制备的稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤纯度大于98％，同位素丰度大于99％。本制备方法得到的食品安全检测用稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤对我国相关的食品安全监管检测工作具有重要意义。附图说明：图1：6-苄基腺嘌呤-d5的hnmr图图2：6-苄基腺嘌呤-d5的ms图图3：6-苄基腺嘌呤-d5的hplc图具体实施方式下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明，但它并不是对本发明的范围的任何限制。实施例1：n-苯甲基邻苯二甲酰亚胺-d5的制备在250ml三口瓶中，加入氘代苯甲醛(1.11g，10mmol)、对甲苯磺酰肼(1.86mg，10mmol)和干燥的二氧六环(50ml)；充入氮气，在80℃下反应2小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，将邻苯二甲酰亚胺(1.47g，10mmol)、碳酸钾(4.14mg，30mmol)和碘化亚铜(475mg，2.5mmol)加入上述得到的溶液中，在氮气保护下，在120℃条件下，反应3-5小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记n-苯甲基邻苯二甲酰亚胺-d5(1.75g，收率72％)。实施例2：苄胺-d5的制备在100ml三口瓶中，加入n-苯甲基邻苯二甲酰亚胺-d5(1.21g，5mmol)、水合肼(1.50g，30mmol)和干燥的二氧六环(20ml)；充入氮气，在120℃条件下反应2小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，将反应混合溶液用1m盐酸淬灭，过滤，滤液再用40％氢氧化钠的水溶液洗涤，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到纯品稳定同位素标记苄胺-d5(350mg，收率62.5％)。实施例3：粗品6-苄基腺嘌呤-d5的制备在50ml三口瓶中，加入稳定同位素标记苄胺-d5(336mg，3mmol)，6-氯嘌呤(462mg，3mmol)，异丙醇(30ml)，在氮气保护下，加热至回流，并在该温度反应4-8小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，残留物用石油醚洗涤，得到稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤-d5的粗品600mg。实施例4：精品6-苄基腺嘌呤-d5的制备将稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤-d5的粗品550mg加入到10ml石油醚:乙酸乙酯＝10:1(v/v)的混合溶剂中，在室温下搅拌过夜，过滤，滤饼真空干燥得稳定同位素标记6-苄基腺嘌呤-d5纯品420mg；hnmr(dmso-d6,600m)δppm12.94(s,1h),8.10～8.28(m,3h),4.72(t,2h)，详见附图1。msesi+231[m+1]483[2m+na]，详见附图2。hplc详见附图3，测得化学纯度＝98.32％，详见表1。同位素丰度＝99.73％，详见表2。表16-苄基腺嘌呤-d5的化学纯度peak#ret.time(min.)area(mau)height(mau)area％12.2761770536650.70823.2792438239160.97535.415245823227203098.317total2500319279611100.000表26-苄基腺嘌呤-d5的同位素丰度质量标准满足食品安全检测用液相色谱串联质谱法所需同位素内标试剂要求。13c标记和氘和13c双标记的6-苄基腺嘌呤合成步骤同上述实施例中6-苄基腺嘌呤-d5的合成路线。以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。当前第1页12