产纤维素酶的地衣芽孢杆菌、其微生物发酵制剂及其应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵领域，具体而言，本发明涉及一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌，以及包含该菌株的微生物发酵制剂及其在包含玉米加工副产物的饲料的发酵中的应用。

背景技术：

玉米是我国主要的农作物产物，每年产量约在2亿吨。其中，每直接加工1吨玉米，可产生0.09吨玉米浆、0.07吨胚芽粕、0.056吨玉米蛋白粉和0.13吨玉米麸皮；同时以玉米为原料进行发酵，可产生许多发酵产品，如燃料乙醇、柠檬酸、氨基酸等；也可产生大量的副产物，如ddgs、柠檬酸糟等。玉米加工产物如玉米麸皮、ddgs、柠檬酸糟等通常被直接添加到饲料中用于畜禽养殖，但其含有较高的纤维素、半纤维素、甲壳素等非淀粉多糖，直接添加至饲料中难以被猪、鸡等畜禽消化，同时影响磷等矿物离子的吸收、降低营养物质的利用，容易引起畜禽腹泻、生长缓慢等问题。种种不利因素限制了玉米加工副产物在饲料中的应用。

微生物发酵饲料是在人工控制条件下，通过微生物自身的代谢活动，选择性地将植物性、动物性和矿物性物质中的抗营养因子分解或转化，产生更能被畜禽采食、消化吸收且无毒害作用的饲料。其中，微生物固态发酵技术在我国饲料行业中应用较为广泛，主要是通过微生物的产酶特性及其代谢产物来降低原料中的抗营养因子(例如非淀粉多糖)含量，提高饲料的产品品质和消化吸收率。

地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)具有适应环境能力强、具有丰富的酶系、有较广的抑菌谱、调节肠道菌群、生长速度快等优良性能，常作为饲料添加菌株使用。天然的地衣芽孢杆菌可产生多种酶，如植酸酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等，但是其产酶特性随着环境(如土壤成分)、培养时间、培养条件(如碳源)等而变化。例如，使用微晶纤维素为唯一碳源时，地衣芽孢杆菌不产生纤维素酶(参见“地衣芽孢杆菌与其他微生物产酶能力的比较”，柏建玲，饲料研究，2003(7)：4-6)。而目前本领域中还没有发现针对玉米加工产物中的纤维素具有较高纤维素酶活力的地衣芽孢杆菌。

为了解决上述玉米加工副产物在饲料应用中所遇到的难题，本发明人期望获得高产纤维素酶的地衣芽孢杆菌，利用该地衣芽孢杆菌制备成微生物制剂进行微生物固态发酵，有效地降低玉米加工副产物中的纤维含量，提高发酵饲料的品质，有利于畜禽类对饲料的高效利用。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，在第一方面，本发明提供了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)50(也称为“bl50”)，保藏编号为cgmccno.15012。该菌株能够产生较高产量的纤维素酶(发酵液的酶活力可达114u/ml)，并且使用该菌株对包含富含纤维素的玉米加工副产物的饲料进行发酵时，可有效降解饲料中的纤维含量。该菌株不含毒力基因，属于安全菌株。

在第二方面，本发明提供了一种微生物发酵制剂，其中，所述微生物发酵制剂包含第一方面所述的地衣芽孢杆菌50，所述微生物发酵制剂可用于对包含含有纤维素的玉米加工副产物的饲料进行发酵。

在第三方面，本发明提供了第一方面所述的地衣芽孢杆菌50或第二方面所述的微生物发酵制剂在对包含含有纤维素的玉米加工副产物的饲料进行发酵中的用途。

本发明的有益技术效果如下：本发明的地衣芽孢杆菌50不含毒力基因，属于安全菌株，可随着饲料被吞食后定殖在畜禽类的肠道中，作为有益肠道微生物发挥作用；本发明的地衣芽孢杆菌50产生的纤维素酶活力高(发酵液的酶活力可达114u/ml)，使用该菌株配合其它菌株发酵包含含有纤维素的玉米加工副产物的饲料，可有效降解纤维饲料中的纤维(经发酵的饲料具有较低的酸性水洗纤维、中性水洗纤维和粗纤维含量)，发酵时间短，发酵后饲料中活菌数量高，得到有利于畜禽类消化吸收的高品质的饲料。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌50的16srdna序列。

图2为地衣芽孢杆菌50在cmc筛选培养基平板上的状态的照片。

具体实施方式

本发明中，所述产纤维素酶的地衣芽孢杆菌分离纯化方法包括：采用地衣芽孢杆菌培养基从山西汾酒大曲样品中分离地衣芽孢杆菌，采用梯度稀释法，将稀释液涂布于地衣芽孢杆菌固体培养基上，在30-37℃下培养12-24h，通过平板划线法纯化地衣芽孢杆菌，获得形态与地衣芽孢杆菌的形态特征相同的单菌落；将分离获得的地衣芽孢杆菌点种在cmc筛选培养基上，然后分别经刚果红溶液和氯化钠溶液处理，筛选出具有较大直径(约4cm)透明圈的单菌落，提取单菌落基因组，对其16srdna序列(seqidno.:1)进行测序，与ncbi数据库进行比对，进行分子生物学鉴定。同时，根据生理生化特征的鉴定结果(参照《伯杰细菌鉴定手册》，科学出版社，1984年以及《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001年中的记载进行鉴定)，最终将该菌株鉴定并命名为地衣芽孢杆菌50(bacilluslicheniformis50)。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，北京市朝阳区北辰西路1号院)，保藏编号为cgmccno.15012，保藏日期为2017年12月4日，分类名称为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)。

在一个实施方式中，本发明提供了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)50，保藏编号为cgmccno.15012。

在优选的实施方式中，所述地衣芽孢杆菌50的发酵液的纤维素酶酶活力可高达114u/ml。在本发明中，除非另有说明，酶活力也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的转化速率来表示，即酶催化的转化速率越快，酶的活力就越高。

在一个实施方式中，本发明提供了一种微生物发酵制剂，其中，所述微生物发酵制剂包含上述的地衣芽孢杆菌50。

在一些优选的实施方式中，所述微生物发酵制剂进一步包括饲料学上或兽医学上可接受的添加剂，例如各种抗生素、抗氧化剂、防霉剂、黏结剂、着色剂和/或增味剂等。本领域技术人员可以根据实际需要选择添加剂的量，这一点并不会对本发明进行限制。

在一些优选的实施方式中，所述微生物发酵制剂还包含饲料学上或兽医学上有益的其它微生物，例如但不限于酵母、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌和/或乳杆菌。

在进一步优选的实施方式中，所述微生物发酵制剂进一步包含植物乳杆菌和/或产朊假丝酵母。

在一些优选的实施方式中，在所述微生物发酵制剂中，所述地衣芽孢杆菌50的含量为至少1×10⁸cfu/ml，优选为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

在一个进一步优选的实施方式中，在所述微生物发酵制剂中，所述植物乳杆菌的含量为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

在另一个进一步优选的实施方式中，在所述微生物发酵制剂中，所述产朊假丝酵母的含量为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

其中，所述植物乳杆菌和产朊假丝酵母可以是从市场上商购的，也可使用本领域已知的分离和/或筛选植物乳杆菌和产朊假丝酵母的方法从含有它们的来源(例如发酵牛乳、发酵饲料)中分离和/或筛选得来。植物乳杆菌和产朊假丝酵母的来源选择并不会限制本发明的范围。

在一个实施方式中，本发明还提供了本发明所述的地衣芽孢杆菌50或本发明所述的微生物发酵制剂在对包含含有纤维素的玉米加工副产物的饲料进行发酵中的用途。

在优选的实施方式中，所述含有纤维素的玉米加工副产物是指玉米加工过程产生的可用来制成饲料的副产物，例如玉米麸皮、喷浆玉米皮、ddgs(干全酒糟)、dds(可溶干酒精糟)、玉米粉或玉米淀粉渣，或它们的任意组合。

在优选的实施方式中，所述发酵的温度为28℃-37℃、优选30℃。在优选的实施方式中，在所述发酵的过程中实时监测发酵体系的ph值，当ph值达到4.5以下时停止发酵。通常，发酵时间可为3-6天。

在优选的实施方式中，在进行所述发酵后，所述饲料中的地衣芽孢杆菌50的活菌总数为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

出于说明的目的，本发明的目的可例如通过如下段落中描述的内容而得以实现：

1.一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)50，保藏编号为cgmccno.15012。

2.如段落1所述的地衣芽孢杆菌50，其中，所述地衣芽孢杆菌50的发酵液的纤维素酶酶活力高达114u/ml。

3.一种微生物发酵制剂，其中，所述微生物发酵制剂包含段落1或2所述的地衣芽孢杆菌50。

4.如段落3所述的微生物发酵制剂，其中，所述微生物发酵制剂进一步包括饲料学上或兽医学上可接受的添加剂。

5.如段落4所述的微生物发酵制剂，其中，所述添加剂选自抗生素、抗氧化剂、防霉剂、黏结剂、着色剂和/或增味剂。

6.如段落3-5中任一项所述的微生物发酵制剂，其中，所述微生物发酵制剂还包含饲料学上或兽医学上有益的其它微生物。

7.如段落6所述的微生物发酵制剂，其中，所述有益的其它微生物选自酵母、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌和/或乳杆菌。

8.如段落7所述的微生物发酵制剂，其中，所述酵母为产朊假丝酵母。

9.如段落7或8所述的微生物发酵制剂，其中，所述乳杆菌为植物乳杆菌。

10.如段落7所述的微生物发酵制剂，其中，所述微生物发酵制剂进一步包含植物乳杆菌和/或产朊假丝酵母。

11.如段落3-10中任一段所述的微生物发酵制剂，其中，所述地衣芽孢杆菌50的含量为至少1×10⁸cfu/ml。

12.如段落11所述的微生物发酵制剂，其中，所述地衣芽孢杆菌50的含量为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

13.如段落8或10所述的微生物发酵制剂，其中，所述产朊假丝酵母的含量为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

14.如段落9或10所述的微生物发酵制剂，其中，所述植物乳杆菌的含量为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

15.段落1或2所述的地衣芽孢杆菌50或者段落3-14中任一段所述的微生物发酵制剂在对包含含有纤维素的玉米加工副产物的饲料进行发酵中的用途。

16.如段落15所述的用途，其中，所述含有纤维素的玉米加工副产物选自玉米麸皮、喷浆玉米皮、ddgs、dds、玉米粉或玉米淀粉渣，或它们的任意组合。

17.如段落15或16所述的用途，其中，所述发酵的温度为28-37℃。

18.如段落17所述的用途，其中，所述发酵的温度为30℃。

19.如段落15-18中任一段所述的用途，其中，在所述发酵的过程中实时监测发酵体系的ph值，当ph值达到4.5以下时停止发酵。

20.如段落15-19中任一段所述的用途，其中，所述发酵的时间为3-6天。

21.如段落15-20中任一段所述的用途，其中，在进行所述发酵后，所述饲料中的地衣芽孢杆菌50的的活菌总数为1×10⁸cfu/ml-10×10⁸cfu/ml。

实施例

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，全部试剂购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

实施例中所用的试剂：

1.地衣芽孢杆菌培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，氯化钠10.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0，121℃灭菌15min。

2.地衣芽孢杆菌固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，氯化钠10.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0，121℃灭菌15min。

3.cmc筛选培养基：羧甲基纤维素钠(cmc)20.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0，121℃灭菌15min。

4.产纤维素酶测试培养基：cmc20.0g，蛋白胨10.0g，氯化镁0.3g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钾1.0g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌15min。

5.mrs培养基：mrs培养基65.25g，蒸馏水定容至800ml，121℃灭菌15～20min。

6.ypd培养基：酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌15～20min。

实施例1：地衣芽孢杆菌的分离和筛选

取10g山西汾酒大曲样品于90ml无菌生理盐水中，置于摇床上，在30℃、200rpm转速下振荡30min，然后10倍梯度稀释至10^-8。取1ml10^-8的稀释液至6cm平板中，加入20ml80℃的保持融化状态的地衣芽孢杆菌固体培养基，混匀冷却至室温，待凝固后倒置于30℃恒温培养箱中培养24h。24h后，可在平板上观察到有多个菌落生成，菌落形态为圆形菌落、边缘不整齐、表面有褶皱，经革兰氏染色呈阳性；在光学显微镜100倍油镜下观察，菌体形态成长杆状、单个、成对或链状排列；该特征与地衣芽孢杆菌的形态特征相同。

挑选单菌落(浓度为10⁹cfu/ml)接种至cmc筛选培养基平板上，于30℃倒置培养24h。24h后，向平板中加入5ml1w/v％刚果红溶液，室温下静置30min后弃掉刚果红溶液。向平板中加入1mol/l氯化钠溶液，室温下静置30min后弃掉氯化钠溶液。此时，平板上部分菌落周围出现一圈透明圈，如图2所示。将其中透明圈直径较大(直径为约4.0cm)的单菌落接种至地衣芽孢杆菌培养基中，于30℃、200rpm下振荡培养24h，然后进行划线培养获得单菌落。

将划线得到的单菌落重复上述步骤3次。透明圈直径越大说明菌株产纤维素酶能力越强，根据cmc筛选培养基上菌落所产生的透明圈大小，筛选出了一株能较好利用cmc的菌株，将其命名为地衣芽孢杆菌50。

实施例2：对地衣芽孢杆菌50的鉴定

2.1菌落形态学鉴定

对实施例1中分离的菌株通过生物学特性观察，进行进一步的形态鉴定(包括：观察菌落的形态和边缘、革兰氏染色等)，上述鉴定标准参照《伯杰细菌鉴定手册》，科学出版社，1984年以及《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001年。将该分离的菌株在地衣芽孢杆菌固体培养基上于30℃培养24h后，菌落形态为圆形菌落、边缘不整齐、表面有褶皱，经革兰氏染色呈阳性；在光学显微镜100倍油镜下观察，菌体形态成长杆状、单个、成对或链状排列；该特征与地衣芽孢杆菌的形态特征相同。

2.2分类学鉴定

通过16srdna序列对地衣芽孢杆菌50进行分类学上的鉴定。使用百泰克细菌高通量dna提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司、au46111-96)提取地衣芽孢杆菌50菌株的基因组dna。用细菌通用引物(上游引物：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno.:2)；下游引物：5’-aaggaggtgatccagccgca-3’(seqidno.:3))进行16srdnapcr扩增。pcr反应条件为：95℃4min；94℃1min，56℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。将扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列结果如图1所示(seqidno.:1)。将测序结果在ncbi中进行blast比对，该菌株与bacilluslicheniformisht-z58(genebank:kj526871.1同源性最高，同源性为100％。因此，筛选出的地衣芽孢杆菌50在分类学上属于地衣芽孢杆菌。

2.3纤维素酶活力的鉴定

将从北京香山土壤中分离得到的地衣芽孢杆菌a1和根据本发明的地衣芽孢杆菌50接种至250ml三角瓶中的50ml产纤维素酶测试培养基中，置于摇床上，30℃和200rpm的转速下培养48h。采用cmc酶活力测定法测定它们产纤维素酶的酶活，具体方法参见如下文献的记载：“一株纤维素降解菌的分离、鉴定及对玉米秸秆的降解特性”，吴文韬、鞠美庭、刘金鹏等，微生物学通报，2013，40(4)：712-719。经测定，地衣芽孢杆菌a1的48h发酵液的纤维素酶的酶活力仅为36.65u/ml，而地衣芽孢杆菌50的相应酶活力高达114u/ml。

实施例3微生物发酵剂的制备

通过以下步骤分别获得地衣芽孢杆菌50、植物乳杆菌(从市售的发酵牛乳中分离)和产朊假丝酵母(从市售的发酵饲料中分离)培养后的菌液：

(1)地衣芽孢杆菌：将实施例1获得的地衣芽孢杆菌50以1v/v％的接种量接种至地衣芽孢杆菌培养基中，置于恒温摇床上，30℃、200rpm转速下培养过夜。

(2)植物乳杆菌：将植物乳杆菌以1v/v％的接种量接种至mrs培养基中，置于恒温摇床上，30℃、200rpm转速下培养过夜。

(3)产朊假丝酵母：将产朊假丝酵母以1v/v％的接种量接种至ypd培养基中，置于恒温摇床上，30℃、200rpm转速下培养过夜。

利用gb4789.2-2006方法测定上述菌液中各菌的活菌数，将获得的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母菌液以2∶2∶1的比例混合，其中，使得地衣芽孢杆菌含量为约1亿cfu/ml，植物乳杆菌含量为约1亿cfu/ml，产朊假丝酵母含量为约1亿cfu/ml，制备成微生物发酵制剂。

实施例4使用实施例3的微生物发酵制剂进行发酵

将1.4重量份玉米淀粉渣、0.08重量份甜菜糖蜜、0.72重量份ddgs、0.6重量份dds、0.24重量份玉米粉、0.4重量份喷浆玉米皮混合作为饲料原料，添加水，将含水量调至35wt％，分装成400g/袋，备用。将实施例3制备的微生物发酵制剂以4v/w％的接种比例接种至上述固体饲料原料中作为实验组。添加相同量的含有地衣芽孢杆菌a1的微生物发酵制剂(除了将地衣芽孢杆菌50的菌液替换成地衣芽孢杆菌a1的菌液，按照实施例3相同的方法制得)作为对照组。将实验组和对照组在30℃静置发酵，实时监测饲料的ph值，待ph值为4.5时停止发酵(此时，共发酵6天)。根据如下方法检测实验组和对照组发酵前后的滴定酸度、粗蛋白、粗纤维、中性洗涤纤维，酸性洗涤纤维和活菌数：滴定酸度测定：gb/t12456-2008；粗蛋白测定：凯氏定氮法(gb6432-94)；中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗纤维测定：范式纤维测定法(vansoest等，1991)。检测结果见表1。

表1实验组和对照组发酵前后的检测结果

如表1所示，实验组使用实施例3制备的微生物发酵制剂(含有本发明的地衣芽孢杆菌50)进行发酵后，相对于发酵前，饲料原料中的粗纤维素降低的比例为约24.66％，中性洗涤纤维降低的比例为约16.73％，酸性洗涤纤维降低的比例为约18.06％；而对照组使用发酵制剂(含地衣芽孢杆菌a1)进行发酵后，相对于发酵前，饲料原料中的粗纤维降低的比例仅为约13.33％，中性洗涤纤维降低的比例为约4.71％，酸性洗涤纤维降低的比例为约5.56％，因此，本发明的由地衣芽孢杆菌50、植物乳杆菌、产朊假丝酵母组成的微生物发酵剂能有效降低以玉米加工副产物为原料制成的饲料中的纤维素含量，提高该类饲料的品质，有利于畜禽类消化吸收。

另外，相比于对照组的发酵后的饲料(相对于发酵前，增高了1.7％)，本发明实验组的发酵后的饲料具有更高的滴定酸度(相对于发酵前，增高了2.8％)，因此，采用本发明所述的微生物发酵制剂使得饲料发酵的程度更高。

同时，对照组中的地衣芽孢杆菌a1、植物乳杆菌和产朊假丝酵母在发酵后的饲料中的活菌数分别达到6.7×10⁷cfu/ml、1.2×10⁷cfu/ml、4.3×10⁶cfu/ml，相比之下，实验组中的地衣芽孢杆菌50、植物乳杆菌和产朊假丝酵母在发酵后的饲料中的活菌数分别达到5.6×10⁸cfu/ml、4.8×10⁸cfu/ml、3.4×10⁸cfu/ml，因此，本发明所述的微生物发酵制剂在发酵后能够产生明显更高含量的活菌数。高含量的有益菌随着发酵饲料进入动物肠道后定殖在动物肠道内，能够更强力地调节动物肠道微生态平衡，更好地起到保障动物机体健康的作用。

序列表

<110>吉林中粮生化有限公司

中粮营养健康研究院有限公司

中粮生物化学（安徽）股份有限公司

<120>产纤维素酶的地衣芽孢杆菌、其微生物发酵制剂及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1491

<212>dna

<213>地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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