一种鉴定双季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定双季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法。

背景技术：

茭白(zizanialatifoliaturcz.)为禾本科多年生宿根草本植物,原产于我国和东南亚地区，是我国的第二大水生蔬菜。茭白在我国早有栽培，西周之前，茭白的种子被作为粮食食用，后因发现其茎部被菰黑粉菌(ustilagoesculenta)感染而形成的菌瘿不仅可以食用，而且肉质肥嫩、口感极佳，而被当成一种蔬菜食用，唐朝末期开始被作为一种蔬菜广泛种植。除了作为蔬菜，茭白也可药用，具有利尿止渴、清热解毒之功效。双季茭是目前广泛种植于浙江、江苏、福建等地的茭白，一年两熟，相比于单季茭，具有较高的经济效益。茭白在市场上的价格随着时间波动较大，一般早熟和特晚熟的双季茭白收益较高，因此孕育早熟或特晚熟的茭白是目前选育茭白品种的一个重要方向。鉴于茭白的无性繁殖特性，现有研究一直没有找到合适的分子标记对茭白植株进行分析鉴定，即不同品种茭白植株间的差异化与其品种特性相关性较小。而有研究发现，菰黑粉菌的存在才是茭白形成的关键因素，对菰黑粉菌的生物学特性、培养条件、细胞学观察及分子进化等方面进行研究发现：不同品种茭白中菰黑粉菌的表型差异明显，且茭白品种中单双季，双季茭中的夏秋茭，其内生的菰黑粉菌属于不同的进化分支，表明菰黑粉菌的差异性与茭白品种特性密切相关。而不同菌对温度的适应性、与宿主的相互作用等特性都是该菌是否能顺利入侵及其潜育时间长短的决定因素，对品种早晚熟的影响较大。因此，我们推测菰黑粉菌与茭白早晚熟特性的形成密切相关，因此有必要对不同品种中菰黑粉菌的遗传多样性及其与早晚熟特性的关系进行研究，从而达到茭白辅助选育的目的。

snp标记的原理是：生物体内经常发生单核苷酸变异(缺失，插入，移码)，这种变异的结果成为单核苷酸多态性。尽管snps大多位于非编码区，但与生物体表型有非常密切的关系。随着高通量测序技术的发展，大量的snps被解析出来，也极大地推动了基因组层面评估遗传多样性的研究。由于snp数据量非常庞大，因此基于snp开发的分子标记具有较高的精准度。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鉴定双季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法的技术方案。本发明通过对茭白内生菰黑粉菌作snp扫描，筛选出多个与双季茭白早晚熟特性相关的分子标记，从而建立起双季茭白早晚熟分子标记辅助选择体系，提高早熟茭白品种和特晚熟茭白品种的选择效率，为茭白高效选育奠定基础。

所述的一种鉴定双季茭白早晚熟特性的分子标记，其特征在于包括分子标记ues1、ues2、ues3、ues4、ues5、ues6、ues7和ues8，所述分子标记ues1的正向引物uesnp1-f核苷酸序列如seqidno.1所示，反向引物uesnp1-r核苷酸序列如seqidno.2所示；所述分子标记ues2的正向引物uesnp2-f核苷酸序列如seqidno.3所示，反向引物uesnp2-r核苷酸序列如seqidno.4所示；所述分子标记ues3的正向引物uesnp3-f核苷酸序列如seqidno.5所示，反向引物uesnp3-r核苷酸序列如seqidno.6所示；所述分子标记ues4的正向引物uesnp4-f核苷酸序列如seqidno.7所示，反向引物uesnp4-r核苷酸序列如seqidno.8所示；所述分子标记ues5的正向引物uesnp5-f核苷酸序列如seqidno.9所示，反向引物uesnp5-r核苷酸序列如seqidno.10所示；所述分子标记ues6的正向引物uesnp6-f核苷酸序列如seqidno.11所示，反向引物uesnp6-r核苷酸序列如seqidno.12所示；所述分子标记ues7的正向引物uesnp7-f核苷酸序列如seqidno.13所示，反向引物uesnp7-r核苷酸序列如seqidno.14所示；所述分子标记ues8的正向引物uesnp8-f核苷酸序列如seqidno.15所示，反向引物uesnp8-r核苷酸序列如seqidno.16所示。

所述的分子标记在茭白育种中的应用。

所述的分子标记在茭白育种中鉴定双季茭白早晚熟特性中的应用。

所述的分子标记的获得方法，其特征在于包括以下步骤：

a、双季茭白早晚熟特性的鉴定：选取不同地区不同熟性的双季茭白品种并记录；

b、群体分析

1)分离培养茭白中的菰黑粉菌；

2)ctab法提取菰黑粉菌基因组dna；

3)将47个确定熟性双季茭白的菰黑粉菌基因组dna进行基因组二代重测序；

4)扫描得到所有snp；

5)筛选出在双季早熟茭白菰黑粉菌和双季晚熟茭白菰黑粉菌的差异snp位点；

6)选取48个采集自不同地区的双季茭白分离菰黑粉菌对筛选得到的snp位点进行验证；

c、使用其他具有早晚熟特性的双季品种鉴定筛选的snp位点并获得图谱；共获得8对具有早晚熟筛选特性的分子标记ues1、ues2、ues3、ues4、ues5、ues6、ues7和ues8。

所述的获得方法，其特征在于步骤a中双季茭白早晚熟特性的鉴定具体为：从浙江省桐乡市、浙江省金华市、浙江省缙云县、浙江省余姚市、浙江省杭州市以及江苏省苏州市搜集不同品种的双季茭白并记录采收期和茭重，对一些经典品种按品种审定时确定的熟性认定；采收时选取茭形完整、个头中等、茭叶无病害的茭白。

所述的获得方法，其特征在于步骤b的1)中分离培养茭白中的菰黑粉菌具体为：

a、将茭白茎部加无菌水磨碎；

b、涂布至含羧苄青霉素和卡那霉素的yeps培养基上培养4-6d。

所述的获得方法，其特征在于步骤b的5)中筛选出在双季早熟茭白菰黑粉菌和双季晚熟茭白菰黑粉菌的差异snp位点具体为：

a、将所有snp数据标记为a、b、c三类，代表早熟、中熟、晚熟三个特性；

b、计算机自动识别a、b、c三类所有的snp并归类；输出格式为genotyping*simple-a/b/c.txt.；数据内容为snp_sitea/b,a代表具有该snp的个数，b代表一类的总个数；

c、将数据复制至excel工作表，使用筛选功能，选取只在a类中为1，c类中为0的snp。

所述的获得方法，其特征在于步骤b的6)中选取48个采集自不同地区的双季茭白分离菰黑粉菌对筛选得到的snp位点进行验证具体包括：

a、将48个采集自不同地区的双季茭白进行研磨分离；

b、提取全部菰黑粉菌基因组dna；

c、针对获得的snp数据设计as-pcr引物；

d、选取典型早晚熟特性的双季茭白菰黑粉菌dna进行as-pcr验证，验证获得16个具有多态性的snp位点；针对这16个snp位点设计hrm检测扩增引物；

e、将48个双季茭白菰黑粉菌dna用16对hrm引物扩增，pcr产物用于hrm检测；

f、用不同颜色的曲线标记双季茭早晚熟特性。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明以47个具有早晚熟特性的双季茭白的基因组重测序数据为基础，扫描得到snp数据，并且通过有效手段筛选得到早晚熟相关联位点。结合48种不同地区不同熟性的双季茭白菰黑粉菌为对象的鉴定结果，筛选出早晚熟相关的分子标记。

2)研究周期短，以各个地区茭白品种为材料，可以排除环境因子对双季茭白熟性的干扰。

3)snp标记基于基因组重测序数据，具有良好的精准度，且位点丰富，

信息量大，筛选的位点更具可靠性。

4)茭白育种周期长，选育过程繁琐，通过snp标记筛选早熟或特晚熟品种，可以对优良双季茭白品种提早选择，减少工作量，提高筛选效率。

附图说明

图1为8个典型双季早晚熟茭白菰黑粉菌78对引物as-pcr多态性结果，筛选具有多态性的位点；

图2为实施例3中lightscanner高分辨熔解曲线；

图3为8个snp位点在48种双季茭白菰黑粉菌中的分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实验方法种如无特殊说明，均为常规方法。实施例种除实验材料以外其他均可通过商业途径购买获得。

实施例1：试验材料及早晚熟性分类

以下试验材料分别来源于浙江省金华市农业科学研究院、浙江省丽水市缙云县农业局、浙江省宁波市余姚市农业科学研究所、江苏省苏州市农业科学研究院、浙江省嘉兴市桐乡市董家茭白合作社、浙江省绍兴市嵊州市普惠蔬菜合作社、浙江省台州市黄岩区蔬菜研究所。样品采收时间在2016年秋季、2017年秋季、2018年夏季、2018年秋季。

表1供试样品品种、熟性及来源

实施例2：群体分析

1)采用ctab法提取菰黑粉菌基因组dna，用核酸微量测定仪测定dna浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。用ddh2o稀释至100ng/μl，置于-20℃保存。

2)将确定早晚熟性的47个双季茭白品种的dna送去二代重测序。参考基因组为菰黑粉菌mt型基因组，wgsinsdc:jtlw00000000.1。

3)测序数据用gatk、samtools、bwa软件比对至参考基因组，获得snp数据文件。共获得321659个snp位点。

4)将所有参与snp扫描的菰黑粉菌样品编号为a、b、c三类，分别代表双季早熟、双季中熟、双季晚熟三类。通过提取snp扫描结果中的genotype数据，将a、b、c三类的snp数据输出为snpca/b格式，a代表在第c个snp位点该类snp个数，b代表该类样品总个数。将输出结果一并粘贴至excel工作表中，运用excel筛选功能，筛选出双季早熟中为b/b，双季晚熟中为0/b的snp位点。(在本例中，a为16，b为14，c为17，因此选出snpc＝(a列＝16/16，c列＝0/17)共5997个snp位点。

实施例3：snp位点鉴定

1)在5997个筛选得到的snp位点中每间隔60个挑选1个snp位点作为验证位点。同时由于参考基因组测序质量问题，需排除在参考基因组较为靠后的contig中的snp位点，一共筛选出78个可用于验证的snp位点，并设计相关引物。

2)as-pcr(等位基因特异性pcr)，as-pcr是利用引物3’端碱基错配能使pcr延伸程序中断致使无扩增产物的原理，在检测snp、等位基因基因型方面有重要作用。本例设计了78对as-pcr引物，所有引物已附表2。

表2等位基因特异性pcr引物序列表

3)本例使用8个具有典型双季早晚熟特性的茭白股黑粉菌dna作为模板验证上表snp位点的多态性。

4)as-pcr体系：1μl菰黑粉菌基因组dna；0.4μm正向引物；0.4μm反向引物；5μl2×taqmasterplusmix；3.2μlddh2o。

5)as-pcr程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸15s；共34个循环；72℃彻底延伸7min；12℃保存。

6)将所有pcr产物用2％琼脂糖凝胶电泳，检测条带有无。

7)电泳验证结果(如图1所示)：1代表有条带；0代表条带；n代表非特异性条带；带*代表该位点在早晚熟中具有多态性。

8)本例中将16个具有多态性的位点进行进一步的检测，检测方法为hrm曲线(高分辨率熔解曲线)。

9)hrm的主要原理是根据dna序列的长度、gc含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。其优势在于成本低廉，单次检测量大，精确度高，检测后的样品可继续用于其他实验，且可以用于区分等位基因纯合子和杂合子。

10)本例中针对上述16个snp位点设计16对hrm检测片段扩增引物。所有引物已附表3。

表3hrm检测片段扩增引物

11)本例中使用48种(表1中编号为48-95的茭白品种)具有双季早晚熟特性的茭白菰黑粉菌dna作为模板验证步骤7)中筛选得到的16个多态性snp位点。

12)hrm-pcr体系：1μl菰黑粉菌基因组dna；0.6μm正向引物；0.6μm反向引物；7.5μl2×taqmasterplusmix；5.3μlddh2o。

13)hrm-pcr程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸15s；共40个循环；72℃彻底延伸7min；12℃保存。

14)向所有pcr产物的孔里加1μl5×evagreen荧光染料，封口1000rpm离心15s，然后加20μl矿物油封闭。

15)94℃变性2min，使荧光染料充分结合到dna双链中。

16)使用lightscanner高分辨熔解曲线系统检测产物，检测结果如图2所示。

17)结果显示，hrm-4、hrm-7、hrm-8、hrm-9、hrm-10、hrm-12、hrm-13、hrm-15对茭白早晚熟特性分型较明显，因此，将hrm-4、hrm-7、hrm-8、hrm-9、hrm-10、hrm-12、hrm-13、hrm-15即对应为分子标记ues1、ues2、ues3、ues4、ues5、ues6、ues7和ues8。

18)8个snp位点在48种双季茭白菰黑粉菌中的分布图，如图3所示。

序列表

<110>中国计量大学

<120>一种鉴定双季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>1

cgctcgcgcgacaccgtctt20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>2

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<210>3

<211>33

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>3

caacattcactgtctctacacaagatcccatac33

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>4

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<210>5

<211>32

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>5

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<210>6

<211>21

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>6

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<400>7

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<212>dna

<213>引物(primer)

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<213>引物(primer)

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<212>dna

<213>引物(primer)

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<212>dna

<213>引物(primer)

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<211>22

<212>dna

<213>引物(primer)

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<212>dna

<213>引物(primer)

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<212>dna

<213>引物(primer)

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<212>dna

<213>引物(primer)

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