一种利用EST微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的引物及方法与流程

本发明涉及利用est微卫星标记鉴别植物的方法，具体涉及一种利用est微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的引物及方法。

背景技术：

黄花牛耳朵(primulinalutea)和牛耳朵(chiritaeburneahance)同为苦苣苔科报春苣苔属植物，二者形态相似，亲缘关系十分相近，在过去的分类系统中，黄花牛耳朵被认为只是牛耳朵的一个变种，直到2004年经鉴定后才被重新命名。

除了在花的形态及适应性上存在区别，两种苦苣苔植物的根状茎及叶片所含化学成分也有所不同，其中牛耳朵含有种类丰富的苯乙醇苷类化合物，但在黄花牛耳朵中却检测不到上述类型的物质。在广西民间，牛耳朵以全草入药，具有清肺止咳，补虚止血的作用，主要用来治疗肺结核、咳喘、吐血、高血压等病症。而黄花牛耳朵的花色和花形十分美观，可开发成为优良的观赏盆花，但是与牛耳朵相比，它的药用价值不高，作为中草药在民间应用较少。由于黄花牛耳朵与牛耳朵形态十分相似，只有开花的时候才能准确区分这两个物种，因此精确区分黄花牛耳朵与牛耳朵是进行有效利用这两种苦苣苔植物的前提和基础，这对于黄花牛耳朵与牛耳朵的观赏价值及药用价值的充分开发具有重要的理论意义和指导价值。

表达序列标签(expressedsequencetag，est)是指通过对cdna文库随机选择的cdna克隆进行大规模测序所获得的cdna的5’端或3’端序列，反应mrna的信息。大量的est数据资源为微卫星(ssr)标记的开发提供了一个十分便捷的来源，不仅可以不经过构建小片段基因组文库等繁步骤就得到适合于遗传学分析的微卫星标记，即节省传统开发以ssr所需的人力物力，又为功能基因提供信息，同时也是对est数据资源的充分利用。

由于est来自转录区，其保守性较高，在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记更高，且具有开发简单、快捷、费用低等特点，因此est微卫星标记已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面。但目前尚未见有利用est微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的引物及方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种利用est微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的引物及方法。

本发明所述的利用est微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的引物如下：

est-f：5’-aacgggttgtgttctgacgt-3’；

est-r：5’-cgattcgagacccctcttcg-3’。

本发明还提供一种利用est微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的方法，包括以下步骤：

(1)提取待鉴定样品的基因组dna，得基因组dna溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组dna溶液为模板，利用前述引物对基因组dna进行pcr扩增，制得pcr扩增产物；

(3)对步骤(2)制得的pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像仪上成像，当pcr扩增产物电泳图谱显示被测样品有230bp的条带时，则该被测样品为牛耳朵；当pcr扩增产物电泳图谱显示被测样品有210bp的条带时，则该被测样品为黄花牛耳朵。

上述方法的步骤(1)中，采用现有常规方法提取待鉴定样品的基因组dna，以获得基因组dna溶液。

上述方法的步骤(2)中，pcr扩增的扩增体系为：

基因组dna溶液1μl，100um引物0.25μl，5u/μltaq酶0.10μl，10×taqbuffer1.0μl，20mmdntp1μl，25ummg²⁺，双蒸水或纯水补至5.45μl。

上述方法的步骤(2)中，pcr扩增的扩增条件为：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行5个循环；95℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环；72℃延伸10分钟。

上述方法的步骤(3)中，对pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的操作与现有技术相同。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、提供了一对利用est微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的特异引物，同时还提供了利用所述特异引物对鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的方法，为鉴定黄花牛耳朵与牛耳朵提供了简便稳定的分子标记，解决了区分黄花牛耳朵与牛耳朵的问题。

2、从分子水平探索了黄花牛耳朵与牛耳朵直系同源基因est-ssr序列的不同，探索建立了黄花牛耳朵与牛耳朵的鉴别技术，为今后黄花牛耳朵与牛耳朵的种群动态鉴定、生物学以及控制的研究奠定了基础。

附图说明

图1为实施例2中pcr产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中a为黄花牛耳朵；b为牛耳朵；m为500bpdnamarker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例涉及的黄花牛耳朵及牛耳朵均于2017年采集于广西植物所苗圃，并均进行了形态鉴定。

实施例1：构建黄花牛耳朵及牛耳朵转录组文库并测序

首先提取黄花牛耳朵及牛耳朵的总rna，将提取的rna经琼脂糖凝胶电泳、核酸浓度及质量检测，判断总rna浓度。将其中的包含poly(a)的mrna通过有oligo(dt)的磁珠进行富集纯化，反转录出双链cdna并纯化，利用klenow添加poly(a)并连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳对目的大小cdna片段的回收和纯化。利用pcr扩增产物中的cdna片段，并对pcr目的产物进行胶回收，纯化并检测合格后的cdna片段，作为cdna文库在illuminahiseqtm2500上开展测序工作。通过basecalling软件对测序峰图进行读取，最终转化为序列数据(rawreads)，经过对原始数据的分析筛选，得到黄花牛耳朵及牛耳朵的转录组文库。

利用黄花牛耳朵及牛耳朵的转录组文库中的est序列，经过序列的前处理和聚类分析后，分别得到156965、157728个unigenes序列。用orthomcl对全长的cds序列进行直系同源基因搜索，并筛选出一对一的直系同源基因，然后用paml-codeml计算直系同源基因的非同义替换率(ka)，同义替换率(ks)，并计算了ka/ks值。对获得的直系同源基因进行筛选，排除掉ks>0.1，基因片段长度小于150bp，ka及ks值难以获得的直系同源基因，采用misa(1.0版，默认参数；对gene进行ssr检测，详见http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html。查找标准：二核苷酸重复6次以上，三核苷酸重复5次以上，重复单元碱基数大于14bp，获得10对引物。

经过对上述引物进行筛选，最终获得一对引物，分别为seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列，引物序列如下：

est-f：5’-aacgggttgtgttctgacgt-3’(seqidno.1)；

est-r：5’-cgattcgagacccctcttcg-3’(seqidno.2)。

实施例2：用实施例1确定的引物鉴别黄花牛耳朵及牛耳朵的方法

(1)黄花牛耳朵基因组dna及牛耳朵基因组dna的提取，按以下方法进行：

1)将加有4mlctab提取液及80μl巯基乙醇的10ml离心管放入65℃水浴锅中预热；

2)取1-2g植物叶片于研钵中，适量液氮研磨成粉末后转入预热的ctab提取液，充分混匀，65℃水浴保温30min，期间，每隔5-6min摇晃一下；

3)将温浴好的样品置于冰上迅速冷却至室温，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀后12000rpm离心10min，取上清液500-1000μl于1.5ml离心管中(其余上清液于-20℃保存备用)；

4)加入100μl硅珠悬浮液(1.2g硅珠粉末溶解于10ml无菌水)，利用旋涡震荡器震荡(约15s)，使之充分混匀，于室温静止10min后旋涡震荡5s，8000rpm离心15s，弃上清液，得到硅珠-核酸复合物；

5)将复合物充分旋涡使之完全分散，加入等体积(500-1000μl)漂洗液(120gguscn溶解于100ml100mm/ltris-hcl缓冲液中，ph＝6.4)，充分混匀后8000rpm离心15s，弃上清液；

6)重复步骤5)一次；

7)将复合物旋涡分散，后用70％乙醇将硅珠-核酸复合物漂洗两次，再用无水乙醇漂洗一次(漂洗过程同前)，最后将复合物真空干燥15min；

8)加入100μl1×te缓冲液充分旋涡震荡后，于56℃温浴10min，12000rpm离心5min，取上清液；

9)重复步骤7)一次；

将两次得到的上清液混合，12000rpm离心10min，取上清液即为所提的dna溶液。利用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行dna质量检测，紫外分光光度计检测纯度，于-20℃冰箱中贮存。

(2)黄花牛耳朵与牛耳朵基因的pcr扩增

分别以步骤(1)制得的黄花牛耳朵基因组dna溶液和牛耳朵基因组dna溶液为模板，以实施例1确定的引物对它们分别进行pcr扩增，制备两种植物的pcr扩增产物；

pcr扩增体系为：

基因组dna溶液1μl，100um引物0.25μl，5u/μltaq酶0.10μl，10×taqbuffer(缓冲液)1.0μl，20mmdntp1μl，25ummg²⁺，ddh2o补至5.45μl；

pcr扩增的扩增条件如下：

pcr扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行5个循环；95℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环；72℃延伸10分钟。

(3)用质量百分比为8.0％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分别对步骤(2)制得的两种pcr扩增产物进行检测，银染后在紫外凝胶成像仪上成像。结果显示，牛耳朵的pcr扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上均有一条230bp的条带，而黄花牛耳朵的pcr扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上均有一条210bp的条带，如图1所示。

序列表

<110>桂林师范高等专科学校

<120>一种利用est微卫星标记鉴别黄花牛耳朵和牛耳朵的引物及方法

<130>2018

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

aacgggttgtgttctgacgt20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

cgattcgagacccctcttcg20