一种真菌杀虫剂母药及其充氮常温贮藏方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体为一种真菌杀虫剂母药及其充氮常温贮藏方法。

背景技术：

基于白僵菌（beauveria）、绿僵菌（metarhizium）等昆虫病原真菌的真菌杀虫剂有效成份即母药一般是具有完整细胞结构的侵染体，如固体发酵生产的分生孢子是最常见真菌杀虫剂母药。在生产过程中，企业需要建冷库贮存不断生产的孢子粉，出厂时配制成可湿性粉剂等剂型进入销售和使用渠道。干燥孢子粉在4～6℃冷库中低温贮存的有效期限一般要求达到一年以上，期间冷库耗电量较大，由此升高真菌杀虫剂的生产成本。干燥的真菌孢子粉虽然处于休眠状态，但仍维持低水平的生命活动，环境温度越高生命活动越旺盛，消耗细胞能量越多，其活力也下降越快，从而影响真菌杀虫剂产品的质量和杀虫效果。常温下贮存孢子粉母药一般在三个月后活孢率开始快速下降，故生产企业一般必须建冷库消耗电能才能延长母药的贮藏期。此外，基于孢子粉母药而配制的粉剂类产品，一般采不透光材料袋装或罐装，不仅运输和销售过程中需要低温冷贮，到农户手中若不及时使用也需要低温冷贮，才能保证产品的活力和杀虫效果。这在一定程度上成为真菌杀虫剂推广应用的限制性因素。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种真菌杀虫剂母药及其充氮常温贮藏方法的技术方案，其将惰性氮气注入装有真菌杀虫剂孢子粉母药或粉剂类产品的密封袋或容器，尽可能减缓和降低孢子的生命活动，在常温下贮藏即可获得低温冷贮的同样效果，贮藏过程中不耗费电能，可有效降低真菌杀虫剂的企业生产成本，并方便农户使用。

所述的一种真菌杀虫剂母药，其特征在于采用以下方法制备：将灭菌和适度熟化的稻米、脱皮大麦或小麦物料与生产菌株的菌丝培养液或孢子粉按比例混匀接种，生物量与物料之比不超过0.5%，装入固相发酵装置，在23-27℃下培养至充分产孢，发酵的物料干燥后，用机械装置分离获得孢子粉，再真空干燥至含水量不超过5%，即为高纯度分生孢子粉即真菌杀虫剂母药。

所述的一种真菌杀虫剂母药，其特征在于所述的菌丝培养液采用以下方法制备：将保存在-75～-85℃超低温冰箱的孢子粉与石英砂混合物均匀涂抹接种于萨氏培养基平板上，在23-27℃和光周期11-13:11-13小时条件下活化培养至充分产孢，所获孢子粉悬于不含琼脂的萨氏培养液中，小三角瓶摇床振荡140-160r/min，培养3天，再逐级扩大液体培养，以获得足够的菌丝培养液，干菌丝生物量约为1～1.2克/升。

所述的一种真菌杀虫剂母药，其特征在于具体的制备方法包括：

1）固相产孢发酵：将普通粳米在0.3%次绿酸纳液中浸泡3～5小时，清水淘洗后在灭菌锅中正常灭菌，使其熟化程度达到六成左右；自然冷却时，将适度熟化的稻米与菌丝培养液按9-11%的重量体积比混合，搅拌均匀的接种物料平摊在透光立式多层产孢培养箱的各物料盘中，调节室温在23-27℃，固体发酵8～10天至充分产孢；

2）孢子粉收获与干燥：将上述发酵物料在29-33℃通风烘箱中干燥过夜，然后用mh-v型真菌孢子分离器从风干物料上收获孢子粉，所获孢子粉进一步常温真空干燥13-25小时，即得含水量不超过5%的高纯度分生孢子粉即真菌杀虫剂母药。

所述的一种真菌杀虫剂母药的充氮常温贮藏方法，其特征在于将真菌杀虫剂母药或其产品置于封闭的包装袋或容器中，再在包装袋或容器中注入惰性氮气，常温贮存即可。

所述的一种真菌杀虫剂母药的充氮常温贮藏方法，其特征在于母药或其产品装入密封式包装袋中，装入量不超过包装袋容积的80%，再注入氮气直到包装袋鼓胀为止，即刻用胶带贴封氮气注入的针孔。

所述的一种真菌杀虫剂母药的充氮常温贮藏方法，其特征在于密封式包装袋为罐状、桶状或其他形式的密封式容器。

上述一种真菌杀虫剂母药及其充氮常温贮藏方法，其优点在于利用廉价氮气的惰性，强化真菌孢子在包装袋或容器内的休眠状态，延缓其活力的衰变，在常温下贮藏可获得低温冷贮的同样效果，具有操作简便、节能降耗、延长货架期及方便农户的特点，因而具有独特的技术创新性和应用前景。

附图说明

图1为本发明球孢白僵菌孢子粉历时12个月贮存期间的活孢率变化图；

图2为本发明金龟子绿僵菌孢子粉历时12个月贮存期间的活孢率变化图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明以一株球孢白僵菌（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号：cgmccno.1284）和一株金龟子绿僵菌株（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号：cgmccno.2375）作为实施实例，两种菌都是国内外现有真菌杀虫剂产品的主要来源。

实施步骤如下：

步骤1：种子液生产。将保存在负80℃超低温冰箱的孢子粉与石英砂混合物均匀涂抹接种于萨氏培养基平板上，在25℃和光周期12:12小时条件下活化培养至充分产孢。所获孢子粉悬于不含琼脂的萨氏培养液中，小三角瓶摇床振荡(150r/min)培养3天，再逐级扩大液体培养，以获得足够的菌丝培养液（干菌丝生物量约为1～1.2克/升），备用。

步骤2：固相产孢发酵。将市售普通粳米在0.3%次绿酸纳液中浸泡3～5小时，清水淘洗后在灭菌锅中正常灭菌，使其熟化程度达到六成左右。待自然冷却时，将适度熟化的稻米与步骤1的菌丝培养液按10%的重量体积比混合，搅拌均匀的接种物料平摊在透光立式多层产孢培养箱的各物料盘中，调节室温在25℃左右，固体发酵8～10天至充分产孢。

步骤3：孢子粉收获与干燥。将步骤2的发酵物料在33℃通风烘箱中干燥过夜，然后用mh-v型真菌孢子分离器从风干物料上收获孢子粉。所获孢子粉进一步常温真空干燥24小时，即得含水量不超过5%的高纯度分生孢子粉即真菌杀虫剂母药。

步骤4：孢子粉贮存。将各菌株的干燥孢子粉按2克等量分装于不透光锡箔包装袋内，封袋后分别按三种方法（处理）进行贮存，每种方法贮存20袋。常温充氮贮存法，采用软件管连接的孔针将氮气注入孢子粉中直到包装袋鼓胀起来，即刻用胶布贴住针对孔后抽出孔针，再用手指捏实粘贴处，以防氮气逸出。充氮后的20袋孢子粉置于室内贮柜中常温贮存，并以不充氮的20袋孢子粉在相同条件下贮存作为对照。另将20袋不充氮的孢子粉置于4～6℃（～5℃）冰箱中冷贮，作为低温冷贮对照。各处理袋装孢子粉的贮存均始于同一时间，历时12个月。

步骤5：贮存期间孢子活力检测。从贮存起始时间开始，每隔3个月自各处理随机取3个贮存袋，再从每袋中任取3个孢子样品分别悬于0.02%吐温80液中，配成终浓度为10⁷个孢子/ml的悬液。吸取100μl孢子悬液，均匀涂抹于萨氏培养基平板上。所有平板置于25℃和光照期12:12小时条件下静止培养24小时（球孢白僵菌）或36h（金龟子绿僵菌），然后在显微镜下观察每个平板的5个视野中萌发和未萌发的孢子数，由此估计的萌发率作为各贮存处理随贮存时间变化的活孢率。

步骤6：贮存效果比较。历时12个月贮存期间的活孢率变化图示如下。无论球孢白僵菌（图1）还是金龟子绿僵菌（图2）的孢子粉，各处理在贮存开始时的活孢率完全一致（～99%）。在贮存期间，每种真菌孢子粉的活孢率变化在充氮常温处理和～5℃低温冷贮处理之间不存在统计学意义上的显著差异。在上述两处理中，球孢白僵菌贮存满6个月时的活孢率为93-95%，满12个月时的活孢率仍维持在90%左右。金龟子僵菌的活孢率衰变较快，上述两处理贮存满6个月时的活孢率为81%左右，满9个月时为71%左右，满12个月时仅剩35%左右，说明该株金龟子绿僵菌孢子粉的安全贮藏期远不如供试球孢白僵菌菌株的孢子粉，其差异来源于菌株的生物学特性而不是贮存方式。与上述两种贮存方式相比，不充氮常温贮存处理的活孢率衰变快得多，球孢白僵菌贮存满6个月时的活孢率为75%，满9个月时陡降至27%，而金龟子绿僵菌贮存满6个月和9个月时的活孢率分别为57%和22%。结果表明，无论球孢白僵菌还是金龟子绿僵菌，其干燥孢子粉的充氮常温贮存和不充氮低温冷贮的效果是完全相同的，其有效贮存期比不充氮常温贮存大幅延长。换言之，充氮常温贮存方法完全可替代低温冷贮方法，用于贮存真菌杀虫剂母药及其粉剂类产品。