本发明涉及医药
技术领域：
：，特别是一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a基因干扰载体的制备方法。
背景技术：
：：慢病毒载体作为一个高效实用的基因转移工具，其在基础和应用研究领域已得到广泛认可。rnai是可以抑制正常生物体内特定基因表达的一种工具，在进化过程中高度保守，由双链rna(double-strandedrna,dsrna)诱发目的mrna高效特异性降解的现象，其利用rna介导，可特异性地阻断和降低目的基因。慢病毒载体作为一类来源于逆转录病毒的载体，可感染分裂期和非分裂期细胞，其感染效率高。利用rna介导，可特异性地阻断和降低目的基因的表达，同时载体感染细胞的范围扩大，外源的short-hairpinrnas(shrnas)既可用于细胞特定基因功能的研究，还可用于基因治疗。研究表明哺乳动物有两种形式的腺苷甲硫氨酸转移酶，一种是肝脏特异性的mat1a，编码mati/iii；再一种是非肝脏特异性的mat2a，编码matii。另外一个基因—mat2b，编码β调控亚基，与mat2a编码的α2催化亚基一起调控matii的酶活性。mati/iii主要在肝脏细胞中表达并维持着这些细胞的分化状态；matii在所有的肝外细胞中表达，在正常的肝细胞中检测不到其表达，但是在肝癌细胞的激活或去分化状态时能够被激活。在肝癌细胞中，c-myb,sp1,nf-κb和ap-1等转录因子能够促进mat2a启动子的转录，同时mat2a的表达能够响应于tnf-α的处理。mat2a作为mafk的一个转录抑制子与染色质调控基因一起为same提供甲基转移酶。除此之外，在人类的结肠癌和肝癌细胞中，matα2泛素化可以正向的调控bal-2的表达。在大鼠的肝癌细胞中，pparγ负调控处于静息状态肝癌细胞时的mat2a基因表达，但是在由静息状态转向激活状态时，则可以上调mat2a基因的表达。同时，mat2a能特定地与h3k9甲基转移酶setdb1互作以及结合mat2b促进cox-2基因位点的h3k9三甲基化而抑制cox-2基因表达。先前研究采用基因芯片技术发现mat2b与猪肌内脂肪含量密切相关，其在脂肪型猪和瘦肉型猪的脂肪和肌肉组织中存在着显著的差异表达，推测可能影响猪肌内脂肪沉积。目前关于mat2a基因的研究层面主要集中在癌细胞等方面，在脂肪细胞分化及其调控机制方面并未有相关报道。本研究通过构建mat2a基因的慢病毒干扰载体，达到降低肌内脂肪细胞脂质沉积，为进一步研究mat2a调控脂肪细胞分化及分子机理实现治疗肝癌的用药垫定技术基础。技术实现要素：针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a基因干扰载体的制备方法，可有效解决肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a的干扰，达到治疗肝癌用药的问题。本发明解决的技术方案是，一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a基因干扰载体的制备方法，包括以下步骤：（1）慢病毒mat2a干扰载体的构建：根据genbank中猪mat2a基因序列，利用invitrogen公司在线软件block-ittmrnaidesigner分别筛选3条shrna靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为mat2a-sh1、mat2a-sh2、mat2a-sh3、sh-scramble（sh-scramble是实验对照序列；对照序列对任何基因起不到干扰作用，实验有处理，就必须有对照，也就是比较的对象；把sh-scramble也转入细胞中，目的是所有的处理都处在同样的水平之下），与经过bamhi和xhoi(takara)双酶切后的plenti-h1载体连接，转化dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒mat2a干扰载体；（2）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装：将步骤（1）制备的慢病毒mat2a干扰载体转染到含有慢病毒载体的293t细胞的培养基中，对重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装，方法是：对细胞密度为85-95%的293t细胞置入新鲜的培养基中2-4h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.5gdmem干粉（dmem是dulbecco'smodifiedeaglemedium的缩写）、胎牛血清10ml（均购买于美国gbico公司），0.22gnahco3，0.26ghepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：a液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒mat2a干扰载体+7.5μgδ8.9+5μgvsvg（vsvg是一种包膜蛋白，病毒正是通过包膜蛋白与宿主细胞识别，然后进入细胞，全称是疱疹性口腔炎病毒糖蛋白g，以下同）溶解在1.5ml无血清无双抗dmem培养基中（无血清无双抗dmem培养基简称为opti-dmem培养基，以下同），混匀，所述的无血清无双抗dmem培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.4-0.6gdmem干粉（购买于美国gbico公司），0.18-0.26gnahco3，0.2-0.3ghepes，混匀制得；b液，为溶解有脂质体的溶液：由30-40μlx-tremegenehpdna溶解在1-2ml无血清无双抗dmem培养基中，混匀制得；将a液和b液，分别室温静置4-6min，混合均匀，再室温静置18-22min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，20-30h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于1800-2200rpm离心8-12min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液；（3）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液过0.4-0.5μm滤膜，用80000-120000r·min-1离心25-35min得到浓缩的病毒颗粒；按照8-12倍体积比用水稀释病毒，以10-2～10-6浓度梯度分别感染293t细胞，每个梯度3个重复，35-40℃、置于体积为5%的co2培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·ml-1）=gfp阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01ml，计算病毒滴度；4）plentih1-mat2ashrna侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用plentih1-mat2a-shrna慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，当细胞中都有gfp表达时（说明病毒侵染效率较高），分别收集脂肪细胞的rna和蛋白，利用realtime-pcr和westernblot检测mat2a-shrna的干扰效率，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中mat2a-shrna1、mat2a-shrna2、mat2a-shrna3的mrna干扰效率分别是45％、70％和55％，收集mat2a-shrna2的干扰载体（mat2a-shrna2干扰效率最高，所以mat2a-shrna2为最佳干扰片段，即mat2a-shrnap）；5）干扰载体mat2a-shrna2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测：plentih1-mat2a-shrna侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化8天至成熟，油红o检测脂质积累情况，与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-mat2a处理组中显著降低，达48-52%，即为慢病毒介导的mat2a基因干扰显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质沉积的mat2a基因干扰载体（简称mat2a-shrna2）。本发明所述的降低猪肌内脂肪细胞脂质沉积的mat2a干扰载体的制备方法易操作、灵敏，稳定可靠，通过plentih1-mat2a-shrna慢病毒能显著降低脂肪细胞中mat2amrna和蛋白的表达水平，且脂肪细胞中脂质含量水平也明显下降，实现对猪肌内脂肪细胞脂质沉积的干扰作用，达到治疗疾病之目的，是治疗疾病药物上的创新，经济和社会效益显著。具体实施方式以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。实施例1本发明一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a基因干扰载体的制备方法，包括以下步骤：（1）慢病毒mat2a干扰载体的构建：根据genbank中猪mat2a基因序列，利用invitrogen公司在线软件block-ittmrnaidesigner分别筛选3条shrna靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为mat2a-sh1、mat2a-sh2、mat2a-sh3、sh-scramble，与经过bamhi和xhoi(takara)双酶切后的plenti-h1载体连接，转化dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒mat2a干扰载体；（2）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装：将步骤（1）制备的慢病毒mat2a干扰载体转染到含有慢病毒载体的293t细胞的培养基中，对重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装，方法是：对细胞密度为90%的293t细胞置入新鲜的培养基中3h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.5gdmem干粉，胎牛血清10ml，0.22gnahco3，0.26ghepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：a液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒mat2a干扰载体+7.5μgδ8.9+5μgvsvg溶解在1.5ml无血清无双抗dmem培养基中，混匀，所述的无血清无双抗dmem培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.5gdmem干粉，0.22gnahco3，0.26ghepes，混匀制得；b液，为溶解有脂质体的溶液：由35μlx-tremegenehpdna溶解在1.5ml无血清无双抗dmem培养基中，混匀制得；将a液和b液，分别室温静置5min，混合均匀，再室温静置20min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，24h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于2000rpm离心10min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液；（3）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液过0.45μm滤膜，用100000r·min-1离心30min得到浓缩的病毒颗粒；按照10倍体积比用水稀释病毒，以10-4浓度梯度分别感染293t细胞，每个梯度3个重复，37℃、置于体积为5%的co2培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·ml-1）=gfp阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01ml，计算病毒滴度；4）plentih1-mat2ashrna侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用plentih1-mat2a-shrna慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，当细胞中都有gfp表达时（说明病毒侵染效率较高），分别收集脂肪细胞的rna和蛋白，利用realtime-pcr和westernblot检测mat2a-shrna的干扰效率，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中mat2a-shrna1、mat2a-shrna2、mat2a-shrna3的mrna干扰效率分别是45％、70％和55％，收集mat2a-shrna2的干扰载体（mat2a-shrna2干扰效率最高，所以mat2a-shrna2为最佳干扰片段，即mat2a-shrnap）；5）干扰载体mat2a-shrna2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测：plentih1-mat2a-shrna侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化8天至成熟，油红o检测脂质积累情况，与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-mat2a处理组中显著降低，达48-52%，即为慢病毒介导的mat2a基因干扰显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质沉积的mat2a基因干扰载体。实施例2本发明一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a基因干扰载体的制备方法，包括以下步骤：（1）慢病毒mat2a干扰载体的构建：根据genbank中猪mat2a基因序列，利用invitrogen公司在线软件block-ittmrnaidesigner分别筛选3条shrna靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为mat2a-sh1,mat2a-sh2，mat2a-sh3，与经过bamhi和xhoi(takara)双酶切后的plenti-h1载体连接，转化dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒mat2a干扰载体；（2）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装：将步骤（1）制备的慢病毒mat2a干扰载体转染到含有慢病毒载体的293t细胞的培养基中，对重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装，方法是：对细胞密度为85%的293t细胞置入新鲜的培养基中2h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.5gdmem干粉，胎牛血清10ml，0.22gnahco3，0.26ghepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：a液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒mat2a干扰载体+7.5μgδ8.9+5μgvsvg溶解在1.5ml无血清无双抗dmem培养基中，混匀，所述的无血清无双抗dmem培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.4gdmem干粉，0.18gnahco3，0.2ghepes，混匀制得；b液，为溶解有脂质体的溶液：由30μlx-tremegenehpdna溶解在1ml无血清无双抗dmem培养基中，混匀制得；将a液和b液，分别室温静置4min，混合均匀，再室温静置18min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，20h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于1800rpm离心12min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液；（3）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液过0.4μm滤膜，用80000r·min-1离心35min得到浓缩的病毒颗粒；按照8倍体积比用水稀释病毒，以10-3浓度梯度分别感染293t细胞，每个梯度3个重复，35℃、置于体积为5%的co2培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·ml-1）=gfp阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01ml，计算病毒滴度；4）plentih1-mat2ashrna侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用plentih1-mat2a-shrna慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，当细胞中都有gfp表达时（说明病毒侵染效率较高），分别收集脂肪细胞的rna和蛋白，利用realtime-pcr和westernblot检测mat2a-shrna的干扰效率，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中mat2a-shrna1、mat2a-shrna2、mat2a-shrna3的mrna干扰效率分别是45％、70％和55％，收集mat2a-shrna2的干扰载体（mat2a-shrna2干扰效率最高，所以mat2a-shrna2为最佳干扰片段，即mat2a-shrnap）；5）干扰载体mat2a-shrna2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测：plentih1-mat2a-shrna侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化8天至成熟，油红o检测脂质积累情况，与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-mat2a处理组中显著降低，达48-52%，即为慢病毒介导的mat2a基因干扰显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质沉积的mat2a基因干扰载体。实施例3本发明一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a基因干扰载体的制备方法，包括以下步骤：（1）慢病毒mat2a干扰载体的构建：根据genbank中猪mat2a基因序列，利用invitrogen公司在线软件block-ittmrnaidesigner分别筛选3条shrna靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为mat2a-sh1、mat2a-sh2、mat2a-sh3、sh-scramble，与经过bamhi和xhoi(takara)双酶切后的plenti-h1载体连接，转化dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒mat2a干扰载体；（2）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装：将步骤（1）制备的慢病毒mat2a干扰载体转染到含有慢病毒载体的293t细胞的培养基中，对重组慢病毒plentih1-mat2ashrna包装，方法是：对细胞密度为95%的293t细胞置入新鲜的培养基中4h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.5gdmem干粉，胎牛血清10ml，0.22gnahco3，0.26ghepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：a液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒mat2a干扰载体+7.5μgδ8.9+5μgvsvg溶解在1.5ml无血清无双抗dmem培养基中，混匀，所述的无血清无双抗dmem培养基为每100mlpbs缓冲液中含0.6gdmem干粉，0.26gnahco3，0.3ghepes，混匀制得；b液，为溶解有脂质体的溶液：由40μlx-tremegenehpdna溶解在2ml无血清无双抗dmem培养基中，混匀制得；将a液和b液，分别室温静置6min，混合均匀，再室温静置22min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，30h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于2200rpm离心8min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液；（3）重组慢病毒plentih1-mat2ashrna滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒plentih1-mat2ashrna上清液过0.5μm滤膜，用120000r·min-1离心25min得到浓缩的病毒颗粒；按照12倍体积比用水稀释病毒，以10-5浓度梯度分别感染293t细胞，每个梯度3个重复，40℃、置于体积为5%的co2培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·ml-1）=gfp阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01ml，计算病毒滴度；4）plentih1-mat2ashrna侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用plentih1-mat2a-shrna慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，当细胞中都有gfp表达时（说明病毒侵染效率较高），分别收集脂肪细胞的rna和蛋白，利用realtime-pcr和westernblot检测mat2a-shrna的干扰效率，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中mat2a-shrna1、mat2a-shrna2、mat2a-shrna3的mrna干扰效率分别是45％、70％和55％，收集mat2a-shrna2的干扰载体（mat2a-shrna2干扰效率最高，所以mat2a-shrna2为最佳干扰片段，即mat2a-shrnap）；5）干扰载体mat2a-shrna2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测：plentih1-mat2a-shrna侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化8天至成熟，油红o检测脂质积累情况，与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-mat2a处理组中显著降低，达48-52%，即为慢病毒介导的mat2a基因干扰显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质沉积的mat2a基因干扰载体。本发明所述的降低猪肌内脂肪细胞脂质沉积的mat2a干扰方法易操作、特异、灵敏，稳定可靠，通过plentih1-mat2a-shrna慢病毒能显著降低脂肪细胞中mat2amrna和蛋白的表达水平，且脂肪细胞中脂质含量水平也明显下降，实现对猪肌内脂肪细胞脂质沉积的干扰作用，经济和社会效益显著，经过多次反复实验均取得了一致的结果，相关实验资料如下：实验1：mat2a重组慢病毒干扰载体的构建与鉴定利用invitrogen在线软件block-it™rnaidesigner(https：//www.rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)设计猪mat2a基因各3条shrna，并与无关序列的单链寡核苷酸序列一起在上海生工合成（表1）。经退火后形成双链dna，与经过bamhi和xhoi双酶切的lentih1载体连接，转化提取质粒后，将酶切鉴定成功的质粒送公司测序，确保插入载体的序列与设计合成的靶基因链完全一致。经鉴定，mat2a基因的shrna与无关序列的寡核苷酸均无突变，插入正确。表1猪mat2a的shrna序列参数table1designofshrnatargetingonporcinemat2agene实验2plentihl-mat2a慢病毒干扰载体的包装和滴度测定293t细胞生长密度为90%左右，并且状态良好时，采用x-tremegene-hpdna转染试剂与重组质粒以及包装质粒（cmv-δ8.9和cmv-vsvg）一起转染293t细胞，48h后观察绿色荧光蛋白(gfp)的表达情况。细胞状态良好，绿色荧光强度高，90%以上细胞表达绿色荧光蛋白；继续培养，分别于转染质粒48h和72h后收集病毒上清，并进行离心浓缩。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。病毒滴度结果分别为7.31×107pfu/ml，6.70×107pfu/ml和7.0×107pfu/ml，满足侵染原代脂肪细胞的实验要求。实验3：侵染猪肌内脂肪细胞的效果实验。用plentih1-mat2a-shrna慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，当细胞中都有较多的gfp表达时，说明病毒侵染效率较高；分别收集脂肪细胞的rna和蛋白，利用realtime-pcr和westernblot检测mat2a-shrna的干扰效率；实验表明，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中mat2a-shrna1、mat2a-shrna2、mat2a-shrna3的mrna干扰效率分别是45％、70％和55％左右，mat2a-shrna2干扰效率最高，所以mat2a-shrna2为最佳干扰片段（载体），即mat2a-shrnap。实验4：干扰mat2a对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的影响实验。用plentih1-mat2ashrna侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化至成熟，分化第8天后，油红o检测脂质积累情况。与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-mat2a处理组中显著降低，可达到50%左右。实验表明，慢病毒介导的mat2a基因干扰显著抑制了猪肌内脂肪细胞的脂质积累。实验5plentihl-mat2a/2bshrna侵染猪肌内前体脂肪细胞效果实验为检测所包装的慢病毒载体对猪原代脂肪细胞内mat2a基因的干扰效率。实验将病毒载体sh-scaramble（设为对照），sh-mat2a侵染猪肌内脂肪细胞，24h观察到绿色荧光蛋白的表达，但是侵染效率较低；72h后肌内脂肪细胞出现大面积的绿色荧光蛋白(gfp)。分别收集rna采用real-timeqpcr检测sh-mat2a的干扰情况，与sh-scramble对照相比，sh-mat2a-2干扰效果最佳，其干扰效率在70%以上，达到预期效果。为了进一步证明sh-mat2a是否对mat2a蛋白表达水平产生影响，采用westbolt实验及蛋白分析验证。干扰mat2a基因，mat2a蛋白表达水平降低40%左右，达到极显著水平；这些结果表明mat2a慢病毒干扰载体构建成功，可以进行后续实验。实验6干扰mat2a基因抑制猪肌内脂肪细胞脂质沉积实验猪肌内前体脂肪细胞侵染慢病毒携带的干扰片段sh-mat2a48h后（设转染无义序列sh-scramble为对照组），mdi培养基诱导分化至成熟。结果显示，与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-mat2a处理组中显著降低。吸光度定量分析结果显示，在mat2a基因缺失的猪肌内脂肪细胞中，脂滴聚积的能力显著低于对照组。实验清楚表明，本发明所述的降低猪肌内脂肪细胞脂质沉积的mat2a干扰方法简便、易操作、特异、灵敏，稳定可靠，通过plentih1-mat2a-shrna慢病毒能显著降低脂肪细胞中mat2amrna和蛋白的表达水平，且脂肪细胞中脂质含量水平也明显下降，可达50%左右，实现对猪肌内脂肪细胞脂质沉积的干扰作用，可有效用于制备对猪肌内脂肪细胞脂质沉积干扰的药物，开拓了治疗肝癌药物的新途径，经济和社会效益显著。序列表<110>信阳农林学院<120>一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积mat2a基因干扰载体的制备方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>510<212>mrna<213>susscrofamethionineadenosyltransferase2a(mat2a),mrna<400>1atgaacggacagctcaacggcttccacgacgccttcatcgaggagggcacgttcctcttc60acgtccgagtctgtaggggaaggccacccagataagatttgtgaccagatcagtgatgct120gtccttgatgcccaccttcagcaggaccctgatgccaaagtggcttgtgaaactgttgct180aaaactggaatgatccttcttgctggggaaattacatccagagctgctgttgactatcag240aaagtggttcgtgaaaccattaagcacataggatatgatgattcttccaaagggtttgac300tacaagacttgtaatgtgctagtggccttggagcagcagtcaccagatattgctcaaggt360gttcatcttgaccggaatgaggaagacattggtgcaggagaccagggtttgatgtttggt420tatgccactgatgaaactgaggaatgtatgcctttaaccattgtcttagcacacaagctc480aatgccaaactggctgaactacgccggaatggcactttgccttggttacgcccagattct540aaaactcaagtgactgtgcagtatatgcaggatcgaggtgctgtgcttcccatcagagtc600cacacaattgttatatctgttcagcatgatgaagaagtttgtcttgatgagatgagagat660gccctaaaggagaaagtcatcaaagcagttgtacctgcaaaatatcttgatgaggataca720atctatcatctacagccaagtggcagatttgttattggtgggcctcagggtgatgccggt780ttgactggtcggaaaatcattgtggacacttacggcggttggggagctcatggaggaggt840gccttttcaggaaaagattacaccaaggtggaccgttcagctgcttatgctgctcgttgg900gtggcaaaatcccttgttaaaggaggtctgtgcagaagggttcttgttcaggtctcttat960gctattggagtatctcatccattgtctatctccattttccattatggcacctctcagaag1020agtgagagagagctattagagattgtgaagaagaattttgacctccgccctggggtcatt1080gtcagggatctggatctgaagaagccaatttatcagaggactgcagcctatggccacttt1140ggtagggacagcttcccatgggaagtgcccaaaaagcttaagtattga1188当前第1页12当前第1页12