抗癌化合物的制作方法

本发明涉及从细菌直接或间接产生抗癌化合物，以及涉及新的抗癌化合物、包含其的药物组合物及其作为抗癌剂的用途。
背景技术：
：1949年，ueta报道了从甲虫青翅蚁形隐翅虫(paederusfuscipes)中分离出毒性组成部分(kyushuigakuzasshi，1949，249)。四年之后，pavan和bo也描述了来自相同甲虫物种的具有相同物理特性的物质(physiol.comp.oecol.1953，3，307)。这种被称作青腰虫素(pederin)的有毒化合物的结构在1965年由cadani及其同事首次提出(tetrahedronlett.1965，2537)，但在1968年由furusaki及其同事根据衍生物的晶体结构进行了修正。(tetrahedronlett.1968，6301)。青腰虫素的结构是：另外，cardani的研究小组报道了来自青翅蚁形隐翅虫的两种被称作拟青腰虫素(pseudopederin)和青腰虫酮(pederone)的另外的化合物的分离。两年之后描述了青腰虫酮(tetrahedronlett.1967，41，4023)。青腰虫素是有效的细胞毒剂和糜烂剂(vesicantagent)。brega及其同事(j.cellbiol.1968，485-496)已针对多种细胞系例如eue、e6d、hela、kb、hep、as、mef、ce、bhk、z1和m1测试了青腰虫素，并报道了在所有分析的细胞系中，3nm量级的浓度足以在4天内导致细胞死亡。另外，青腰虫素会导致蛋白质和dna合成的立刻损伤。soldati及其同事(experientia1966，3，176-178)也描述了拟青腰虫素的细胞毒性。拟青腰虫素的毒性低于青腰虫素，其在10倍高的剂量时具有活性。欧洲专利ep0289203公开了山海绵酰胺a(mycalamidea)(在新西兰收集的从山海绵属(mycalesp.)海绵中分离的化合物)的分离以及抗肿瘤和抗病毒活性。其发明人munro的研究小组进一步报道了来自相同来源的具有抗肿瘤和抗病毒活性的密切相关化合物山海绵酰胺b的分离(j.org.chem.1990，55，223)。他们还从stylinos海绵中分离出两种另外的山海绵酰胺(山海绵酰胺c和d)(j..nat.prod.2000，63，704)。山海绵酰胺a、b、c和d针对p-388鼠白血病细胞系的ic50值分别为3.0、0.7、95.0和35ng/ml。山海绵酰胺类也被证明是具有与临床药剂环孢菌素a相当的体外效力的强效免疫抑制剂。us4801606描述了在日本海岸附近收集的来自theonella属样品的奥那米德a(onnamidea)的分离。奥那米德a是抗肿瘤化合物，其针对鼠p388细胞系的ic50值为1ng/ml。其还具有抗病毒活性。奥那米德家族包含数个成员。其中三个(奥那米德d至f)缺少奥那米德a的二氧戊环。奥那米德d和e由matsunaga及其同事(tetrahedron，1992，48，8369)从theonella海绵中分离并且奥那米德f由capon研究小组从海绵trachycladuslaevispirulifer中收集(j.nat.prod.2001，64，640)。在浓度为0.4μg/ml下，奥那米德e针对p388细胞系没有显示出细胞毒活性，而奥那米德f被描述为有效的杀线虫剂。青腰虫素的细菌生物合成的实验证据由kellner首次提供，他报道了通过喂食青腰虫素阳性雌性卵可将产生青腰虫素的性状转移到非生产的隐翅虫属(paederusspp.)品系(chemoecology，2001，11，127)。相比之下，用抗生素处理的卵没有引起该效果。该结果表明存在能够定殖非生产者的产生青腰虫素的细菌(j.insect.physiol.，2001，47，475)。piel及其同事分离了青腰虫素(proc.natl.acad.sci.u.s.a.，2002，99，14002和wo2003044186)和奥那米德(proc.natl.acad.sci.u.s.a.，2004，101，16222)的聚酮化合物合酶(polyketidesynthase，pks)的基因簇。该工作强烈暗示细菌共生体(symbiont)是这些化合物的真正来源，其为从不同生物中分离结构相似的化合物提供了解释。用于有关共生体提议的综述参见piel，j.，curr.med.chem.2006，13，39。另一种密切相关的化合物diaphorin由nakabachi及其同事(currentbiology2013，23(15)，1478-1484)从昆虫柑桔木虱(diaphorinacitri)中分离。该化合物也具有细胞毒性，其针对b104和hela细胞的ic50值分别为约1μm至约2μm。通过对候选种(candidatus)profftellaarmatura(与柑桔木虱相关的防御性细菌共生体)的聚酮化合物合酶(pks)系统的分析，在同一出版物中预测了其在柑桔木虱提取物中的存在。另一方面，专利申请wo2013016120描述了青腰虫素以及下式的其类似物的全合成：其中r1或r2中的至少一个包括接头，所述接头包括可与靶向部分结合的反应性官能团。该全合成基于多组分酰胺缩醛结构。来自天然来源的这些化合物的稀缺性阻碍了对青腰虫素、山海绵酰胺和奥那米德的药理学特性的详细研究。例如，需要约100kg的青翅蚁形隐翅虫以分离出用来阐明青腰虫素结构的足够的材料。尽管已描述了青腰虫素和奥那米德的pks系统，但尚无可能通过生物技术方法获得这些化合物。因此，目前获得这些感兴趣化合物的唯一实用方法是全合成。已报道了许多青腰虫素和山海绵酰胺的总合成。最近其由witezak及其同事(minirev.med.chem.2012，12(14)，1520-1532)以及由floreancig和mosey(nat.prod.rep.2012，29，980)进行了综述。这些合成导致了足够短以递送足够的材料用于生物学测试的路线，并提供了已用于开发针对这些化合物的结构-活性关系的类似物。然而，仍然需要为这些化合物及其新的抗肿瘤类似物提供更简洁的途径。技术实现要素：在第一方面，本发明涉及通式i的化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体其中：r1、r2和r3各自独立地选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、-c(＝o)ra、-c(＝o)orb和-(c＝o)nrcrd；r4选自氢、-c(＝o)ra、-c(＝o)orb和-c(＝o)nrcrd；ra选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、芳基和杂环基；rb选自经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、芳基和杂环基；rc和rd独立地选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、芳基和杂环基；前提是r1和r2不同时为甲基。在第二方面，本发明涉及药物组合物，其包含式i化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，以及可药用载体或稀释剂。在第三方面，本发明涉及式i化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，其用作药物、特别是用作用于治疗癌症的药物。在第四方面，本发明涉及包含式i化合物的药物组合物，其用作药物、特别是用作用于治疗癌症的药物。在第五方面，本发明还涉及式i化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体在治疗癌症或在制备药物、优选用于治疗癌症的药物中的用途。本发明的另一些方面是治疗方法，以及用于这些方法的化合物。因此，本发明进一步提供了治疗患者、特别是受癌症影响的人的方法，其包括向有此需要的所述受影响个体施用治疗有效量的如上所限定的化合物。在第六方面，本发明涉及用于获得式ii化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体的方法其中r1、r2和r3各自独立地选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、-c(＝o)ra、-c(＝o)orb和-(c＝o)nrcrd；r4选自氢、-c(＝o)ra、-c(＝o)orb和-c(＝o)nrcrd；ra选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、芳基和杂环基；rb选自经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、芳基和杂环基；rc和rd独立地选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、芳基和杂环基；该方法包括以下步骤：-在合适的条件下培养野生型海洋细菌菌株phm005或其突变体以产生下式的化合物1和/或2：-分离化合物1或2；以及，如果需要的话，-衍生化合物1或2。在第七方面，本发明涉及菌株phm005。化合物1和2的自由生活的海洋α变形菌(alphaproteobacteria)生产者已在cect保藏中为了专利目的保藏，代码为cect-9225。在第八方面，本发明提供了分离的核酸序列，其包含lab生物合成基因簇或与包含lab生物合成基因簇的序列互补。该基因簇代表来自编码青腰虫素样和奥那米德样化合物之生物合成的可培养细菌的基因的第一个实例。在第九方面，本发明提供了选自以下基因的核酸片段：lab706、lab707、lab708、lab709、lab710、lab711、lab712、lab713、lab714、lab715、lab716、lab717、lab718、lab719、lab720、lab721、lab722、lab723、lab724、lab725和/或lab726，如图3中所示。在第十方面，本发明涉及由如上所述的核酸序列编码的模块化酶促系统(modularenzymaticsystem)。模块化酶促系统优选在青腰虫素样和奥那米德样化合物和/或聚酮化合物部分和/或非核糖体肽部分的生物合成中具有功能活性。在第十一方面，本发明涉及包含基本上由来源于拉布伦茨氏菌属(labrenziasp.)并且特别地来自菌株phm005的lab生物合成基因簇组成的核酸的载体或包含如上所述的核酸序列的载体。在第十二方面，本发明涉及包含所述核酸或包含所述载体的重组宿主细胞或转基因生物。在第十三方面，本发明涉及用于使用如上所述的phm005突变体或重组宿主细胞或转基因生物来产生青腰虫素样或奥那米德样化合物的方法，其包括以下步骤：-在表达lab生物合成基因簇的条件下培养phm005突变体或重组宿主细胞或转基因生物；以及-分离产生的青腰虫素样或奥那米德样化合物。本发明的另一些方面涉及如上所限定的核酸在制备经修饰lab生物合成基因簇中的用途、涉及如上所限定的核酸在制备青腰虫素样或奥那米德样化合物中的用途以及涉及用于改善在细菌中产生青腰虫素样和奥那米德样化合物的方法，其包括以下步骤：a)在诱变剂存在下培养菌株phm005一段足以使得诱变的时间，以及b)通过改变引起青腰虫素样或奥那米德样化合物产量增加的表型来选择所述突变体。诱变剂可以例如是化学试剂，例如柔红霉素和亚硝基胍；物理试剂，例如γ辐射或紫外线辐射；或生物制剂，例如转座子。示例性修饰包括敲除剪裁基因以避免甲基化和羟基化。附图和序列简述图1.拉布伦茨氏菌属phm005的电子显微术(负染色)。将处于指数生长中期的细胞吸附在400目碳-火棉胶涂覆的网格上2分钟，用2％乙酸铀酰进行负染色，用在100kv下操作的jeoljem1011透射电子显微镜成像并用ccdgatanerlangshenes1000w照相机拍摄。图2.基于16srrna基因序列的邻位相连树(neighbour-joiningtree)，其显示了phm005与拉布伦茨氏菌属和斯塔普氏菌(stappia)属密切相关物种类型菌株之间的关系。使用bionumericsv7.5(appliedmaths)，通过基于成对比对的相似系数和upgma进行聚类分析，生成系统发生树。通过与silvaltps123数据库进行比较鉴定了系统发生的近邻，并计算出成对的16srdna基因序列相似性。图3.lab生物合成基因簇的映射。总lab基因簇岛：69kb。图4.cdcl3中的化合物1的1hnmr谱。图5.cdcl3中的化合物1的13cnmr谱。图6.cdcl3中的化合物1的gcosy谱。图7.cdcl3中的化合物1的tocsy谱。图8.cdcl3中的化合物1的ghsqc谱。图9.cdcl3中的化合物1的lr-hsqmbc谱。图10.cdcl3中的化合物1的roesy谱。本申请中提到的序列列于所附序列表中。以下简要总结了这些序列：seqidno：1拉布伦茨氏菌属phm005的16srrna基因的序列(1355bp)。seqidno：2lab生物合成基因簇的核酸序列。seqidno：3lab706(推定的酰基载体蛋白)的蛋白质序列。seqidno：4lab707(推定的hmgs)的蛋白质序列。seqidno：5lab708(pks)的蛋白质序列。seqidno：6lab709(transatpks)的蛋白质序列。seqidno：7lab710(推定的酰基载体蛋白)的蛋白质序列。seqidno：8lab711(推定的fad加氧酶)的蛋白质序列。seqidno：9lab712(推定的o甲基转移酶)的蛋白质序列。seqidno：10lab713(推定的细胞色素p450)的蛋白质序列。seqidno：11lab714(推定的丙二酰coa-acp转酰基酶或fmt氧化还原酶)的蛋白质序列。seqidno：12lab715(推定的丙二酰coa-acp转酰基酶或酰基转移酶)的蛋白质序列。seqidno：13lab716(丙二酰coa-acp转酰基酶)的蛋白质序列。seqidno：14lab717(烯酰-coa水合酶)的蛋白质序列。seqidno：15lab718(β-酮脂酰合成酶)的蛋白质序列。seqidno：16lab719(transatpks/nrps)的蛋白质序列。seqidno：17lab720(推定的fad单加氧酶)的蛋白质序列。seqidno：18lab721的蛋白质序列，其是transatpks的一部分。seqidno：19lab722的蛋白质序列，其是transatpks的一部分。seqidno：20lab723的蛋白质序列，其是pks的一部分。seqidno：21lab724的蛋白质序列，其是transatpks/nrps的一部分。seqidno：22lab725的蛋白质序列，其是pks的一部分。seqidno：23lab726(推定的o甲基转移酶)的蛋白质序列。具体实施方式本发明涉及如上所限定的通式i的化合物。在本说明书中由马库什式所限定的化合物中，可根据以下指导选择基团：烷基可以是支链或非支链的，并且优选具有1至约12个碳原子。一类更优选的烷基具有1至约6个碳原子。甚至更优选的是具有1、2、3或4个碳原子的烷基。在本发明化合物中，甲基、乙基、正丙基、异丙基和丁基(包括正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基)是特别优选的烷基。除非另有说明，本文中使用的术语烷基是指环状和非环状基团二者，尽管环状基团将包含至少三个碳环成员。本发明化合物中的烯基和炔基可以是支链或非支链的，具有一个或更多个不饱和键和2至约12个碳原子。一类更优选的烯基和炔基具有2至约6个碳原子。甚至更优选的是具有2、3或4个碳原子的烯基和炔基。本文中使用的术语烯基和炔基是指环状和非环状基团二者，尽管环状基团将包含至少三个碳环原子。本发明化合物中合适的芳基包括单环和多环化合物，包括包含单独的和/或稠合的芳基的多环化合物。典型的芳基包含1至3个单独的或稠合的环和6至约18个碳环原子。优选芳基包含6至约14个碳环原子。特别优选的芳基包含经取代或未经取代的苯基、经取代或未经取代的萘基、经取代或未经取代的联苯基、经取代或未经取代的菲基和经取代或未经取代的蒽基。最优选的芳基是经取代或未经取代的苯基。合适的杂环基团包含含有1至3个单独的和/或稠合的环和5至约18个环原子的杂芳基和杂脂环基。优选的杂芳基和杂脂环基包含5至约10个环原子，更优选5、6或7个环原子。本发明化合物中合适的杂芳基包含一个、两个或三个选自n、o或s原子的杂原子，并且包含例如香豆素基(包括8-香豆素基)、喹啉基(包括8-喹啉基、异喹啉基)、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异唑基、唑基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、二唑基、噻二唑基、呋咱基、哒嗪基、三嗪基、噌啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃吡啶基。本发明化合物中合适的杂脂环基包含一个、两个或三个选自n、o或s原子的杂原子，并且包括例如吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻烷基(thioxanyl)、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、oxepanyl、thiepanyl、氧杂氮杂环庚烯基、二氮杂环庚烯基、硫代氮杂环庚烯基、1，2，3，6-tetrahydropyridil、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2h-吡喃基、4h-吡喃基、二烷基、1，3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫代丙基(dithioanyl)、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡咯烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、3h-吲哚基和喹嗪基。上述基团可在一个或更多个可用位置被例如以下的一个或更多个合适的基团取代：or’、＝o、sr’、sor’、so2r’、oso2r’、no2、nhr’、nr’r’、＝n-r’、n(r’)cor’、n(cor’)2、n(r’)so2r、n(r’)c(＝nr’)n(r’)r’、cn、卤素、cor’coor’、ocor’、ocoor’、oconhr’、ocon(r’)r’、con(r’)r’、con(r’)or’、con(r’)so2r’、po(or’)2、po(or’)r’、po(or’)(n(r’)r’)、被保护的oh、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂环基，其中每个r’基团独立地选自氢、oh、no2、nh2、sh、cn、卤素、coh、co烷基、cooh、经取代或未经取代的c1-c12烷基、经取代或未经取代的c2-c12烯基、经取代或未经取代的c2-c12炔基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂环基。当这样的基团本身被取代时，取代基可从前述列表中选择。本发明化合物中合适的卤素基团或取代基包括f、cl、br和i。合适的oh的保护基(包括1，2-二醇的保护基)对于本领域技术人员来说是公知的。wuts，pgm和greenetw在protectinggroupsinorganicsynthesis第四版编辑wiley-interscience，以及kocienskipj在protectinggroups，第三版编辑georgthiemeverlag中提供了有机化学中保护基的一般性综述。这些参考文献提供了有关oh的保护基的章节。所有这些参考文献都通过引用整体并入。在本发明的范围内，oh保护基被限定为通过形成合适的受保护的oh基团来保护oh基团而产生的o-键合的部分。这样的受保护的oh的一些实例包括醚、甲硅烷基醚、酯、磺酸盐、次磺酸盐和亚磺酸盐、碳酸盐和氨基甲酸盐。在醚的情况下，oh的保护基可选自：甲基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基、苄氧基甲基、对甲氧基苄氧基甲基、[(3，4-二甲氧基苄基)氧基]甲基、对硝基苄氧基甲基、邻硝基苄氧基甲基、[(r)-1-(2-硝基苯基)乙氧基]甲基、(4-甲氧基苯氧基)甲基、愈创木酚甲基、[(对苯基苯基)-氧基]甲基、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-氰基乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2，2，2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基甲基、薄荷氧基甲基、邻双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基、四氢吡喃基、氟化四氢吡喃基、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基s，s-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基、1-(4-氯苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基、1，4-二烷-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢-7，8，8-三甲基-4，7-亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-羟乙基、2-溴乙基、1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、1-甲基-1-苯氧基乙基、2，2，2-三氯乙基、1，1-二茴香基-2，2，2-三氯乙基、1，1，1，3，3，3-六氟-2-苯基异丙基、1-(2-氰基乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苄硫基)乙基、2-(苯基硒基)乙基、叔丁基、环己基、1-甲基-1’-环丙基甲基、烯丙基、异戊烯基、肉桂基、2-苯基烯丙基、炔丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、2，4-二硝基苯基、2，3，5，6-四氟-4-(三氟甲基)苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、2，6-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、戊二烯基硝基苄基、戊二烯基硝基胡椒基、卤代苄基、2，6-二氯苄基、2，4-二氯苄基、2，6-二氟苄基、对氰基苄基、氟苄基、4-氟化烷氧基苄基、三甲基甲硅烷基二甲苯基、对苯基苄基、2-苯基-2-丙基、对酰基氨基苄基、对叠氮基苄基、4-叠氮基-3-氯苄基、2-三氟甲基苄基、4-三氟甲基苄基、对(甲基亚磺酰基)苄基、p-siletanylbenzyl、4-乙酰氧基苄基、4-(2-三甲基甲硅烷基)乙氧基甲氧基苄基、2-萘基甲基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基n-氧化物、2-喹啉基甲基、6-甲氧基-2-(4-甲基苯基-4-喹啉甲基)、1-芘基甲基、二苯基甲基、4-甲氧基二苯基甲基、4-苯基二苯基甲基、p，p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚烯酮基、三苯基甲基、三(4-叔丁基苯基)甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯酰基氧基)苯基二苯基甲基、4，4’，4”-三(4，5-二氯邻苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4，4’4”-三(乙酰丙酰氧基苯基)甲基、4，4’，4”-三(苯甲酰氧基苯基)甲基、4，4’-二甲氧基-3”-[n-(咪唑基甲基)]三苯甲基、4，4’-二甲氧基-3”-[n-(咪唑基乙基)氨基甲酰基]三苯甲基、双(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、4-(17-四苯并[a，c，g，i]芴基甲基)-4，4”-二甲氧基三苯甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1，3-苯并二硫戊烷-2-基和4，5-双(乙氧基羰基)-[1，3]-二氧戊环-2-基、苯并异噻唑基s，s-二氧化物。在甲硅烷基醚的情况下，oh的保护基可选自：三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、2-降冰片基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二叔丁基甲基甲硅烷基、双-(叔丁基)-1-芘基甲氧基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、(2-羟基苯乙烯基)二甲基甲硅烷基、(2-羟基苯乙烯基)二异丙基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、叔丁氧基二苯基甲硅烷基、1，1，3，3-四异丙基-3-[2-(三苯基甲氧基)乙氧基]二硅氧烷-1-基和氟甲硅烷基。在酯的情况下、oh的保护基与其所连接的未保护的oh的氧原子一起形成酯，所述酯可选自：甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氯乙酰胺、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、苯乙酸酯、二苯基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、双氟链式丙酰基、4-戊烯酸酯、4-氧代戊酸酯、4，4-(亚乙基二硫代)戊酸酯、5-[3-双(4-甲氧基苯基)羟基甲基苯氧基]乙酰丙酸酯、新戊酸酯、1-金刚烷酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯、4-溴苯甲酸酯、2，5-二氟苯甲酸酯、对硝基苯甲酸酯、吡啶甲酸酯、烟酸酯、2-(叠氮基甲基)苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、(2-叠氮基甲基)苯基乙酸酯、2-{[三苯甲基硫代]氧基]甲基}苯甲酸酯、2-{[(4-甲氧基三苯甲基硫代)氧基]甲基}苯甲酸酯、2-{[甲基(三苯甲基硫代)氨基]甲基}苯甲酸酯、2-{{[(4-甲氧基三苯甲基)硫代]甲基氨基]-甲基}苯甲酸酯、2-(烯丙氧基)苯基乙酸酯、2-(异戊烯基氧基甲基)苯甲酸酯、6-(乙酰丙酰氧基甲基)-3-甲氧基-2-硝基苯甲酸酯、6-(乙酰丙酰氧基甲基)-3-甲氧基-4-硝基苯甲酸酯、4-苄氧基丁酸酯、4-三烷基甲硅烷氧基丁酸酯、4-乙酰氧基-2，2-二甲基丁酸酯、2，2-二甲基-4-戊烯酸酯、2-碘苯甲酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、4-(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯、2-(氯乙酰氧基甲基)苯甲酸酯、2-[(2-氯乙酰氧基)乙基]苯甲酸酯、2-[2-苄氧基)乙基]苯甲酸酯、2-[2-(4-甲氧基苄氧基)乙基]苯甲酸酯、2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-双(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯代二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯(monosuccinoate)、(e)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基n，n，n’，n’-四甲基磷二酰胺、和2-氯苯甲酸酯。在磺酸酯、次磺酸酯和亚磺酸酯的情况下，oh的保护基与其所连接的未保护的oh的氧原子一起形成磺酸酯、次磺酸酯或亚磺酸酯，所述磺酸酯、次磺酸酯或亚磺酸酯可选自：硫酸酯、烯丙基磺酸酯、甲烷磺酸酯、苄基磺酸酯、甲苯磺酸酯、2-[(4-硝基苯基)乙基]磺酸酯、2-三氟甲基苯磺酸酯、4-单甲氧基三苯甲基次磺酸酯、烷基2，4-二硝基苯基次磺酸酯、2，2，5，5-四甲基吡咯烷-3-酮-1-亚磺酸盐和二甲基硫膦基(dimethylphosphinothiolyl)。在碳酸酯的情况下，oh的保护基与其所连接的未保护的oh的氧原子一起形成碳酸酯，所述碳酸酯可选自：碳酸甲酯、碳酸甲氧基甲酯、碳酸9-芴基甲酯、碳酸乙酯、碳酸溴乙酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基碳酸酯、2，2，2-三氯乙基碳酸酯、1，1-二甲基-2，2，2-三氯乙基碳酸酯、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯、2-[二甲基(2-萘基甲基)甲硅烷基]乙基碳酸酯、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯、2-(三苯基膦基)乙基碳酸酯、顺式-[4-[[(甲氧基三苯甲基)硫基]氧基]四氢呋喃-3-基]氧基碳酸酯、碳酸异丁酯、碳酸叔丁酯、碳酸乙烯酯、碳酸烯丙酯、碳酸肉桂酯、碳酸炔丙酯、碳酸对氯苯酯、对硝基苯基碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、6-溴-7-羟基香豆素-4-基甲基碳酸酯、苄基碳酸酯、邻硝基苄基碳酸酯、对硝基苄基碳酸酯、对甲氧基苄基碳酸酯、3，4-二甲氧基苄基碳酸酯、蒽醌-2-基甲基碳酸酯、2-丹磺酰基乙基碳酸酯、2-(4-硝基苯基)乙基碳酸酯、2-(2，4-二硝基苯基)乙基碳酸酯、2-(2-硝基苯基)丙基碳酸酯、烷基2-(3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基)丙基碳酸酯、2-氰基-1-苯基乙基碳酸酯、2-(2-吡啶基氨基-1-苯基乙基碳酸酯、2-[n-甲基-n-(2-吡啶基)]氨基-1-苯基乙基碳酸酯、苯甲酰甲基碳酸酯、3’，5’二甲氧基安息香碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯和s-苄基硫代碳酸酯。并且在氨基甲酸酯的情况下，oh的保护基与其所连接的未保护的oh的氧原子一起形成氨基甲酸酯，所述氨基甲酸酯可选自：二甲基硫代氨基甲酸酯、n-苯基氨基甲酸酯和n-甲基-n-(邻硝基苯基)氨基甲酸酯。在本发明的范围内，1，2-二醇保护基被限定为通过形成受保护的1，2-二醇同时保护1，2-二醇而产生的o-键合的部分。这样的受保护的1，2-二醇的实例包括：环状缩醛和缩酮、环状原酸酯、甲硅烷基衍生物、二烷基亚甲硅基衍生物、环状碳酸酯、环状硼酸酯。环状缩醛和缩酮的实例包括：亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、叔丁基亚甲基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、2-(甲氧基羰基)亚乙基(mocdene)缩醛或2-(叔丁基羰基)亚乙基(bocdene)缩醛、苯基磺酰基亚乙基缩醛、2，2，2-三氯亚乙基缩醛、3-(苄氧基)丙基缩醛、丙烯醛缩醛、丙酮化合物(异亚丙基缩酮)、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、1-(4-甲氧基苯基)亚乙基缩酮、2，4-二甲氧基亚苄基缩醛、3，4-二甲氧基亚苄基缩醛、对乙酰氧基亚苄基缩醛、4-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)亚苄基缩醛、2-硝基苄基缩醛、4-硝基亚苄基缩醛、均三甲苯缩醛、6-溴-7-羟基香豆素-2-基亚甲基缩醛、1-萘甲醛缩醛、2-萘甲醛缩醛、9-蒽缩醛、二苯甲酮缩酮、二(对茴香基)亚甲基缩醛、呫吨-9-亚基缩酮、2，7-二甲基呫吨-9-亚基缩酮、二苯基亚甲基缩酮、樟脑缩酮和薄荷酮缩酮。环状原酸酯的实例包括：甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、2-氧基亚环戊基原酸酯、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、苯酞原酸酯、1，2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(n，n-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(n，n-二甲基氨基)亚苄基衍生物、丁烷2-3-双缩醛(butane2-3-bisacetal，bba)、环己烷-1，2-二缩醛(cyclohexane-1，2-diacetal，cda)和二螺环缩酮。甲硅烷基衍生物的实例包括：二叔丁基亚甲硅烷基(dtbs(or)2)、1-(环己基)-1-(甲基)亚甲硅烷基(cy)(me)si(or)2、二异丙基亚甲硅烷基(异丙基)2si(or)2、二环己基亚甲硅烷基(cy)2si(or)2、1，3-(1，1，3，3-四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(tipds(or)2)、1，1，3，3-四叔丁氧基二亚硅氧烷基衍生物(tbds(or)2)、亚甲基双(二异丙基亚硅烷醇基)(mdps(or)2)和1，1，4，4-四苯基-1，4-二亚硅烷基(siba(or)2)。环状硼酸酯的实例包括：硼酸甲酯、硼酸乙酯、硼酸苯酯和邻乙酰氨基苯基硼酸酯。对这些基团的提及不应被解释为对本发明范围的限制，因为其仅是被提及为oh的保护基的举例说明，但是具有所述功能的其他基团可以是本领域技术人员已知的，并且其应被理解为也涵盖在本发明中。术语“可药用盐”是指任何可药用盐，在向患者施用之后其能够提供(直接地或间接地)如本文中所述的化合物。然而，应当理解，非可药用盐也在本发明的范围内，因为其可用于制备可药用盐。盐的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，本文中提供的化合物的可药用盐是通过常规化学方法由包含碱性或酸性部分的母体化合物合成的。通常，这样的盐是例如通过使游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的量的合适碱或酸在水中或在有机溶剂中或在二者的混合物中反应来制备。通常，非水性介质例如醚、乙酸乙酯、乙醇、2-丙醇或乙腈是优选的。酸加成盐的实例包括矿物酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐；以及有机酸加成盐，例如乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐，例如钠、钾、钙和铵盐；以及有机碱盐，例如乙二胺、乙醇胺、n，n-二烯基乙醇胺、三乙醇胺和碱性氨基酸盐。本发明的化合物可以是作为游离化合物或作为溶剂合物(例如水合物、醇化物、特别是甲醇化物)的结晶或无定形形式，并且这些形式中的任一种都旨在在本发明的范围内。溶剂化方法是本领域公知的。本发明的化合物可呈现不同的多晶型形式，并且本发明旨在涵盖所有这样的形式。本文中提到的任何化合物旨在表示这样的特定化合物以及某些变体或形式。特别地，本文中提到的化合物可具有不对称中心，并因此以不同的对映体或非对映体形式存在。因此，本文中提到的任何给定化合物旨在表示外消旋体、一种或更多种对映体形式、一种或更多种非对映体形式，及其混合物中的任何一种。同样，关于双键的立体异构化或几何异构化也是可能的，因此在某些情况下，分子可以以(e)-异构体或(z)-异构体(反式和顺式异构体)存在。如果分子包含数个双键，则每个双键将具有其自身的立体异构，其可以与分子的其他双键的立体异构相同或不同。此外，本文中提到的化合物可以以阻转异构体存在。本文中提到的化合物的所有立体异构体，包括对映异构体、非对映异构体、几何异构体和阻转异构体，及其混合物，都被认为是在本发明的范围内。此外，本文中提到的任何化合物可以以互变异构体存在。具体地，术语互变异构体是指化合物的两种或更多种结构异构体中的一种，所述互变异构体平衡存在并且易于从一种异构形式转化为另一种异构形式。常见的互变异构对是胺-亚胺、酰胺-亚胺酸、酮-烯醇、内酰胺-内酰亚胺等。除非另有说明，否则本发明化合物还意指包括同位素标记的形式，即仅在一个或更多个富含同位素的原子存在下不同的化合物。例如，除了用氘或氚替换至少一个氢原子，或用富含13c-或14c的碳替换至少一个碳原子，或用富含15n的氮替换至少一个氮原子之外，具有本发明结构的化合物都在本发明的范围内。为了提供更简洁的描述，本文中给出的一些定量表达不具有术语“约”。应理解为，无论是明确使用还是不使用术语“约”，本文中给出的每个量都意指实际的给定值，并且其还意指这样的给定值基于本领域普通技术人员可合理推断的近似值，包括由于由对这样的给定值的实验条件和/或测量条件而导出的等同和近似值。更特别地，一些优选的式i化合物是那些也具有通式iii的化合物或其可药用盐、互变异构体和立体异构体其中r1、r2、r3和r4如以上在通式i中所限定的。在通式i和iii的化合物中，特别优选的r1选自氢和经取代或未经取代的c1-c12烷基。更优选地，r1选自氢和经取代或未经取代的c1-c6烷基。甚至更优选地，r1选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基。最优选的r1是氢和甲基。在通式i和iii的化合物中，特别优选的r2选自氢和-c(＝o)ra，其中ra是经取代或未经取代的c1-c12烷基。更优选的ra是经取代或未经取代的c1-c6烷基。甚至更优选ra选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基。最优选的r2是氢和乙酰基。在通式i和iii的化合物中，特别优选的r3和r4独立地选自氢和-c(＝o)ra，其中在每次出现时ra独立地选自经取代或未经取代的c1-c12烷基。更优选地，在每次出现时ra独立地选自经取代或未经取代的c1-c6烷基。甚至更优选地，在每次出现时ra独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基。最优选r3和r4独立地选自氢和乙酰基。在另外的优选实施方案中，组合了上述不同取代基的优选方案。本发明还涉及上述通式i和iii中的优选取代基的这样的组合。在一个实施方案中，r1选自经取代或未经取代的c1-c6烷基并且r2为氢。在另一个实施方案中，r1选自经取代或未经取代的c1-c6烷基并且r2为-c(＝o)ra，其中ra为经取代或未经取代的c1-c12烷基。在另一个实施方案中，r1和r2二者都为氢。在本说明书和定义中，当存在本发明化合物中存在的数个基团ra、rb、rc、rd或r’时，除非明确说明，否则应理解其可在给定的定义内各自独立地不同，即ra在本发明的给定化合物中不一定同时代表同一基团。一些特别优选的本发明化合物为以下或其可药用盐、互变异构体或立体异构体。最优选的本发明化合物为以下：或其可药用盐、互变异构体或立体异构体。化合物1和2从被称作菌株phm005的拉布伦茨氏菌属中分离。该α变形菌从在印度洋收集的海洋沉积物样品中分离。通过允许用单个、副极地插入的鞭毛鉴定活动杆(motilerod)(0.6至0.8μm宽，1.6至2.1μm长)的透射电子显微术观察细胞(图1)。该菌株的培养物已保藏在西班牙巴伦西亚大学的cect(西班牙典型培养物保藏中心，“coleccióndecultivostipo”)中，保藏号为cect-9225。该保藏是根据布达佩斯条约的规定进行的。细菌显然是海盐依赖性的，因为其需要多于2.5％的nacl来生长，用于产生1的最佳海盐浓度为36g/l，与海洋条件类似。marineagar2216(difco)上的菌落呈米黄色、几乎透明、光滑和具全缘。三周之后，菌落变为深褐色，可能是由于细菌叶绿素a和类胡萝卜素产生的影响，如沟鞭藻拉布伦茨氏菌(labrenziaalexandrii)dfl-11t(biebl及其同事，evol，microbiol，2007，57，1095-1107)所述。为了分离生产者微生物，所有操作都在无菌条件下进行。phm005从直接涂布在具有海盐培养基的petri培养皿上的沉积物冷冻样品中分离，所述海盐培养基具有下列组成(g/l)：海盐(tropicpro-reef，27；琼脂，16；补充有放线菌酮0.2mg/ml。将平在大气压下在28℃下孵育3周。在此时段之后，挑取微棕色的菌落并转移至相同的海盐培养基以确认纯度并开始分类和发酵研究。按照标准操作，通过16srrna的部分序列进行phm005的分类评价。将phm005在海洋液体培养基(difco1196)中生长72小时。回收细胞并通过用4％np40煮沸10分钟来裂解。通过离心弃去细胞碎片。使用cook和myers描述的细菌引物f1和r5(internationaljournalofsystematicsandevolutionarymicrobiology，2003，53，1907-1915)通过聚合酶链式反应扩增16srrna。获得的几乎全长的16srrna基因序列示于seqno：1中。使用bionumericsv7.5进行聚类分析，通过基于成对比对的相似系数和upgma进行聚类分析，生成系统发生树。通过与silvaltps123数据库进行比较鉴定了系统发生的近邻，并计算出成对的16srrna基因序列相似性。系统发生树示于图2中。当phm005在受控条件下在合适的培养基中培养时，其产生化合物1和2。该菌株显然需要海盐来生长。该菌株优选在常规的含水营养培养基中生长。培养必须在有氧条件下驱动，并且化合物1和2的产生应在生长控制温度在26至28℃之间于3天之后开始。已发现常规发酵罐非常适合于进行该生物的培养。可能需要在发酵的不同阶段期间添加营养物和ph控制以及消泡剂以提高产量并避免起泡。本发明化合物可从菌株phm005的菌落或冷冻纯培养物开始产生，以用于产生足够的生物质。该步骤可根据需要重复数次，并且收集的材料将被用作接种物，以接种具有合适的培养基的一个或数个发酵瓶或罐。根据所需的液体培养基的体积，这些瓶或罐可用于培养接种物或用于生产阶段。有时，生产培养基可能与用于接种物培养的培养基不同。本发明的化合物可主要从细胞和菌株phm005的上清液中通过用合适的溶剂混合物提取或在适当的树脂中吸收而从发酵液中分离。可使用常规色谱技术的适当组合进行从粗活性提取物中本发明的分离和纯化。另外，本发明的化合物可通过修饰已经从天然来源获得的那些化合物或通过使用多种化学反应进一步修饰已经修饰的那些化合物来获得。因此，羟基可通过标准偶联或酰化程序酰化，例如通过在吡啶等中使用乙酰氯或乙酸酐。甲酸酯基团可通过使相应的烷氧基化物与乙酸甲酸酐反应来获得。氨基甲酸酯可通过加热具有异氰酸酯的羟基前体来获得。碳酸酯可通过使用相应的酸酐和活化剂例如mg(clo4)2或zn(oac)2来获得。羟基也可通过使用烷基溴化物碘化物或磺酸盐进行烷基化而转化为烷氧基，或者通过使用例如受保护的2-溴乙胺而转化为氨基低级烷氧基。必要时，可在取代基上使用适当的保护基，以确保反应性基团不受影响并确保羟基的所有选择性官能化。制备这些衍生物所需的程序和试剂是本领域技术人员已知的，并且可在一般教科书例如march’sadvancedorganicchemistry，第7版，2013，wileyinterscience中找到。上述式i和iii化合物的一个重要特征是其生物活性并且特别地其针对肿瘤细胞的细胞毒活性。因此，通过本发明，我们提供了具有细胞毒性活性之通式i和iii的化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体的药物组合物及其作为抗癌剂的用途。本发明进一步提供了药物组合物，其包含通式i和iii的化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体，以及可药用载体或稀释剂。药物组合物的实例包括用于经口、表面或肠胃外施用的任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、用于小瓶的粉末等)或液体(溶液剂、混悬剂或乳剂)组合物。施用本发明化合物或组合物可通过任何合适的方法，例如静脉内输注、经口制剂以及腹膜内和静脉内施用。我们优选使用长至24小时的输注时间，更优选1至12小时，最优选1至6小时。允许在不住院过夜的情况下进行治疗的短输注时间是特别期望的。然而，如果需要的话，输注可为12至24小时或甚至更长。输注可在合适的间隔下进行，例如1至4周。包含本发明化合物的药物组合物可通过脂质体或纳米球包封、以持续释放制剂或通过其他标准递送方式递送。化合物的正确剂量将根据具体的制剂、应用方式、特定状态、所治疗的宿主和肿瘤而变化。应考虑其他因素，例如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度。施用可在最大耐受剂量内连续或定期进行。本文中使用的术语“治疗”及其变化形式包括根除、切除、修饰或控制肿瘤或原发性、区域性或转移性癌细胞或组织，以及使癌症的扩散延迟最小化。本发明化合物对数种癌症类型具有抗癌活性，所述癌症类型包括但不限于肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌。因此，在本发明的一些替代实施方案中，包含如上所限定的式i和iii化合物的药物组合物用于治疗肺癌、结肠癌、乳腺癌或胰腺癌。在第六方面，本发明涉及用于产生式ii化合物的方法。根据本发明该方面的一些优选方法是产生也具有式iv化合物或其可药用盐、互变异构体或立体异构体的方法其中r1、r2、r3和r4如以上在通式ii中所限定的。在用于合成式ii和iv化合物的方法中，特别优选的r1选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、和-c(＝o)ra，其中ra是经取代或未经取代的c1-c12烷基。更优选地，r1选自氢、经取代或未经取代的c1-c6烷基和-c(＝o)ra，其中ra是经取代或未经取代的c1-c6烷基。甚至更优选地，r1选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基和-c(＝o)ra，其中ra选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基。最优选的r1选自氢和甲基。在用于合成式ii和iv化合物的方法中，特别优选的r2选自氢、经取代或未经取代的c1-c12烷基、和-c(＝o)ra，其中ra是经取代或未经取代的c1-c12烷基。更优选地，r2选自氢、经取代或未经取代的c1-c6烷基和-(c＝o)ra，其中ra是经取代或未经取代的c1-c6烷基。甚至更优选地，r2选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基和-c(＝o)ra，其中ra选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基。最优选的r2是氢、甲基和乙酰基。在用于合成式ii和iv化合物的方法中，特别优选的r3和r4独立地选自氢和-c(＝o)ra，其中在每次出现时ra独立地选自经取代或未经取代的c1-c12烷基。更优选地，在每次出现时ra独立地选自经取代或未经取代的c1-c6烷基。甚至更优选地，ra选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基。最优选的r3和r4独立地选自氢和乙酰基。在用于合成式ii和iv化合物的方法中，特别优选的化合物1和2分别具有以下相对立体化学：在另外的优选实施方案中，组合了上述不同取代基的优选方案。本发明还涉及在用于合成上述式ii和iv化合物的方法中的优选取代基的这样的组合。在本发明该方面的一个更优选的实施方案中，式ii或iv的化合物是青腰虫素。在一个更优选的实施方案中，通过以下方式从化合物1’获得青腰虫素：-用-oh的保护基保护化合物1’中的所有羟基，所述-oh的保护基适合于在受保护的次级oh存在下从受保护的初级oh中选择性地被去除。这样的保护基的实例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。用于该步骤的最优选的保护基是叔丁基二甲基甲硅烷基；-选择性地去除初级oh保护基；-用合适的甲基化试剂使所得初级羟基甲基化；以及-去除oh的其他保护基。在另一个更优选的实施方案中，通过以下方式从化合物2’获得青腰虫素：-用1，2-二醇的合适保护基保护1，2-二醇基团。1，2-二醇的合适保护基的实例包括但不限于与相应的1，2-二醇反应之后生成mocdene缩醛、bocdene缩醛、丙烯醛缩醛、亚苄基缩醛、(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)亚苄基缩醛、均三甲苯缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、环状碳酸酯、甲基硼酸酯和乙基硼酸酯的那些基团。用于该步骤的更优选的保护基是产生mocdene缩醛、bocdene缩醛、亚苄基缩醛和环状碳酸酯的那些，其产生最优选的亚苄基缩醛的保护基；-用与前一步骤的1，2-二醇保护基正交的-oh的保护基保护其他羟基。适用于该步骤的oh的保护基的实例是三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和乙酰基。用于该步骤的最优选的保护基是叔丁基二甲基甲硅烷基和乙酰基；-去除1，2-二醇保护基；-用合适的甲基化试剂使所得1，2-二醇甲基化；以及-去除oh的其他保护基。合适的甲基化试剂的实例包括甲基碘、甲基溴、二甲基硫酸盐和三氟甲磺酸甲酯(methyltriflate)。根据本发明第八方面的分离的核酸优选从拉布伦茨氏菌属并且特别地从菌株phm005中得到。该细菌的全基因组序列揭示了负责用于青腰虫素和奥那米德合成的生物合成基因簇。生物信息学分析用于预测簇中基因的功能。被命名为lab基因簇的该基因簇是具有69kb的trans-at杂合聚酮化合物合酶/非核糖体合成酶(polyketidesynthase/nonribosomalsynthetase，pks/nrps)基因簇。其是从由与所述青腰虫素基因簇同源的20个orf构成的菌株phm005基因组的整个序列之基因组挖掘中推断出的。其包含编码用于生物合成青腰虫素样和奥那米德样化合物的酶的基因。在一个优选的实施方案中，分离的核酸优选地包含形成lab生物合成基因簇的单个单元和/或模块的核酸片段，如图3中更详细地显示。如图3中所示，lab基因簇包含lab706至laab726的单元。在一个特别优选的实施方案中，根据本发明第八方面的分离的核酸包含以下：如seqidno：2中所示的核苷酸序列；或为seqidno：2的互补序列的核苷酸序列；或在高度严格条件下与seqidno：2或其互补序列杂交的核苷酸序列；或与seqidno：2或其互补序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。根据本发明第九方面的特别优选的核酸片段是基本上包含基因lab708、lab709、lab710、lab721、lab722、lab723、lab724和lab725中的至少一种的核酸片段。进一步优选的是包含一个或更多个编码如seqidno：3至23中所示的蛋白质序列的核苷酸序列的核酸片段。还优选的部分是核苷酸序列seqidno：2的相应部分。在另一个优选的实施方案中，特别优选的片段是基本上由lab719和/或lab720组成的那些片段。进一步优选的是包含编码如seqidno：16和/或seqidno：17中所示的蛋白质序列的核苷酸序列的核酸片段。还优选的是核苷酸序列seqidno：2的相应部分。phm005全基因组的注释揭示了长度为6167bp、具有5651个编码序列(codingsequence，cds)、53个trna和10个rrna的环状染色体。55％g+c。使用用于预测/鉴定次级代谢的软件antismashv3.0(weber及其同事，nucleicacidresearch，2015doi：10.1093/nar/gkv437)将整个基因组探索成独特的重叠群，检测到102kb的大杂交pks/nrps基因簇。在所分析的317orf中，20个基因(69kb)显示与基于针对paedeusfascipens(genbankah013687.2)的共生细菌和theonellaswinhoei(genbankay688304.1)细菌共生体之blastp的青腰虫素(ped)和奥那米德(onn)序列具有同源性，如表1中更详细地显示。表1.lab基因与ped(青腰虫素)和onn(奥那米德)基因的同源性(*)h：同源性(％)。q：查询覆盖(％)推定的lab基因簇包含69kb核酸片段，其形成与青腰虫素生物合成基因簇描述的那些相似的单个单元和/或模块，如图3中更详细地显示。transat杂交pks/nrpslab基因簇主要由一个pks(由orflab708、lab709和lab710构成)和两个混合的pks/nrps系统(laab721、lab722、lab723、lab724、lab725和lab719)构成，其侧翼是加氧酶、氧化还原酶和甲基化酶，其构造与j.piel描述的ped基因密切相似。表1中详述了每种orf的预测功能和氨基酸的组成。transat-pkslab708、lab709、lab710(4.481个氨基酸)由模块gnat-acp-ks-dht-kr-cmt-acp-ks-transat-ech-acp-acp-ks-kr-acp构成，其与pedi描述的相似，同源性为42％至49％。该生物合成基因簇可对带有青腰虫素结构的外亚甲基的六元环的生物合成起作用。其结构域为gnat：gcn5相关的n乙酰转移酶；acp：酰基载体蛋白；ks：酮基合酶；dht：脱水酶；kr：酮还原酶；cmt：甲基转移酶；ech：烯酰coa水合酶o巴豆酸酶；transat：反式酰基转移酶)。由lab721、lab722、lab723、lab724、lab725(5.385aa)形成的杂合trans-atpks/nrps由6个酮基合酶和1个nrps构成，其对甘氨酸有明显的腺苷酸化作用。(ps-kr-acp-ks-transat-kr-ks-transat-transat-kr-cmt-acp-ks-transat-dh-kr-acp-ks-dht-acp-c-a(gly)-pcp-ks-transat-ks)。与pedf具有40％至49％的同源性，但模块的功能和构造基本相同。其中所述结构域为c：非核糖体肽缩合；a：非核糖体肽腺苷酸化；pcp：硫醇化和肽载体蛋白。根据第九方面的一个优选实施方案，我们鉴定了与任何奥那米德样化合物的生物合成相关的来自lab基因簇的lab719pks/nrps系统。这种推定的新化合物尚未在phm005的发酵液中鉴定出来。基因lab720的产物(氧化还原酶)可能通过在lab719中添加第一结构域acp之前切割青腰虫素结构来阻止奥那米德样化合物的形成，或者在其生物合成之后产生最终的氧化爆发(oxidativebreakout)。j.piel在wo03/044186a2中讨论了相同的疑问。基因lab719的基因修饰(与pedg的同源性)将解决这种不确定性。由lab719(2.254aa)代表的该“沉默的”杂交transatpks/nrps基因由具有不确定的腺苷酸化结构域的4个ks和1个nrps构成，其可用于并入arg(如奥那米德的情况)，但asp、asn、glu和gln可以是由nrpspredictor2svm算法所提出的其他可能的替代方案。该orf的组成是(acp-ks-transat-dh-kr-acp-ks-dh-dh-acp-ks-transat-kr-acp-ks-transat-c-a-pcp-te)。其中te：硫酯酶结构域。lab区域中与ped、onn或nsp(nosperin)岛没有序列同源性的单个orf是lab713，推定用于细胞色素p450，可在聚酮化合物的氧合作用中发挥作用，如j.piel在ped岛的情况中所述。(j.bacteriol.2004.186(5)，1280-1286)具有相似的功能指定基因。根据本发明第十方面的特别优选的模块化酶促系统包含根据序列seqidno：3至seqidno：23或与这些序列具有至少80％序列同一性的蛋白质序列中的任一个的蛋白质序列。根据本发明第十二方面的特别优选的宿主细胞是细菌细胞。更特别优选的宿主细胞是假单胞菌(pseudomonas)、不动杆菌(acinetobacter)、芽孢杆菌(bacillus)、链霉菌(streptomyces)或大肠杆菌(e.coli)。本发明对lab生物合成基因簇的修饰可用于制备经修饰lab生物合成基因簇或用于制备青腰虫素样或奥那米德样化合物。在根据本发明第十三方面的一个优选实施方案中，表达了lab719的产物。实施例一般结构阐明程序。使用jascop-1020旋光仪测定旋光度。在500/125mhz(1h/13c)的varian“unity500”谱仪上和在400/100mhz(1h/3c)的varian“unity400”谱仪上获得nmr谱。使用cdcl3的残留溶剂峰(δ1h为7.26ppm，13c为77.0ppm)作为内部参照，以ppm报道化学位移。使用agilent1100系列lc/msd谱仪记录(+)esims。使用agilent6230toflc/ms系统和esi-ms技术进行高分辨率质谱(hrms)。实施例1：细菌分离产生青腰虫素型的细菌拉布伦茨氏菌属phm005于2005年从来自肯尼亚海岸附近的一个高度附生和不明的珊瑚海绵栖息地的18米深处收集的沉积物样品中分离。在包含无菌人造海水(artificialseawater，asw)的50mlfalcon管中收集约5克的海洋砾石材料，并在加工之前将其在5℃下保持5天。一旦进入实验室，将样品均质化，并将100μl的1∶100稀释的asw直接涂布在petri培养皿上，其具有由27g/l海盐(tropicpro-reef)、16g/l琼脂和0.2mg/ml环己酰亚胺组成的海盐培养基。在28℃下孵育三周之后，挑取微褐色的菌落并将其转移到相同的海盐培养基，以确认纯度并产生用于分子表征的生物质，将一个菌落接种在液体海洋液体培养基中，以在20％甘油中在-80℃下进一步保存作为细胞库。实施例2：电子显微术。将处于指数生长中期的细胞吸附在400目碳-火棉胶涂覆的网格上2分钟，用2％乙酸铀酰进行负染色，用在100kv下操作的jeoljem1011透射电子显微镜成像并用ccdgatanerlangshenes1000w照相机拍摄。实施例3：16srrna表征。对于dna提取，将菌株在海洋液体培养基(difco1196)中生长72小时。回收细胞并通过用4％np40煮沸10分钟来裂解。通过离心弃去细胞碎片。使用细菌引物f1和r5通过聚合酶链式反应扩增16srdna基因。使用bionumericsv7.5(appliedmaths)，通过基于成对比对的相似系数和upgma进行聚类分析，生成系统发生树(图2)。通过与silvaltps123数据库进行比较鉴定了系统发生的近邻，并计算出成对的16srdna基因序列相似性。实施例4：培养和提取。这种菌株显然需要海盐来生长。培养之后，将全部液体培养基冻干并用有机溶剂的混合物提取，并将0.5ml粗提物样品干燥并进行细胞毒活性筛选。在16b/d培养基中，在120h达到最佳细胞毒活性。该培养基由17.5g/l啤酒酵母(sensient，g2025)、76g/l甘露醇、7g/l(nh4)2so4、13g/lcaco3、0.09g/lfecl3和36g/l海盐(tropicpro-reef)组成。在200×2l锥形瓶中制备该细菌在16b/d培养基中的50l放大试验，每个锥形瓶具有250ml的工作体积。将产生烧瓶用2％的在72小时内在另一个高度生长的预接种物的海洋液体培养基(difco1196)中生长的细菌接种。将放大试验在旋转振荡器中以220rpm在5cm偏心率下在120h内在28℃下孵育。然后将培养物以6.000rpm离心20分钟以得到45l水性上清液，将其用etoac提取两次，干燥有机相，得到粗提取物(1.8g)。实施例5：分离化合物1。将提取物应用于硅胶vfc(真空快速色谱法)系统，使用正己烷-etoac和etoac-meoh混合物进行逐步梯度洗脱，得到11个级分。将活性级分用etoac和etoac-meoh9∶1(550.0mg)洗脱，并使用对称c18柱(19×150mm，7μm)和线性梯度的h2o/ch3cn(5％至35％的ch3cn)在30分钟内以13.5ml/分钟的流量对其进行制备型反相hplc，得到非常活跃的峰级分(77.0mg)，保留时间为24.5分钟，包含基于hplc-ms色谱图的1。通过在xbridgec18柱(10×250mm，5μm)上并用h2o/ch3cn(78∶22)以4ml/分钟的流量等度洗脱的半制备型hplc进一步纯化该级分，得到24.5mg在这些hplc条件下保留时间为25.0分钟的纯化合物1。(1)：无色油；[α]d20+82.4(c＝0.49；chcl3)and[α]d20+81.3(c＝0.36；meoh)；1hnmr(cdcl3)δ3.99(1h，dq，j＝6.6，2.7hz，h-2)，2.25(1h，dq，j＝7.1，2.7hz，h-3)，2.43(1h，d，j＝14.1hz，h-5a)，2.36(1h，dt，j＝14.1，2.3hz，h-5b)，4.31(1h，s，h-7)，7.18(1h，d，j＝9.8hz，nh)，5.37(1h，dd，j＝9.8，7.8hz，h-10)，3.83(1h，dt，j＝7.8，2.7hz，h-11)，2.04(1h，dt，j＝13.5，3.6hz，h-12a)，1.75(1h，m，h-12b)，3.64(1h，m，h-13)，3.31(1h，m，h-15)，1.75(1h，m，h-16a)，1.57(1h，dd，j＝14.3，9.7hz，h-16b)，3.36(1h，m，h-17)，3.65(1h，m，h-18a)，3.48(1h，m，h-18b)，1.19(3h，d，j＝6.6hz，h-19)，1.01(3h，d，j＝7.1hz，h-20)，4.85(1h，t，j＝2.3hz，h-21a)，4.73(1h，t，j＝2.3hz，h-21b)，0.95(3h，s，c-22)，0.88(3h，s，c-23)，3.32(3h，s，meo-6)，3.38(3h，s，meo-10)，3.32(3h，s，meo-17)；13cnmr(cdcl3)δ69.6(d，c-2)，41.3(d，c-3)，145.7(s，c-4)，34.1(t，c-5)，99.7(s，c-6)，73.1(d，c-7)，171.9(s，c-8)，79.4(d，c-10)，72.6(d，c-11)，29.6(t，c-12)，71.8(d，c-13)，38.4(s，c-14)，75.4(d，c-15)，29.2(t，c-16)，79.0(d，c-17)，63.8(t，c-18)，17.9(q，c-19)，12.0(q，c-20)，110.5(t，c-21)，23.1(s，c-22)，13.5(s，c-23)，49.1(q，meo-6)，56.4(q，meo-10)，56.6(q，meo-17)；(+)-esimsm/z512.3[m+na]+；(+)-hres-tofmsm/z512.2873[m+na]+(c24h43no9na的计算值为512.2830)。化合物1的相对立体化学确定为基于roesy数据和偶合常数分析。化合物1的旋光度([α]d20+82.4，c＝0.49；chcl3和[α]d20+81.3，c+0.36；meoh)显示与青腰虫素([α]d20+86.8，c＝1.00；chcl3)相同的迹象。通过x射线晶体学研究(simpson，j.s.等，j.nat.prod.2000，63，704-706)和立体选择性合成(matsuda，f.等，tetrahedron1988，44，7063-7080)确定了青腰虫素的绝对立体化学。因此，我们初步提出化合物1的绝对构型与青腰虫素和其他报道的类似化合物(wan，s.等，j.am.chem.soc.2011，133，16668-16679)相同。实施例6.分离化合物2。从海洋来源的菌株phm005的发酵液(15l)的全液体培养基粗提去物(9.5g)中分离化合物2。将提取物应用于硅胶vfc(真空快速色谱法)系统，使用正己烷-etoac和etoac-meoh混合物进行逐步梯度洗脱，得到7个级分。将包含化合物2的活性级分用etoac-meoh4：1(659.0mg)洗脱，并使用线性梯度的h2o/ch3cn(5％至60％的ch3cn)在25分钟内以3.0ml/分钟的流量对其进行配备有对称c18柱(7.8×150mm，5μm)的半制备型反相hplc，得到25至30分钟的非常活跃的时间级分(28.0mg)，其包含基于hplc-ms色谱图化合物2。通过在对称c18柱(7.8×150mm，5μm)上使用线性梯度的h2o/ch3cn(20％至30％的ch3cn)在20分钟内流量为2.5ml/分钟的半制备hplc再次纯化该级分，得到2.6mg在这些hplc条件下保留时间为11.5分钟的纯化合物2。2：无色油；[α]d20+64.5(c＝0.16；chcl3)；1hnmr(cdcl3)δ3.97(1h，dq，j＝6.6，2.6hz，h-2)，2.25(1h，dq，j＝7.1，2.6hz，h-3)，)，2.50(1h，dt，j＝14.2，1.45hz，h-5a)，2.45(1h，d，j＝14.1hz，h-5b)，4.32(1h，s，h-7)，7.17(1h，d，j＝9.9hz，nh)，5.44(1h，dd，j＝9.9，7.5hz，h-10)，3.95(1h，m，h-11)，2.05(1h，dt，j＝13.5，4.0hz，h-12a)，1.75(1h，m，h-12b)，3.66(1h，m，h-13)，3.58(1h，m，h-15)，1.80(1h，m，h-16a)，1.55(1h，m，h-16b)，3.80(1h，m，h-17)，3.57(1h，m，h-18)，3.44(1h，dd，j＝11.5，6.5hz，h-18)，1.19(3h，d，j＝6.6hz，h-19)，1.01(3h，d，j＝7.1hz，h-20)，4.85(1h，t，j＝1.45hz，h-21a)，4.75(1h，t，j＝1.45hz，h-21b)，0.96(3h，s，c22)，0.89(3h，s，c-23)，3.34(3h，s，meo-6)，3.41(3h，s，meo-10)；13cnmr(cdcl3)δ69.6(d，c-2)，41.3(d，c-3)，146.1(s，c-4)，34.2(t，c-5)，99.6(s，c-6)，74.5(d，c-7)，171.9(s，c-8)，79.3(d，c-10)，72.2(d，c-11)，29.8(t，c-12)，71.6(d，c-13)，38.4(s，c-14)，80.9(d，c-15)，31.4(t，c-16)，72.8(d，c-17)，66.6(t，c-18)，17.8(q，c-19)，11.9(q，c-20)，110.2(t，c-21)，23.4(s，c-22)，14.3(s，c-23)，49.6(q，meo-6)，56.3(q，meo-10)；(+)-esimsm/z498.4[m+na]+；(+)-hres-tofmsm/z498.2713[m+na]+(c23h41no9na的计算值为498.2674)。化合物2的相对立体化学指定为基于偶合常数分析。化合物2的旋光度([α]d20+64.5，c＝0.16；chcl3)显示与青腰虫素([α]d20+86.8，c＝1.00；chcl3)相同的迹象。因此，我们初步提出化合物2的绝对构型与青腰虫素和其他报道的类似化合物(wan，s.等，j.am.chem.soc.2011，133，16668-16679)相同。实施例7.合成化合物3在氮气氛下，向无水dcm(2ml)中1(2.5mg，5.1μmol)的溶液添加吡啶(10μl，124μmol)、dmap(催化量)和ac2o(2.9μl，31mmol)。将反应在室温下静置过夜。将混合物真空浓缩，并通过硅胶上的快速柱色谱法纯化(正己烷/etoac1∶1)，得到为白色固体的3(3mg，95％)。3：1hnmr(cdcl3)δ3.96(1h，dq，j＝6.6，2.6hz，h-2)，2.24(1h，dq，j＝7.0，2.6hz，h-3)，2.62(1h，dt，j＝14.5，2.2hz，h-5a)，2.37(1h，d，j＝14.5hz，h-5b)，5.25(1h，s，h-7)，6.62(1h，d，j＝9.6hz，nh)，5.27(1h，dd，j＝9.6，4.1hz，h-10)，3.91(1h，dt，j＝6.3，4.6，hz，h-11)，2.02(1h，m，h-12a)，1.66(1h，m，h-12b)，4.91(1h，dd，j＝4.7，4.1hz，h-13)，3.55(1h，m，h-15)，2.02(1h，m，h-16a)，1.67(1h，m，h-16b)，3.60(1h，dd，j＝11.3，2.2hz，h-17)，4.32(1h，dd，j＝12.1，2.6hz，h-18a)，4.12(1h，m，h-18b)，1.15(3h，d，j＝6.6hz，h-19)，0.97(3h，d，j＝7.0hz，h-20)，4.86(1h，t，j＝2.0hz，h-2a)，4.76(1h，t，j＝2.0hz，h-21b)，0.97(3h，s，c22)，0.89(3h，s，c-23)，3.21(3h，s，meo-6)，3.39(3h，s，meo-10)，3.38(3h，s，meo-17)，2.20(3h，s，ocome-7)，2.08(3h，s，ocome-13)，2.10(3h，s，ocome-18)；13cnmr(cdcl3)δ69.6(d，c-2)，41.3(d，c-3)，145.5(s，c-4)，33.8(t，c-5)，99.1(s，c-6)，72.1(d，c-7)，167.4(s，c-8)，81.8(d，c-10)，70.0(d，c-11)，26.7(t，c-12)，74.2(d，c-13)，36.7(s，c-14)，76.5(d，c-15)，29.3(t，c-16)，76.4(d，c-17)，64.0(t，c-18)，17.9(q，c-19)，12.0(q，c-20)，110.4(t，c-21)，24.7(s，c-22)，17.2(s，c-23)，48.4(q，meo-6)，56.3(q，meo-10)，57.0(q，meo-17)，20.7(q，ocome-7)，169.8(s，ocome-7)，21.2(q，ocome-13)，170.3(s，ocome-13)，20.9(q，ocome-18)，170.0(s，ocome-18)，；(+)-esimsm/z638.3[m+na]+.化合物3的相对立体化学确定为与其前体化合物1类似。实施例8.用于检测抗肿瘤活性的体外生物测定该测定的目的是评价所测样品的体外细胞生长抑制(延迟或阻止肿瘤细胞生长的能力)或细胞毒性(杀伤肿瘤细胞的能力)活性。细胞系名称n°atcc物种组织特征a549ccl-185人肺肺癌(nsclc)ht29htb-38人结肠结肠直肠腺癌mda-mb-231htb-26人乳房乳腺腺癌psn1crm-crl-3211人胰腺胰腺腺癌使用sbr比色测定评价细胞毒活性已应用使用磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)的比色测定反应以提供细胞生长和生存力的定量测量(遵循skehan等，j.natl.cancerinst.1990，82，1107-1112描述的技术)。这种测定形式采用96孔细胞培养微孔板，遵循美国国家标准协会(americannationalstandardsinstitute)和实验室自动化与筛选协会(societyforlaboratoryautomationandscreening)(ansislas1-2004(r2012)10/12/2011)的标准。本研究中使用的所有细胞系均获自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)，并来源于不同类型的人癌症。在37℃下，5％co2和98％湿度下，将细胞维持在补充有10％胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中。对于实验，使用胰蛋白酶消化从亚汇合培养物中收获细胞，并在计数和平板接种之前重悬于新鲜培养基中。将细胞以150μl的等分试样，每孔5000个细胞接种于96孔微量滴定板中，并使其在无药物培养基中附着于板表面18小时(过夜)。之后，固定每个细胞系的一个对照(未处理)板(如下所述)并用于零时间参照值。然后使用10个2/5连续稀释液(浓度范围为10至0.003μg/ml)和一式三份培养物(dmso中1％终浓度)，用测试化合物(在完全培养基加4％dmso中的50ml等分试样的4x储备溶液)处理培养板。处理72小时之后，使用srb方法测量抗肿瘤效果：简言之，用pbs洗涤细胞两次，在室温下在1％戊二醛溶液中固定15分钟，在pbs中润洗两次，并在室温下用0.4％srb溶液染色30分钟。然后用1％乙酸溶液润洗细胞数次并在室温下风干。然后在10mmtrizma碱溶液中提取srb，并在自动分光光度板读数器中测量其在490nm处的吸光度。通过应用nci算法(boydmr和paullkd.drugdev.res.1995，34，91-104)估计对细胞生长和存活的作用。通过非线性回归分析将在一式三份培养物中获得的值拟合成四参数逻辑斯谛曲线。通过对获自这样的拟合的曲线进行自动插值计算(根据nci算法)三个参照参数：gi50＝与对照培养物相比，产生50％细胞生长抑制的化合物浓度；tgi＝与对照培养物相比，总细胞生长抑制(细胞生长抑制作用)，并且lc50＝产生50％净细胞杀伤细胞毒性作用的化合物浓度)。表2说明了关于本发明化合物的生物活性的数据打印出(原始为电子形式)(该页不是国际申请的一部分并且不计算为国际申请的页)由受理局填写由国际局填写当前第1页1 2 3