LRIG-1蛋白的特异性结合分子及其用途的制作方法

本发明涉及能够特异性结合富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白的结合分子及其用途，所述蛋白是存在于调节性t细胞(treg细胞)表面的蛋白。

背景技术：

所有正常个体中的最重要特征之一是能够识别和消除非自身抗原，同时又不会对构成自身的抗原物质产生有害反应。如此，身体对自身抗原的无反应称为免疫学无反应性或耐受性。通过消除可能具有自身抗原的特异性受体的淋巴细胞，或通过自我灭活接触自身抗原后的反应能力而发生自我耐受。在诱导或维持自身耐受性方面产生问题的情况下，发生对自身抗原的免疫反应，由此引起的疾病称为自身免疫疾病。

为治疗自身免疫性疾病，gershon在20世纪70年代早期首次提出抑制性t细胞的概念，暗示可能存在能够控制和抑制常规t细胞的效应子功能的t细胞(gershon和k.kondo，immunology，1970，18：723-37)。自此，在免疫学的许多领域中进行了研究以阐明调节性t细胞的生物学特性和功能。

关于这一点，有报道称调节性t细胞(treg细胞)在天然防止过度炎症和免疫反应的发生中起重要作用；然而，在发生自身免疫疾病和慢性炎性疾病的情况下，调节性t细胞的功能和数量显著下降。因此，在患有免疫和炎性疾病的患者的情况下，调节性t细胞以正常水平产生是重要的，作为这些疾病的治疗方法之一。

迄今为止，已经对调节性t细胞中特异性存在的基因和蛋白进行了研究，并且已经提出诸如cd25、ctla4、cd62l、cd38、cd103、gitr和cd45rb等物质可能对应于标记物质。然而，没有只能单独靶向调节性t细胞的基因和蛋白。

在另一方面，有在三个称为互补决定区的高变区(以下称为“cdr”)和四个框架区。cdr主要用于结合抗原上的表位。各条链的cdr通常从n端开始依次称为cdr1、cdr2和cdr3，同时也通过具体cdr所在的链来区分。

技术问题

本发明的目的是提供存在于调节性t细胞(treg细胞)表面的lrig-1蛋白的特异性结合分子。

本发明的另一目的是提供编码本发明结合分子的核酸分子。

本发明的另一目的是提供插入有本发明的核酸分子的表达载体。

本发明还有另一目的是提供转染有本发明的表达载体的宿主细胞系。

本发明还有另一目的是提供本发明的抗体-药物偶联物。

本发明还有另一目的是提供预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的结合分子。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解未提及的其它问题。

解决问题的技术方案

本发明人发现了特异性存在于调节性t细胞表面上的lrig-1蛋白，选择了该蛋白上的表位，并产生了能够特异性结合lrig-1蛋白的单克隆抗体，从而完成了本发明。

本发明的一实施方案提供了特异性结合富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白的结合分子。

本文所用的术语“结合分子”是指包含完整免疫球蛋白的可变结构域，所述完整免疫球蛋白包括单克隆抗体(例如嵌合、人源化或人单克隆抗体)，或与抗原结合的免疫球蛋白，例如与完整的免疫球蛋白竞争结合甲型流感病毒的单体ha或三聚体ha的免疫球蛋白片段。无论结构为何，抗原结合片段都与完整免疫球蛋白识别的相同抗原结合。所述抗原结合片段可包括肽或多肽，其含有结合分子的氨基酸序列中的两个或更多个连续残基、20或更多个连续残基、25或更多个连续残基、30或更多个连续残基、35或更多个连续残基、40或更多个连续残基、50或更多个连续残基、60或更多个连续残基、70或更多个连续残基、80或更多个连续残基、90或更多个连续残基、100或更多个连续残基、125或更多个连续残基、150或更多个连续残基、175或更多个连续残基、200或更多个连续残基、或250或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列。术语“抗原结合片段”具体包括：fab、f(ab')、f(ab')2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三抗体、四抗体、含有足以使特定抗原结合至多肽的一个或多个免疫球蛋白片段的多肽，等等。所述片段可以通过合成、或通过完整免疫球蛋白的酶学或化学消化来产生，或者可以采用重组dna技术通过基因工程方法产生。生产方法是本领域熟知的。

在本发明中，lrig-1蛋白是存在于调节性t细胞表面的由1091个氨基酸组成的跨膜蛋白，由胞外或管腔侧的富含亮氨酸的重复序列(lrr)和三个免疫球蛋白样结构域、细胞跨膜序列以及胞质尾部组成。lrig基因家族包括lrig1、lrig2和lrig3，并且它们之间的氨基酸高度保守。lrig1基因在正常皮肤中高度表达，并且可以在基底和毛囊细胞中表达以便调节上皮干细胞的增殖。因此，lrig1基因在维持表皮稳态中起重要作用，而其缺失可能发展为牛皮癣或皮肤癌。据报道，在lrig1所处的染色体3p14.3部分被切除的情况下，有可能发展为癌细胞。事实上，已确定在肾细胞癌和皮肤鳞状细胞癌中lrig1的表达大大降低。最近，还发现lrig-1仅在约20％至30％的癌症中表达。另一方面，出于本发明的目的，lrig-1蛋白可以是但不限于人或小鼠中存在的蛋白。

在本发明中，lrig-1蛋白可以是但不限于seqidno:1所示的人源多肽或seqidno:3所示的小鼠源多肽。

此外，在本发明中，由seqidno:1所示的lrig-1蛋白可以由seqidno:2所示的多核苷酸编码，但不限于此。

此外，在本发明中，由seqidno:3所示的lrig-1蛋白可以由seqidno:4所示的多核苷酸编码，但不限于此。

在本发明中，所述结合分子可以是包含以下的结合分子：

重链可变区，包含由选自seqidno:5、13、21或29所示氨基酸序列构成的重链cdr1；由选自seqidno:6、14、22或30所示氨基酸序列构成的重链cdr2；由选自seqidno:7、15、23或31所示氨基酸序列构成的重链cdr3；和

轻链可变区，包含由选自seqidno:8、16、24或32所示氨基酸序列构成的轻链cdr1；由选自seqidno:9、17、25或33所示氨基酸序列构成的轻链cdr2；由选自seqidno:10、18、26或34所示氨基酸序列构成的轻链cdr3。

在本发明中，所述结合分子可以是包含以下的结合分子：

选自以下(a)-(d)构成的组的重链可变区：

(a)重链可变区，其含有seqidno:5所示的重链cdr1、seqidno:6所示的重链cdr2和seqidno:7所示的重链cdr3；

(b)重链可变区，其含有seqidno:13所示的重链cdr1、seqidno:14所示的重链cdr2和seqidno:15所示的重链cdr3；

(c)重链可变区，其含有seqidno:21所示的重链cdr1、seqidno:22所示的重链cdr2和seqidno:23所示的重链cdr3；和

(d)重链可变区，其含有seqidno:29所示的重链cdr1、seqidno:30所示的重链cdr2和seqidno:31所示的重链cdr3；以及

选自以下(e)-(h)构成的组的轻链可变区：

(e)轻链可变区，其含有seqidno:8所示的轻链cdr1、seqidno:9所示的轻链cdr2和seqidno:10所示的轻链cdr3；

(f)轻链可变区，其含有seqidno:16所示的轻链cdr1、seqidno:17所示的轻链cdr2和seqidno:18所示的轻链cdr3；

(g)轻链可变区，其含有seqidno:24所示的轻链cdr1、seqidno:25所示的轻链cdr2和seqidno:26所示的轻链cdr3；和

(h)轻链可变区，其含有seqidno:32所示的轻链cdr1、seqidno:33所示的轻链cdr2和seqidno:34所示的轻链cdr3。

在本发明中，所述结合分子可以是选自以下(1)-(4)构成的组的结合分子：

(1)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有seqidno:5所示的重链cdr1、seqidno:6所示的重链cdr2和seqidno:7所示的重链cdr3，所述轻链可变区含有seqidno:8所示的轻链cdr1、seqidno:9所示的轻链cdr2和seqidno:10所示的轻链cdr3；

(2)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有seqidno:13所示的重链cdr1、seqidno:14所示的重链cdr2和seqidno:15所示的重链cdr3，所述轻链可变区含有seqidno:16所示的轻链cdr1、seqidno:17所示的轻链cdr2和seqidno:18所示的轻链cdr3；

(3)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有seqidno:21所示的重链cdr1、seqidno:22所示的重链cdr2和seqidno:23所示的重链cdr3，所述轻链可变区含有seqidno:24所示的轻链cdr1、seqidno:25所示的轻链cdr2和seqidno:26所示的轻链cdr3；

(4)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有seqidno:29所示的重链cdr1、seqidno:30所示的重链cdr2和seqidno:31所示的重链cdr3，所述轻链可变区含有seqidno:32所示的轻链cdr1、seqidno:33所示的轻链cdr2和seqidno:34所示的轻链cdr3。

在本发明中，所述结合分子可以是包含以下的结合分子：

由选自下组的任一氨基酸序列构成的重链可变区：seqidno:11、19、27和35；和

由选自下组的任一氨基酸序列构成的轻链可变区：seqidno:12、20、28和36。

在本发明中，所述结合分子可以是选自以下结合分子构成的组的结合分子：

包含seqidno:11所示重链可变区和seqidno:12所示轻链可变区的结合分子；

包含seqidno:19所示重链可变区和seqidno:20所示轻链可变区的结合分子；

包含seqidno:27所示重链可变区和seqidno:28所示轻链可变区的结合分子；以及

包含seqidno:35所示重链可变区和seqidno:36所示轻链可变区的结合分子。

在本发明中，所述结合分子还可以包含可结晶片段(fc)区或恒定区。在此，fc区可以是igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区，或可自其衍生。或者，fc区可以是混合fc区(hybridfcregion)。

在本发明中，所述fc区可以是哺乳动物来源的igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区，并且优选人来源的igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区。然而，fc区不限于此。

作为本发明的一实例，fc区可以是seqidno:37所示小鼠来源的igg2afc区，但不限于此。

作为本发明的一实例，fc区可以是seqidno:38所示小鼠来源的免疫球蛋白kappa恒定区。

作为本发明的一实例，fc区可以是seqidno:39所示人来源的igg1fc区。

作为本发明的一实例，fc区可以是seqidno:40所示人来源的igg2fc区，但不限于此。

作为本发明的一实例，fc区可以是seqidno:41所示人来源的igg3fc区，但不限于此。

作为本发明的一实例，fc区可以是seqidno:42所示人来源的igg4fc区，但不限于此。

作为本发明的一实例，fc区可以是seqidno:43所示人来源的免疫球蛋白kappa恒定区，但不限于此。

作为本发明的一实例，fc区可以是人来源的免疫球蛋白lambda恒定区，但不限于此。

在本发明中，“混合fc”可以衍生自人igg亚类的组合、或人igd和igg的组合。在混合fc结合于生物活性分子、多肽等的情况下，所述混合fc不仅具有增加生物活性分子的血清半衰期的作用，在编码fc-多肽融合蛋白的核苷酸序列表达之时还具有提高该多肽的表达水平的作用。

作为本发明的一实例，所述混合fc区可以由seqidno:44所示，但不限于此。

在本发明的结合分子中，fc或恒定区可以通过接头连接于可变区。在此，所述接头可以与fc的c末端连接，本发明的结合分子的n末端可以与接头连接。然而，本发明不限于此。

在本发明中，“接头”可以包含可以被具有目标疾病的组织或细胞中过表达的酶切割的序列。如果接头可以被上述过表达的酶切割，则可以有效地防止多肽的活性由于fc部分而降低。在本发明中，接头的实例可以优选是由位于血液中含量最高的人白蛋白的第282到第314部分的33个氨基酸构成的肽接头，更优选由位于人白蛋白的第292到第304部分的13个氨基酸构成的肽接头。这些部分是在三维结构中大部分暴露于外部的部分，因此在体内引起免疫应答的可能性最小。但是，接头不限于此。

本发明的结合分子还可以包含由选自下组的氨基酸序列构成的重链恒定区：seqidno:37、39、41、42、43和44。

本发明的结合分子还可以包含由seqidno:38或40所示氨基酸序列构成的轻链恒定区。

本发明的结合分子还可包含：

由seqidno:37所示氨基酸序列构成的重链恒定区；和

由seqidno:38所示氨基酸序列构成的轻链恒定区。

本发明的结合分子还可包含：

由seqidno:39、41、42或43所示氨基酸序列构成的重链恒定区；和

由seqidno:40所示氨基酸序列构成的轻链恒定区。

本发明的结合分子还可包含：

由seqidno:44所示氨基酸序列构成的重链恒定区。

本发明的结合分子选自以下结合分子构成的组：

包含seqidno:45所示重链和seqidno:46所示轻链的结合分子；

包含seqidno:47所示重链和seqidno:48所示轻链的结合分子；

包含seqidno:49所示重链和seqidno:50所示轻链的结合分子；和

包含seqidno:51所示重链和seqidno:52所示轻链的结合分子。

本发明的结合分子的特征在于作为抗体，但不限于此。所述抗体包括所有的单克隆抗体、全长抗体或抗体片段，所述抗体片段作为抗体的一部分、具有结合lrig-1蛋白的能力并且与本发明的结合分子竞争结合于lrig-1上的表位。

本文所用的术语“抗体”是指用作特异性识别抗原的受体的蛋白分子，包括与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子。出于本发明的目的，抗原可以是调节性t细胞表面上存在的lrig-1蛋白。所述抗体优选可以特异性识别lrig-1蛋白的富含亮氨酸区或免疫球蛋白样结构域，但不限于此。

在本发明中，“免疫球蛋白”具有重链和轻链，且重链和轻链均包含恒定区和可变区。重链和轻链的可变区均含有3个称为互补决定区(下文称为“cdr”)的高变区和4个框架区。cdr主要用于结合抗原上的表位。各链的cdr从n-端开始通常依次称为cdr1、cdr2和cdr3，并且通过具体cdr所处的链加以区分。

此外，本文所用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子，其从基本上相同的抗体群中分离，并且对特定的表位表现出单一的结合特异性和亲和力。

在本发明中，“全长抗体”具有含两条全长轻链和两条全长重链的结构，其中各轻链通过二硫键与重链连接，且全长抗体包括iga、igd、ige、igm和igg。igg包括igg1、igg2、igg3和igg4亚型。

此外，本文所用的术语“抗原片段”是指保留抗原结合功能的片段，包括fab、fab'、f(ab')2、fv等。fab具有含轻链和重链的可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(ch1结构域)的结构，并具有一个抗原结合位点。此外，fab'与fab的不同之处在于，fab'在重链ch1结构域的c末端具有包含至少一个半胱氨酸残基的铰链区。fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键，从而产生f(ab')2抗体。fv(可变片段)是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链fv(dsfv)配置为使得重链可变区和轻链可变区通过二硫键相互连接，单链fv(scfv)配置为使得重链可变区和轻链可变区通常通过肽接头相互共价连接。在使用蛋白水解酶(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)的情况下，得到的抗体片段可以是fab或f(ab')2片段，并且可以通过基因重组技术产生。

此外，在本发明中，抗体可以是但不限于嵌合抗体、人源化抗体、二价/双特异性分子、小抗体、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、双抗体、三抗体或四抗体，或其片段。

在本发明中，“嵌合抗体”是通过将小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区重组而获得的抗体，与小鼠抗体相比，免疫应答大幅提高。

此外，本文所用的术语“人源化抗体”是指通过修饰源自非人物种的抗体的蛋白序列而获得的抗体，使得该蛋白序列与人类天然产生的抗体变体相似。例如，可以如下制备人源化抗体。小鼠来源的cdr可以与人抗体来源的fr重组以制备人源化可变区，并且人源化可变区可以与优选的人抗体的恒定区重组以制备人源化抗体。在本发明中，提供的结合分子可以是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段，其能够与lrig-1蛋白结合又还与另一种蛋白结合。

在本发明中，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以包含本发明的结合分子。作为本发明的实例，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含能够结合lrig-1蛋白的抗原结合结构域，其中能够结合lrig-1蛋白的抗原结合结构域可以包含本发明的结合分子或由本发明的结合分子组成。

本发明提供的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含：抗原结合结构域，其是能够结合本发明的lrig-1蛋白的结合分子；和能够结合另一靶蛋白的抗原结合结构域。在此，能够结合另一靶蛋白的抗原结合结构域可以是能够结合lrig-1蛋白以外的蛋白(例如但不限于pd-1或细胞表面受体)的抗原结合结构域。然而，抗原结合结构域不限于此。

本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以采用任何合适的形式，例如在kontermannmabs2012,4(2):182-197中所述，其通过引用全文并入本文。例如，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体偶联物(例如igg2、f(ab')2或covx体)、双特异性igg或igg样分子(例如igg、scfv4-ig、igg-scfv、scfv-igg、dvd-ig、igg-svd、svd-igg2合1-igg、mab2或双抗共有lc(tandemabcommonlc))、不对称双特异性igg或igg样分子(例如，kihigg、kihigg共有lc(kihiggcommonlc)、crossmab、kihigg-scfab、mab-fv、电荷对、或seed体)、小型双特异性抗体分子(例如，双抗体(db)、dsdb、dart、scdb、tandab、串联scfv(tafv)、串联dab/vhh、三体、三头抗体(triplehead)、fab-scfv、或f(ab')2-scfv2)、双特异性fc和ch3融合蛋白(例如tafv-fc、双-双抗体、scdb-ch3、scfv-fc-scfv、hcab-vhh、scfv-kih-fc、或scfv-kih-ch3)、或双特异性融合蛋白(例如scfv2-白蛋白、scdb-白蛋白、tafv-毒素、dnl-fab3、dnl-fab4-igg、dnl-fab4-igg-细胞因子2)。具体参见kontermannmabs2012,4(2):182-19中的图2。本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以由本领域技术人员设计和制备。

在本发明中生产双特异性抗体的方法包括形成还原性二硫键或非还原性硫醚键，以及抗体或抗体片段的化学交联，例如，segal和bast,2001.“双特异性抗体的产生”(productionofbispecificantibodies).《最新免疫学方案》(currentprotocolsinimmunology).14:iv:2.13:2.13.1-2.13.16中所述，该文献通过引用全文纳入本文。例如，可以利用n-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(spdp)，通过例如铰链区的sh-基团化学交联fab片段，以便生成二硫键连接的双特异性f(ab)2异二聚体。

此外，本发明中产生双特异性抗体的另一方法包括将产生抗体的杂交瘤与例如聚乙二醇融合，以产生能够分泌双特异性抗体的四价杂交瘤细胞，例如，d.m.和bast,b.j.2001.“双特异性抗体的产生”.《最新免疫学方案》.14:iv:2.13:2.13.1-2.13.16中所述。

本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可以，例如通过从编码抗原结合分子多肽的核酸构建物中表达而重组产生，例如，在《抗体工程改造：方法和方案》(antibodyengineering:methodsandprotocols),第二版(胡马纳出版社-humanapress,2012)，第40章:“双特异性抗体的产生：二抗体和串联scfv”(productionofbispecificantibodies:diabodiesandtandemscfv)(hornig和farber-schwarz),或french,“如何制备双特异性抗体”(howtomakebispecificantibodies),methodsmol.med.2000；40:333-339中所述，二者的全部内容通过引用整体并入本文。

例如，可通过分子克隆技术制备dna构建物，所述dna构建物包含：编码两个抗原结合域的轻链和重链可变域(即，能结合pd-1的抗原结合域的轻链和重链可变域，以及能够结合另一靶蛋白的抗原结合域的轻链和重链可变域)的序列，以及编码所述抗原结合结构域之间的合适接头或二聚结构域的序列。随后，可以通过在合适的宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中表达该构建物(例如，体外)来产生重组双特异性抗体，然后可以任选纯化表达的重组双特异性抗体。

可以通过亲和力成熟方法产生抗体，其中与未修饰的亲本抗体相比，经修饰抗体对抗原的亲和力有所改善。亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的方法产生，例如，marks等.,rio/technology10:779-783(1992)；barbas等.procnat.acad.sci.usa91:3809-3813(1994)；schier等.,gene169:147-155(1995)；yelton等.,j.immunol.155:1994-2004(1995)；jackson等.,j.immunol.154(7):3310-159(1995)；和hawkins等.,j.mol.biol.226:889-896(1992)中所述。

此外，本发明提供的结合分子可以包括氨基酸序列的变体，只要该变体可以特异性结合lrig-1蛋白。例如，为改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性，可以对抗体的氨基酸序列进行修饰。此类修饰包括，例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。

可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷和大小进行这种氨基酸变化。根据对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析，可以看出精氨酸、赖氨酸和组氨酸均为带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的形状相似。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以视作生物功能等效物。

在引入变化时，可以考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathicindex)。根据其疏水性和电荷，为每个氨基酸指定了亲疏水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。亲疏水性氨基酸指数在赋予蛋白的相互作用生物学功能中非常重要。已知用具有相似亲疏水性指数的氨基酸取代可以使蛋白保持相似的生物学活性。在参照亲疏水性指数引入变化的情况下，在表现出亲疏水性指数差优选在±2之内，更优选在±1之内，甚至更优选在±0.5之内的氨基酸之间进行取代。

同时，还熟知在具有相似亲水性值的氨基酸之间作取代产生生物学活性相等的蛋白。如美国专利号4,554,101所述，各氨基酸残基被给予以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在参考亲水性值引入变化的情况下，可以在表现出亲水性值差优选在±2之内，更优选在±1之内，甚至更优选在±0.5之内的氨基酸之间进行取代。

蛋白中的氨基酸交换不完全改变分子活性是本领域已知的(h.neurath,r.l.hill,《蛋白》(theproteins),学术出版社,纽约(1979))。最常见发生的交换是以下氨基酸残基之间的交换：ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、gln/glu。

考虑到具有生物学等效活性的上述变化，可以解释本发明的结合分子还包括与序列表中列出的序列具有实质性同一性的序列。

本文所用的术语“实质性同一性”是指当本发明的序列与任何其它序列比对时，在最大程度上彼此匹配，并且采用本领域通常使用的算法来分析比对的序列，显示至少61％同源性、更优选70％同源性、甚至更优选80％同源性、最优选90％同源性的序列。用于比较序列的比对方法是本领域已知的。用于比对的各种方法和算法公开于smith和waterman,adv.appl.math.2:482(1981)；needleman和wunsch,j.mol.bio.48:443(1970)；pearson和lipman,methodsinmol.biol.24:307-31(1988)；higgins和sharp,gene73:237-44(1988)；higgins和sharp,cabios5:151-3(1989)；corpet等.,nuc.acidsres.16:10881-90(1988)；huang等.,comp.appl.biosci.8:155-65(1992)；和pearson等.,meth.mol.biol.24:307-31(1994)。可以从国家生物信息中心(nbci)等获得ncbi局部序列比对基本检索工具(blast)(altschul等.,j.mol.biol.215:403-10(1990))，该工具可以与因特网上的测序程序，例如blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx联用。blsat可以从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/访问。可以在线识别使用该程序的序列同源性比较方法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html)。

在本发明中，结合分子，优选抗体可以通过用于产生抗体的常规方法产生，还可以通过亲和力成熟产生。

本文所用的术语“亲和力成熟”是指在免疫反应过程中由活化的b细胞产生对抗原的亲和力增加的抗体的过程。出于本发明的目的，亲和力成熟允许在天然发生的相同过程中，基于突变和选择原理，而产生抗体或抗体片段。

本发明提供的结合分子，优选抗体可以激活免疫细胞中，特别是调节性t免疫细胞(treg细胞)的功能；增加treg细胞的数量；调节免疫耐受性，从而有效预防、改善或治疗免疫相关疾病。

在本发明中，“免疫相关疾病”可以是由各种免疫细胞和炎性细胞的过度活化和表达诱导的疾病。免疫相关疾病可以包括，例如自身免疫疾病；以及移植物抗宿主病；器官移植排斥；哮喘；特应性疾病；或急性或慢性炎性疾病，但不限于此。

此外，在本发明中，“自身免疫疾病”可以是但不限于选自下组的一种或多种：类风湿性关节炎、全身性硬皮病、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、斑秃、哮喘、克罗恩病、贝塞特病、sjogren's综合征、格-巴二氏guillain–barré综合征、慢性甲状腺炎、多发性硬化症、多发性肌炎、强直性脊柱炎、纤维组织炎(fibrositis)和结节性多发性动脉炎。

根据本发明的另一实施方式，提供了编码本发明提供的结合分子的核酸分子。

如本领域技术人员已知的，本发明的核酸分子包括通过将本发明提供的结合分子的氨基酸序列转化成多核苷酸序列而获得的所有核酸分子。因此，可以通过开放读框(orf)来制备各种多核苷酸序列，并且所有这些多核苷酸序列也都包括在本发明的核酸分子中。

根据本发明的又一实施方式，提供了插入有本发明提供的分离的核酸分子的表达载体。

在本发明中，“载体”是能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其是指其中可以连接其它dna区段的环状双链dna。另一类载体是噬菌体载体。还有另一类载体是其中可以将其它dna区段连接到病毒基因组中的病毒载体。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体是附加型哺乳动物载体(episomalmammalianvector))。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。可用于重组dna技术的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。

在本发明中，表达载体的具体实例可以选自但不限于下组：商业上广泛使用的pcdna载体、f、r1、rp1、col、pbr322、tol、ti载体；粘粒；噬菌体，例如λ噬菌体、λ形噬菌体、m13噬菌体、mu噬菌体、p1噬菌体、p22、噬菌体qμμ噬菌体、t-偶列噬菌体、t2噬菌体、t3噬菌体、t7噬菌体；植物病毒。作为表达载体，本领域技术人员已知的任何表达载体均可用于本发明，并且根据靶宿主细胞的性质来选择表达载体。可通过磷酸钙转染、病毒感染、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔将载体引入宿主细胞。然而，本发明不限于此，本领域技术人员可以采用和使用适合所用表达载体和宿主细胞的导入方法。载体可优选包含至少一种选择标记。然而，本发明不限于此，可以使用不含选择标记的载体进行选择，这取决于是否产生产物。选择标记的选择取决于靶宿主细胞，这可以采用本领域技术人员已知的方法完成，因此本发明对此没有限制。

为了便于本发明核酸分子的纯化，可以将标签序列插入表达载体中并与之融合。标签包括但不限于六组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或flag标签，本领域技术人员已知的有助于纯化的任何标签均可用于本发明。

本发明的又一个实施方式提供了用本发明提供的表达载体转染的宿主细胞系。

在本发明中，“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是一个或多个掺入多肽插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组dna互补)。宿主细胞包括用本文的一种或多种多核苷酸体内转染的细胞。

在本发明中，宿主细胞可以包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞来源的细胞，可以是例如细菌细胞，如大肠杆菌(e.coli)、链霉菌(streptomyces)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)；真菌细胞，如酵母细胞和巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)；昆虫细胞，如果蝇(drosophila)和斜纹夜蛾(spodoptera)sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、sp2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴母细胞、cos、nso(小鼠骨髓瘤)、293t、鲍斯黑色素瘤细胞、ht-1080、幼仓鼠肾(bhk)细胞、人胚胎肾(hek)细胞或perc.6(人视网膜细胞)；或植物细胞。然而，宿主细胞不限于此，并且有本领域技术人员已知的可以用作宿主细胞系的任何细胞可用。

本发明的又一实施方式提供了包含本发明提供的抗体和药物的抗体-药物偶联物(adc)。

本文所用的术语“抗体-药物偶联物(adc)”是指药物和抗体彼此化学连接而不降低抗体和药物的生物学活性的形式。在本发明中，抗体-药物偶联物是指药物与抗体的重链和/或轻链的n-端氨基酸残基结合的形式，具体是其中药物与抗体的重链和/或轻链的n末端α-胺基结合的形式。

本文所用的术语“药物”可以表示对细胞具有一定生物学活性的任何物质，其是包括dna、rna或肽的概念。药物可以是含有能够与α-胺基反应和交联的反应基团的形式，也包括含有能够与α-胺基反应和交联并接头连接的反应基团的形式。

在本发明中，能够与α-胺基反应并交联的反应基团的实例在类型方面没有特别限制，只要该反应基团可以与抗体重链或轻链n末端的α-胺基反应并交联即可。反应基团包括本领域已知的与胺基反应的所有类型的基团。反应基团可以是，例如异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰基叠氮化物基团、nhs酯基、磺酰氯基团、醛基、乙二醛基、环氧化物基团、环氧乙烷基团、碳酸酯基、芳基卤化物基团、酰亚胺酯基、碳二亚胺基团、酸酐和氟苯基酯基中的任何一种，但不限于此。

在本发明中，药物包括任何类型的药物，只要该药物可以治疗lrig-1抗体靶向的疾病即可，优选可以是免疫相关疾病的治疗剂，例如自身免疫疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应、哮喘、特应性疾病、急性或慢性炎性疾病等。

本发明还有一实施方式提供了用于预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含本发明提供的结合分子或抗体-药物偶联物(adc)作为活性成分。

本发明提供的结合分子，优选抗体可以激活免疫细胞中，特别是调节性t免疫细胞(treg细胞)的功能；增加treg细胞的数量；调节免疫耐受性，从而有效预防、改善或治疗免疫相关疾病。

在本发明中，“免疫相关疾病”可以是由各种免疫细胞和炎性细胞的过度活化和表达诱导的疾病。免疫相关疾病可以包括，例如自身免疫疾病；移植物抗宿主病；器官移植排斥；哮喘；特应性疾病或急性或慢性炎性疾病，但不限于此。

此外，在本发明中，“自身免疫病”可以是但不限于选自下组的一种或多种：类风湿性关节炎、全身性硬皮病、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、斑秃、哮喘、克罗恩病、贝塞特病、干燥综合征、格-巴二氏综合征、慢性甲状腺炎、多发性硬化症、多发性肌炎、强直性脊柱炎、纤维组织炎和结节性多发性动脉炎。

同时，在本发明中，“预防”可包括但不限于使用本发明的药物组合物阻断疾病的症状、或抑制或延迟症状的任何行为。

此外，在本发明中，“治疗”可以包括但不限于使用本发明的药物组合物来减轻或改善疾病症状的任何行为。

在本发明中，药物组合物可以表征为胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、软膏剂、粉剂或冲剂的形式，并且药物组合物可以表征为靶向人。

在本发明中，药物组合物可以按照常规方法分别制成口服制剂的形式，例如粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂和水性混悬剂，外用制剂，栓剂和无菌注射溶液剂的形式并使用。然而，药物组合物不限于此。本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，可以将粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、色素、调味剂等可用于口服给药；缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等可混合用于注射剂；基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等可以用于局部给药。本发明的药物组合物的制剂可以通过与上述的药学上可接受的载体混合以各种方式制备。例如，对于口服给药，可以将药物组合物制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式。对于注射，可以将药物组合物配制成单位剂量安瓿或多剂量的形式。或者，可以将药物组合物配制成溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂等。

同时，作为适合制备制剂的载体、稀释剂或赋形剂的实例，可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。此外，还可以包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。

本发明药物组合物的给药途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、局部、舌下或直肠途径。口服或胃肠外给药是优选的。

在本发明中，“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、囊内(intrabursal)、胸骨内、硬膜内、病变内和颅内注射或输注技术。本发明的药物组合物也可以采用栓剂的形式作直肠给药。

本发明的药物组合物可根据多种因素而变化，包括所用某种化合物的活性、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合以及要预防或治疗的某些疾病的严重性。药物组合物的剂量可以根据患者的状况、体重、疾病的严重程度、药物形式、给药途径和持续时间而改变，并且可以由本领域技术人员适当地选择。药物组合物可以采用每天0.0001至50mg/kg或0.001至50mg/kg的量施用。给药可以一天一次或一天几次。该剂量无意以任何方式限制本发明的范围。本发明的药物组合物可以配制成丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂或混悬剂的形式。

本发明的有益效果

本发明的lrig-1蛋白的特异性结合分子，优选抗体可以激活免疫细胞，特别是调节性t免疫细胞(treg细胞)的功能；增加treg细胞的数量；调节免疫耐受性，从而有效预防、改善或治疗由各种免疫细胞和炎性细胞的过度激活和表达所诱导的免疫相关疾病，例如自身免疫疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、哮喘、特应性疾病、或急性或慢性炎性疾病。

此外，本发明的lrig-1蛋白的特异结合分子，优选抗体具有以下优点：与以前市售可得的抗lrig-1抗体相比，该结合分子能够更有效地靶向lrig-1蛋白，并且具有非常好的结合能力。

附图简述

图1示出了本发明一实施方式的lrig-1蛋白的结构。

图2示出了本发明一实施方式的lrig-1蛋白的结构。

图3示出了本发明一实施方式的lrig-1蛋白的表位的预测结果。

图4示出了本发明一实施方式的lrig-1蛋白的表位的预测结果。

图5示出了本发明一实施方式的lrig-1mrna的表达水平。

图6示出了本发明一实施方式的lrig-1mrna的表达水平。

图7示出了本发明一实施方式的lrig-1mrna的表达水平。

图8示出了本发明一实施方式的lrig-1、lrig-2和lrig-3mrna的表达水平。

图9示出了本发明一实施方式的通过比较调节性t细胞和非调节性t细胞中lrig-1蛋白的表达水平获得的结果。

图10示出了本发明一实施方式的lrig-1蛋白在调节性t细胞表面的表达。

图11示出了本发明一实施方式的通过分析lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)与lrig-1蛋白的结合能力获得的结果。

图12示出了本发明一实施方式的通过分析lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)在调节性t细胞中调节lrig-1蛋白诱导stat3磷酸化的机制而获得的结果。

图13示出了本发明一实施方式的lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)对自身免疫疾病的治疗作用的实验设计。

图14示出了本发明一实施方式的通过分析lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)对自身免疫疾病的治疗作用所获得的结果。

发明详述

本发明一实施方式提供了选自以下(1)至(4)的结合分子：

(1)结合分子，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含seqidno:5所示的重链cdr1、seqidno:6所示的重链cdr2和seqidno:7所示的重链cdr3；所述轻链可变区包含seqidno:8所示的轻链cdr1，seqidno:9所示的轻链cdr2和seqidno:10所示的轻链cdr3；

(2)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有seqidno:13所示的重链cdr1、seqidno:14所示的重链cdr2和seqidno:15所示的重链cdr3；所述轻链可变区含有seqidno:16所示的轻链cdr1、seqidno:17所示的轻链cdr2和seqidno:18所示的轻链cdr3；

(3)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有seqidno:21所示的重链cdr1、seqidno:22所示的重链cdr2和seqidno:23所示的重链cdr3；所述轻链可变区含有seqidno:24所示的轻链cdr1、seqidno:25所示的轻链cdr2和seqidno:26所示的轻链cdr3；

(4)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有seqidno:29所示的重链cdr1、seqidno:30所示的重链cdr2和seqidno:31所示的重链cdr3；所述轻链可变区含有seqidno:32所示的轻链cdr1、seqidno:33所示的轻链cdr2和seqidno:34所示的轻链cdr3。

下文将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地描述本发明，并且本领域技术人员会明白，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例

制备例1.t细胞亚群细胞培养

为了鉴定lrig-1蛋白是否仅在调节性t细胞(treg)中表达，制备了t细胞的亚群th0、th1、th2、th17和itreg。与天然分离的ntreg不同，itreg指的是在含有以下组成的培养基中人工诱导分化的细胞。

首先分离从小鼠脾脏获得的幼稚t细胞，使得含有10％胎牛血清(fbs；海克隆公司-hyclone，洛根，犹他州)的rpmi1640(invitrogengibco，格兰德岛，纽约州)营养培养基进一步包含下表1的各个成分，并在37℃，5％co2的培养箱中进行72小时培养，从而诱导t细胞的亚群分化为相应的细胞。

[表1]

[实施例1]lrig-1的结构分析

lrig-1蛋白胞外域的三维空间结构预测会产生lrig-1蛋白(调节性t细胞的表面蛋白)的特异性抗体。

首先，为了预测表位的碱基序列，利用uniprot(http://www.uniprot.org)和rcsb蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)的工具预测lrig-1蛋白的胞外域(ecd)的三维空间结构，从而确定ecd的结构。然后，结果示于图1和2。

如图1所示，在lrig-1蛋白的胞外域的lrig-lrr结构域(第41至494位的氨基酸序列)中总共存在15个富含亮氨酸区域，lrr1至lrr15。每个lrr结构域由23至27个氨基酸组成，其中存在3至5个亮氨酸。

此外，如图2所示，在lrig-1蛋白的胞外域中，lrig-1蛋白的494至781位的氨基酸序列中存在三个免疫球蛋白样结构域。

[实施例2]lrig-1表位氨基酸序列的预测

利用ellipro服务器(http://tools.iedb.org/ellipro/)进行上述碱基序列的预测，该服务器是基于lrig-1蛋白结构的表位预测软件。利用ellipro搜索引擎因为它对应于已有的预测表位算法中已知的最可靠搜索引擎。

将实施例1中分析的胞外域输入表位预测软件，所预测表位的连续或不连续氨基酸序列示于图3和4。

如图3和4所示，预测了总共22个连续的表位氨基酸序列，预测了总共8个不连续的表位氨基酸序列。

[生产实施例1-4]lrig-1蛋白的单克隆抗体的产生

产生了本发明的lrig-1蛋白的特异性抗体。本发明的抗体不是通过特定的表位产生的，而是作为能够结合lrig-1蛋白上任何位点的抗体产生的。

为产生抗体，产生了表达lrig-1蛋白的细胞。更具体地，将对应于seqidno:2的dna片段和pcdna(hygro)用切割酶切割，37℃下孵育，并连接以产生其中插入了lrig-1蛋白的dna序列的pcdna。通过转染将由此产生的插入seqidno:2的pcdna导入l细胞，从而lrig-1蛋白能够在l细胞的表面表达。

从人scfv文库中选择能够结合在细胞表面表达的lrig-1的轻链和重链氨基酸序列，从而选择了总共八个重链和轻链。

将所选的重链和轻链氨基酸序列与mlgg2afc区融合，以产生单克隆抗体。单克隆抗体的序列显示在下表2中。

[表2]

[实施例3]鉴定调节性t细胞中lrig-1mrna的特异性表达

验证了lrig-1蛋白是否可以作为调节性t细胞的生物标志物。

为进行验证，采用磁激活细胞分选方法(macs)，通过cd4珠从小鼠脾脏中分离cd4⁺t细胞。随后，使用cd25抗体，采用荧光激活细胞分选仪(facs)分离调节性t(cd4⁺cd25⁺t)细胞和非调节性t(cd4⁺cd25^-t)细胞。对于各个细胞和在制备实施例1中分化的细胞，使用trizol提取mrna，并按照制造商提供的方案使用gdna提取试剂盒(凯杰公司)从基因组rna中去除gdna。通过bdsprintcdna合成试剂盒(克隆技术公司)将去除gdna的mrna合成为cdna。

进行实时聚合酶链式反应(rtpcr)以定量鉴定cdna中lrig-1mrna的表达水平。

按照制造商提供的方案，使用sybrgreen(分子探针公司)，利用下表3所示的引物进行实时聚合酶链式反应，该条件包括95℃、3分钟，61℃、15秒，72℃、30秒钟，40个循环，使用δδct方法计算相对基因表达水平，并使用hprt标准化。结果示于图5至8。

[表3]

从图5可以看出，lrig-1在调节性t(cd4⁺cd25⁺t)细胞中的表达比非调节性t(cd4⁺cd25^-t)细胞高18.1倍。这比以前已知的调节性t细胞标记物lag3和ikzf4的表达水平高约10倍。此外，如图6和7所示，与其它类型的免疫细胞相比，lrig-1mrna在调节性t细胞中的表达显著较高，特别是，与诱导的调节性t细胞(itreg细胞)相比，在天然分离的调节性t细胞(ntreg)中显著较高。

此外，如图8所示，在对应于lrig家族的lrig-1、lrig-2和lrig-3中，lrig-1的表达最高。

从以上结果可以看出，本发明的lrig-1蛋白在调节性t细胞，特别是天然存在的调节性t细胞中特异性表达。

[实施例4]鉴定调节性t细胞中lrig-1蛋白的特异性表达

确定从lrig-1mrna表达的lrig-1蛋白是否仅在调节性t细胞中特异性表达。

使用foxp3-rfp-敲入小鼠，通过将红色荧光蛋白(rfp)与foxp3启动子(调节性t细胞的特异性转录因子)偶联而获得的foxp3-rfp，采用磁激活细胞分选方法(macs)，利用cd4珠从小鼠脾脏中分离cd4⁺t细胞。随后，使用rfp蛋白，通过荧光激活细胞分选仪(facs)进行分离，从而获得了调节性t(cd4⁺rfp⁺t)细胞和非调节性t(cd4⁺rfp^-t)细胞。用购买的lrig-1抗体染色各细胞，用同型匹配的对照抗体染色阴性对照，从而利用荧光激活细胞分选仪测量lrig-1的表达水平。结果示于图9。

如图9所示，虚线指示的非调节性t细胞显示出与阴性对照几乎相同的lrig-1表达水平，而在调节性t细胞中存在大量具有高lrig-1表达水平的细胞。

从以上结果可以看出，本发明的lrig-1蛋白在调节性t细胞中特异性表达。

[实施例5]鉴定调节性t细胞表面的lrig-1蛋白的特异性表达

出于以下观点，即，为了成为细胞疗法的靶标，必须在调节性t细胞的表面表达lrig-1蛋白，从而可以更有效地进行靶标治疗，确定了lrig-1蛋白是否在调节性t细胞表面表达。

使用抗cd4-apc和抗lrig-1-pe抗体对制备例1的各个分化的t细胞亚群进行染色，并利用荧光激活细胞分选仪(facs)检测各细胞表面的lrig-1表达水平。结果示于图10。

如图10所示，lrig-1在活化t细胞、th1细胞、th2细胞、th17细胞和幼稚t细胞中的表达量为0.77至15.3，而lrig-1在分化诱导t细胞(itreg细胞)中的表达量高达83.9。

从以上结果可以看出，本发明的lrig-1蛋白不仅在调节性t(treg)细胞中特异性表达，而且特别是在treg细胞表面上以较高水平表达。

[实施例6]评估本发明抗体与lrig-1蛋白的结合能力

为了鉴定在生产实施例1至8中生产的本发明单克隆抗体是否很好地识别lrig-1，将生产实施例1至8中的每种抗体与稳定表达lrig-1的l细胞结合。然后，向其中添加与eflour670偶联并能够识别小鼠抗体的二抗，然后采用facs分析单克隆抗体与lrig-1蛋白的结合能力。结果示于图11中。

如图11所示，发现本发明的所有lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)有效识别并结合存在于l细胞表面的lrig-1蛋白。

[实施例7]本发明的抗体对treg细胞中信号转导途径的调节

为了分析在生产实施例1至8中生产的本发明单克隆抗体如何通过lrig-1蛋白影响treg细胞中的信号转导途径，通过用生产实施例1至8的抗体处理treg细胞来刺激treg细胞表面存在的lrig-1，然后通过磷酸酪氨酸免疫印迹分析经刺激的treg细胞中存在的stat3蛋白的酪氨酸磷酸化水平。结果示于图12。

如图12所示，发现本发明的lrig-1蛋白的特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)将stat3的磷酸化增加到与th17细胞相同的水平。

[实施例8]本发明抗体对自身免疫疾病的疗效

为了鉴定在生产实施例1至4中生产的本发明的单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)对自身免疫疾病的治疗作用，给rag-1-^/-小鼠过继转移cd45rb(高)细胞，从而诱发炎性肠病(ibd)，这是一种自身免疫性疾病。然后，腹膜内注射200μg/小鼠的生产实施例1至4的抗体，然后分析其对自身免疫疾病的治疗效果。结果示于图13。

如图13所示，发现本发明的lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)显著抑制了炎性肠病诱导小鼠的体重减轻作用。

由此可见，本发明的lrig-1蛋白特异性单克隆抗体能够有效地预防、改善或治疗免疫相关疾病，例如自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥、哮喘、特应性疾病、或急性或慢性炎性疾病，这些疾病是由各种免疫细胞和炎性细胞的过度激活和表达引起的。

尽管上面已经详细描述了本发明，但是本发明的范围不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离权利要求中描述的本发明的技术构思的情况下，可以进行各种修改和改变。

工业适用性

本发明涉及能够与富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白特异性结合的结合分子及其应用，该蛋白是存在于调节性t细胞(treg细胞)表面的蛋白，具体而言，预防或治疗免疫相关疾病，例如自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥、哮喘、特应性疾病或急性或慢性炎性疾病。

序列表

序列表

<110>古德t细胞有限公司

<120>lrig-1蛋白的特异性结合分子及其用途

<130>dpb172433.k01

<150>kr10-2017-0049854

<151>2017-04-18

<160>52

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<213>智人(homosapiens)

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354045

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130135140

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