新型肽及其在诊断中的应用的制作方法

本发明涉及来自幽门螺杆菌(helicobacterpylori)的caga蛋白的新型肽。该肽可用于细菌感染的改进的预防、诊断和治疗以及胃癌风险的评估。

背景技术：

幽门螺杆菌是一种通常在胃中发现的细菌。一些幽门螺杆菌(h.pylori)菌株携带编码毒力因子的caga(cytotoxicity-associatedantigena，细胞毒性相关抗原a)基因。caga基因编码作为细菌癌蛋白的1140至1180-氨基酸蛋白caga，该细菌癌蛋白在感染部位移位到胃上皮细胞中。在移位后，其会影响上皮细胞的细胞内信号通路。

携带caga基因的幽门螺杆菌细菌与胃癌发展的风险增加相关，而且抗caga抗体的存在与未来胃癌风险的增加相关。早期检测到caga+幽门螺杆菌感染可促使癌症存活期延长，因为在被感染的个体中消除感染降低了胃癌的风险。因此，识别携带caga+幽门螺杆菌的个体的方法可以用于诊断高胃癌风险，并因此有助于预防胃癌的发展。

但是，针对caga+幽门螺杆菌感染的现有的血清学方法在临床上并不起作用，主要是因为这些方法的特异性不够。即使在未感染幽门螺杆菌的个体中，或在感染缺乏caga的幽门螺杆菌菌株的个体中，也存在表明对caga具有广泛的抗体活性的大量的假阳性样本。因此，特异性和敏感度不足以用于临床上的有效诊断测试(yamaokaetal,jclinmicrobiol1998:36:3433；yamaokaetal,gastroenterology1999:117:745；figueiredoetal,jclinmicrobiol2001:39:1339)。

因此，需要具有改善的诊断特性(例如改善的特异性和敏感度)的针对caga+幽门螺杆菌的诊断测试。

此外，不同幽门螺杆菌分离株之间的dna序列有很大的差异。某些caga变体与胃癌风险的相关性更高。因此，能够识别caga菌株类型也是有用的。

还需要特异性结合抗体、特别是结合caga蛋白的抗体的caga肽。

技术实现要素：

本文提供了有关来自caga的肽的信息，其可用于与幽门螺杆菌相关的疾病有关的诊断应用，包括识别处于胃癌发生高风险的个体。幽门螺杆菌感染的个体将产生针对幽门螺杆菌蛋白质的抗体，其包括caga。因此，caga特异性抗体的存在表明幽门螺杆菌感染。

从感染的个体中存在的所有caga肽中，我们已经1)定义了哪个子集是免疫原性的并引发抗体应答(参见表1，其中蛋白质长度的34％是免疫原性的)。已发现，许多肽也与未感染的患者的血清反应(图1中的白条)。在免疫原性肽的子集中，我们确定了2)具有诊断能力的较小的肽子集；最后，在诊断肽的这一子集中，我们已经3)确定了具有最高诊断能力的肽所共有的关键氨基酸序列。换言之，诊断能力不仅源于被感染的个体中是肽的存在/不存在，而且关键地还源于始终引发未被感染的个体中不存在的抗体应答的免疫原性肽的仅仅一个小子集。

通过利用高精度的血清学检测方法，在肽水平而非蛋白质水平上的解析，我们确定了仅在携带caga+幽门螺杆菌的个体中对其具有强抗体应答的肽，而排除了由于在肽缺乏caga+幽门螺杆菌感染的个体中的交叉反应抗体应答而引起假阳性的肽。因此，我们已经确定的诊断肽同时具有高的灵敏度和特异性，如通过rocauc值确定的那样，将对诊断应用有效。

在本发明的第一方面，提供了一种肽，该肽包括一种氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由seqidno1至seqidno7组成的组。优选地，所述肽由最多25个氨基酸组成，更优选地由15个氨基酸组成，甚至更优选由最多10个氨基酸组成。在一个优选的实施例中，该肽包括一种氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由seqidno2-7组成的组，或更优选地选自由seqidno2-5组成的组。

这些新型的肽的优点在于：它们可以用于诊断，更具体地，用于诊断caga阳性的幽门螺杆菌。因此，使用这些肽的诊断导致很少的假阳性。

已确定的最小结合区也可用于检测caga特异性抗体。由于它们很短，因此背景结合(backgroundbinding)会很低。此外，这些肽较短，因此可以低成本地制造。

在本发明的第二方面，提供了根据本发明的第一方面的肽在诊断中的应用。在一个优选的实施例中，诊断是幽门螺杆菌感染的诊断，更具体地为caga阳性的幽门螺杆菌，或用于胃癌的风险的预测。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，其包含根据本发明的第一方面的肽或根据本发明的第二方面的肽的混合物。该试剂盒优选是用于诊断的试剂盒，更具体地，是用于诊断caga阳性的幽门螺杆菌的试剂盒或用于预测胃癌的风险的试剂盒。

在本发明的第四方面，提供了一种诊断方法，该方法包括以下步骤：a)从受试者中分离或提供样品，b)使所述样品与本发明所述的肽或本发明所述的肽的混合物接触，和c)检测样品中的抗体与肽的特异性结合。在一个优选的实施例中，该方法用于检测幽门螺杆菌感染或预测胃癌的风险。

在本发明的第五方面，提供了一种预防受试者中的胃癌的方法，其包括以下步骤：1)进行本发明所述的诊断，和2)治疗受试者中的幽门螺杆菌caga+感染。该方法可以包括以下步骤：使用本文的诊断方法确定受试者患有幽门螺杆菌感染，并随后治疗该感染。该治疗可涉及施用选自一类抗生素中的一种抗生素，该类抗生素选自由大环内酯类、β-内酰胺类、硝基咪唑类、四环素类和氟喹诺酮类组成的组。该治疗可涉及施用来自所述类别的两种抗生素，其中，这两种抗生素来自不同类别。该治疗还可以包括向受试者施用质子泵抑制剂，优选与抗生素组合。

在本发明的第六方面，提供了一种检测来自受试者的样品中的幽门螺杆菌caga结合抗体的方法，该方法包括使生物样品与根据本发明的第一方面的肽接触和检测样品中的抗体与肽的结合。样品可以是血液、血清、血浆样品或组织样品，例如胃组织样品。

在本发明的第七方面，提供了根据本发明的第一方面的至少两种肽的混合物。这样的混合物的优点在于，其可以以有效的方式用于检测幽门螺杆菌的两个或更多个不同的caga阳性菌株。该混合物可以与本发明所述的肽相同的方式使用。

附图说明

图1：使用肽微阵列分析确定caga的18个不同的线性b细胞表位。每个肽(n＝1172个肽)的阵列得分显示为caga序列(x轴)中起始位置处的竖直条。黑色条是来自感染幽门螺杆菌的个体的血清的结果，白色条是来自未感染幽门螺杆菌的个体的血清的结果。重要的是，许多肽也显示出与未感染的个体(白色条)的血清的反应性。

图2：从18个确定的caga表位(n＝1144肽)测试的所有肽的rocauc水平。图2a：以箱形图显示的结果，包括中间值、四分位范围和异常值。图2b：示出了每个单独的肽的结果，按表位分组。在2a和2b中，无用诊断的auc(auc＝0.5)用水平虚线表示。

图3：包含关键序列基序的所有肽的rocauc得分。数据作为中间值、四分位范围和异常值显示。如果仅测试一种肽，则仅显示中间值(水平线)。序列基序名称与表4的序列名称相同：

bt_300:iinqkvtdkvdnlnq(seqidno13)(15个氨基酸中至少12个相同，n＝298个肽)；

bt_301:epiya(seqidno8)(n＝270)；

bt_302:epiyak(seqidno9)(n＝16)；

bt_303:epiyaq(seqidno10)(n＝21)；

bt_304:epiyt(seqidno11)(n＝21)；

bt_305:epiyat(seqidno12)(n＝196)；

bt_306:fxlkrhx(seqidno1)(n＝246)；

bt_307:fxlkkhx(seqidno2)(n＝34)；

bt_308:fxlkqhx(seqidno3)(n＝1)；

bt_309:yxlkrhx(seqidno4)(n＝3)；

bt_310:ixlkrhx(seqidno5)(n＝1)；

bt_311:fxlrryx(seqidno6)(n＝1)；

bt_312:fxlrrsx(seqidno7)(n＝7)。

auc＝0.5表示为水平虚线。

具体实施方式

在本发明中，有时称为序列间隔。这是指间隔中的所有序列，因此，例如“seqidno2至seqid5”是指seqidno2、3、4和5。使用氨基酸残基的标准单字母注释来写序列。氨基酸残基优选与肽键连接。

本文的一些肽可具有序列可变性。因此，某些序列可以指定序列中的位置，其可以是任何氨基酸。这可以用x表示，或者在序列表中用xaa表示。x或xaa可以由任何氨基酸、优选任何l-氨基酸替换，包括由翻译后修饰产生的氨基酸，例如瓜氨酸。该氨基酸不必是天然存在的氨基酸。优选氨基酸不具有体积较大的侧链，因为体积较大的侧链可能阻碍抗体结合。氨基酸的合适分子量可以是85d至300d，更优选89d至220d。

通常，该肽可以包括氨基酸序列或由氨基酸序列组成，该氨基酸序列选自由seqidno1至seqidno330组成的组。该肽可包括seqidno32至seqidno330的序列的部分，例如，seqidno32至seqidno330的残基中的12个、更优选13个、甚至更优选14个、最优选全部15个。当肽包括seqidno32-330的氨基酸中的12、13或14个或由它们所组成时，其他氨基酸位置可以由任何氨基酸替换(类似以上针对x和xaa描述的)，而其余的氨基酸具有在seqidno32-330中的位置。在某些实施例中，氨基酸可以以保守的方式被替换，其中例如疏水性氨基酸被不同的疏水性氨基酸替代，或者其中极性氨基酸被不同的极性氨基酸替代。

在一些实施例中，包括seqidno32至seqidno330中的氨基酸序列(表2和3)或由它们组成的肽可以是优选的。在一个实施例中，使用了包括seqidno14至seqidno31中的一个或由其组成的肽。在一个实施例中，使用了包括seqidno32至seqidno207中的一个或由其组成的肽(表2)。在一个实施例中，使用了包含seqidno208-330中的一个或由其组成的肽(表3)。

在一个优选的实施例中，使用了包含seqidno1至seqidno13中的一个或由其组成的肽，例如，seqidno1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13(表4)。这些序列包含某些抗体的最小结合区。在一个优选的实施例中，该肽包含选自seqidno1至seqidno12的氨基酸序列或由其组成。

在一个甚至更优选的实施例中，该肽包含选自seqidno1至seqidno7的序列或由其组成。这些肽具有诊断准确性更高的优点，因为它们在高百分比例的携带caga+幽门螺杆菌感染的个体中引发强烈的抗体应答。这些肽(seqidno1至seqidno7)均涉及相同的表位(表位12和14)，并且全世界所有caga+幽门螺杆菌分离株的约95％携带这些序列变体中的至少一种。此外，这些肽在以下方面具有共同的结构特征：

·它们都有七个氨基酸残基。

·它们都在第一个位置(f，y或i)具有疏水性残基。

·它们都在第二个位置具有x。

·它们都在第三个位置具有l。

·它们都在第四位置具有k或r(正侧链)，

·它们都在第七个位置具有x。

包含seqidno1至seqidno7的有效的肽的实例包括但不限于序列seqidno129至seqidno170、seqidno186至seqidno187和seqidno266至seqidno279。

在一个甚至更优选的实施方式中，该肽包括选自seqidno1、2、3、4和5的序列或由其组成，或者甚至更优选地包括选自由seqidno2、3、4、5、6和7组成的组中的一个或多个序列或由其组成，或甚至更优选地包括选自由seqidno2、3、4和5组成的组中的一个或多个序列或由其组成。包含这些序列的有效肽的实例在表2和3中描述。

在一个实施方式中，该肽包括seqidno13的序列或由其组成，或者包括选自该序列的十二个氨基酸残基的序列或由其组成，其中，如上所述地，其他三个氨基酸残基可以是任意的氨基酸。包括来自seqidno13的至少十二个氨基酸的有用氨基酸序列包括但不限于序列seqidno52至seqidno67以及seqidno235至seqidno256。

在一个实施方式中，该肽包括seqidno153的序列或由其组成，或者包括选自该序列的12、13或14个氨基酸的序列或由其组成，其中，如上所述地，其他氨基酸残基可以是任意的氨基酸。

该肽优选具有25个氨基酸或更短的长度，例如20或15个氨基酸。更短的肽可能是理想的，因为其会导致较少的非特异性结合(通过抗体)并因此导致较少的背景。然而，在某些情况下，更长的肽可能是期望的，从而能够暴露表位以在没有空间阻碍的条件下允许抗体结合，或用于肽折叠。因此，该肽更优选为14个氨基酸残基，更优选为13个氨基酸残基，甚至更优选为12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基(6个仅适用于seqid8、11、9、10和12，而5个仅适用于seqidno8和11)。

优选地，该肽特异性地(在免疫学意义上)并且以高亲和力结合抗体，优选还与幽门螺杆菌caga蛋白结合的抗体。如果抗体-肽相互作用与特定细胞或物质以比与替代的细胞或物质更高的频率、更快的速度、更持久的持续时间和/或更高的亲和力反应或缔合，则在免疫学意义上称其表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体以比其结合其他物质更大的亲和力、活动性，更容易和/或以更长的持续时间结合，则其“特异性地结合”或“优先地结合”于肽。结合可以通过任何合适的方法来确定。结合可以通过本领域已知的方法来确定，例如elisa、表面等离子体共振、蛋白质印迹或本文所述的其他方法(参见下文)。这样的方法可以用于确定肽的适宜长度或氨基酸序列。

优选地，使用的肽具有高诊断特异性和高诊断敏感度。在任何诊断测试中，这两个属性取决于什么水平被用作阳性测试的截止点(cut-off)。为了与设定的截止点无关地评估诊断准确性，可以使用受试者操作者特征曲线(receiveroperatorcharacteristiccurve)(roc曲线)。在roc曲线中，随着截止点从0到无穷大变化，真阳性率(敏感度)相对于假阳性率(1-特异性)制图。于是，将roc曲线下的面积(rocauc)用于估计总体诊断准确性。优选地，所使用的肽具有至少0.55的rocauc，例如至少0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99的rocauc或1.00的rocauc。优选地，所使用的肽的rocauc至少为0.85，最优选rocauc为1。

如本文所用，术语“肽”用于表示肽、蛋白质、蛋白质片段等，包括肽模拟物化合物。术语“肽模拟物”是指肽样分子，其具有在结构上所基于的肽的活性，该活性是与结合到caga蛋白的抗体的特异性且高亲和力的结合。这类拟肽包括化学修饰的肽、含有非天然存在的氨基酸的肽样分子(例如参见，goodmanandro,peptidomimeticsfordrugdesign,in“burger'smedicinalchemistryanddrugdiscovery”vol.1(ed.m.e.wolff；johnwiley&sons1995),pages803-861)。多种肽模拟物是本领域已知的，包括例如包含受限的氨基酸的肽样分子。在某些实施方式中，可以使用环状肽。

所述肽可以是分离的肽，意为以不同于其天然存在形式的肽，例如在缓冲液中、以干燥形式等待重构、作为试剂盒的一部分等等。

在一些实施方式中，肽是基本上纯化的，意指基本上不含与其天然缔合的其他蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸和其他生物材料的肽。例如，基本上纯的肽可以为干重的至少约60％、优选为干重的至少约70％、80％、90％、95％或99％。

本发明的肽可以是以盐的形式。能够与肽成盐的合适的酸和碱是本领域技术人员所熟知的，包括无机和有机的酸和碱。

该肽可以以溶液(例如水溶液)的形式提供。这类溶液可以包含合适的缓冲剂、盐、蛋白酶抑制剂或本领域已知的其他适宜的组分。

所述肽可以与本领域中已知的一个或多个额外的部分缔合(例如，直接或间接地偶联、融合或连接)。这些部分的非限制性实例包括肽或非肽分子，例如生物素、多聚组氨酸标签(polyhistag)、gst、flag标签或连接剂或间隔剂。该缔合可以是共价键或非共价键。缔合可以是例如通过末端半胱氨酸残基或化学反应性连接剂、生物素-亲和素系统或多聚组氨酸标签。例如，该肽可以通过肽键与单个生物素缀合的赖氨酸残基连接，其中赖氨酸通过其侧链上的ε氨基被生物素化，例如肽的实例h-xxxxxxxxxxxxxxx(k(biotin))-nh2，其中，x表示肽的氨基酸。

缔合的部分可用于附接或连接肽，以改善纯化、增强肽在宿主细胞中的表达、辅助检测、使肽稳定等。在短肽附接到基底(例如固相)上的情况下，可能需要使用连接剂或间隔剂以确保肽暴露于抗体，以使抗体可以结合。

该肽可以与固定该肽的基底缔合。基底可以是例如固体或半固体载体、固相、支撑物或表面。肽可以固定在固体支撑物上。示例包括珠或板(例如微量滴定板，例如96孔板)中的孔，并且还包括芯片实验室(lab-on-a-chip)诊断或类似设备的表面。缔合可以是共价的或非共价的，并且可以通过与能够实现共价或非共价结合的肽缔合的部分来促进，例如对附着于载体、固相、支撑物或表面的组分具有高亲和力的部分。例如，可以使用生物素-亲和素系统。

该肽可用于检测来自受试者的样品中的幽门螺杆菌caga特异性抗体，所述方法包括使生物样品与本文所述的肽接触并检测样品中的抗体与该肽的结合。该肽可以与固定该肽的基底缔合，如本文所述，例如连接至固体支撑物。该方法可以包括允许结合的培养、洗涤和检测本文所述的抗体。用于检测抗体结合的方法描述如下，包括例如elisa。

所述肽可用于诊断，特别是幽门螺杆菌的感染或胃癌的诊断。众所周知，caga幽门螺杆菌感染与胃癌风险增加相关。因此，该肽可用于评估受试者患胃癌的风险。发生胃癌的风险可包括从无胃癌发展为任何阶段的胃癌、从良性疾病状态发展为恶性状态或从恶性程度较低的状态发展为恶性程度较高的状态的风险。因此，该风险可以包括在未来患有胃癌或发展为胃癌的风险。在一个优选的实施方式中，该肽用于评估受试者在未来患有胃癌的风险。该肽还可以用于诊断与幽门螺杆菌感染相关的其他疾病，例如消化性溃疡疾病、消化不良和免疫性血小板减少性紫癜(itp)。

可以使用任何合适的方法进行诊断。在一个优选的方法中，使来自受试者的样品中的抗体与肽结合，并检测结合。受试者可以是人或动物，优选人。来自受试者的抗体与肽的体外结合表明该受试者的免疫系统已经产生了针对该特定肽的抗体，因此表明该肽以及caga幽门螺杆菌存在于受试者中。

该方法可以包括以下步骤：(1)从受试者中分离可能含有抗体的体液或组织的样品，或者在体外提供这种样品；(2)在有效形成特异性肽-抗体复合物(使肽与抗体特异性结合)的条件下，例如使样品和肽反应或培养，使样品与肽接触；和(3)分析接触的(反应的)样品中抗体-肽反应(例如确定抗体-肽复合物的量)的存在情况。该方法可以包括一个或多个洗涤步骤，如本领域中已知的。步骤2和3优选在体外进行，即，在从受试者中分离出样品之后使用该样品，在先前从受试者中分离出的样品中进行。

样品可以是任何合适的样品，例如血液、血清、血浆、唾液、粘膜分泌物、腹水或类似体液或组织的样品。

可以通过不同的免疫/血清学方法检测对肽的抗体应答。使用肽检测抗体存在的合适形式包括肽微阵列、elisa、色谱、蛋白质印迹、芯片实验室形式、基于微珠的单次或多次免疫测定等。

通常，这些方法包括证明结合至固定相(例如elisa板的孔或微珠的表面)的肽，然后将待被分析的样品加入到液相中，使抗体结合，然后洗去未结合的抗体。

可以通过使用与特定类型的人抗体(例如igg、iga、igg1、igg2或igg3、igg4)结合的、标记的第二抗体体外检测抗体结合。在elisa中，第二抗体用酶标记，例如辣根过氧化物酶(hrp)或碱性磷酸酶(ap)。第二抗体适宜来自人以外的其他物种，例如来自兔或山羊。

或者，可以使用荧光标记或放射性标记。

在elisa中使用的肽的方案，对于使用哪种第二抗体、其稀释度、缓冲剂、阻断液、洗涤液等，可以容易地由本领域技术人员优化。使用板的elisa方案示例的概述如下：用室温下溶解在pbs中的目标肽的最佳浓度(通过棋盘滴定法确定)涂敷聚苯乙烯微量滴定板。用pbs洗涤两次后，在37℃下用0.1％(wt/vol)牛血清白蛋白-pbs封闭孔30分钟。随后的培养在室温下进行，培养之间用含有0.05％吐温的pbs(pbs-tween)洗涤板3次。将血清或其他体液的样品以一式两份或一式三份的方式以例如1/10的初始稀释度添加，并以例如三倍稀释系列进行稀释。先前测试并发现具有针对肽的抗体的对照样品用作阳性对照。具有已知抗体浓度的样品可用于创建标准曲线。仅添加了pbs-吐温的孔用作确定背景值的阴性对照。在室温下培养90分钟后，添加hrp标记的兔抗人iga或igg抗体，并培养60分钟。然后在将h2o2和邻苯二胺二盐酸盐加入到0.1m柠檬酸钠缓冲液(ph4.5)中后，在分光光度计中读数板20分钟。确定每个样品的终点滴度作为倒数内插稀释度，其在450nm下的吸光度例如比背景高0.4。替代地，可以使用吸光度值作为最终的读出值。本领域技术人员了解到该elisa方案仅仅是示例，并且该方案的许多不同变体和变型均是可能的。

替代地，在一个实施方式中，从受试者分离b细胞，并分析细胞是否能够产生与肽结合的抗体。这可以通过使用elispot方法、als(淋巴细胞分泌中的抗体)或类似方法来完成。

还可以通过使用选自包括seqidno32-330、seqidno1-7，特别是seqidno2-5或由其组成的肽的特异性抗体来检测患者组织样品中caga蛋白的存在。样品优选是胃组织的样品。具有期望的结合特异性的抗体可以由本领域技术人员产生。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体，其中单克隆抗体是优选的。该抗体可以以任何有用的形式用于检测蛋白质，例如蛋白质印迹、elisa、免疫组织化学等。该抗体可以用于本文的诊断方法。

该方法可以导致两种可能的结果：存在幽门螺杆菌感染或不存在幽门螺杆菌感染。幽门螺杆菌感染可以例如根据测定中的信号切断来确定。可能还会有一个中间结果：需要进一步调查或重新采样或重新分析样品的不确定结果。

一旦确定存在caga+幽门螺杆菌感染，治疗幽门螺杆菌感染可能是有用的，例如为了降低受试者患胃癌的风险。可以通过本领域已知的方法进行治疗，例如使用抗生素。由于不同的原因，一些原因是胃中活性抗生素的低可用性以及抗生素的抗性问题，存在幽门螺杆菌感染的许多不同的抗生素治疗方案，并且这些方案的功效在世界不同地区通常有所不同。通常，治疗方案包括选自大环内酯类、β-内酰胺类、硝基咪唑类、四环素类和氟喹诺酮类的至少两种不同的抗生素，添加或不添加次枸橼酸铋钾，其中优选地从每组中选择一种抗生素。可以将一种或多种抗生素与质子泵抑制剂联合施用。一种治疗包括给予质子泵抑制剂奥美拉唑以及抗生素阿莫西林和克拉霉素7至14天。

因此，还提供了预防胃癌的方法，包括以下步骤：1)对受试者进行本文所述的诊断和2)治疗受试者的幽门螺杆菌感染。优选进行治疗以使受试者没有幽门螺杆菌感染。

一旦确定存在caga+幽门螺杆菌感染，进行进一步检查以评估早期或晚期胃癌的存在也可能有用。这可能与所有患者有关，但在已知或怀疑具有高胃癌风险的受试者(例如来自胃癌高风险国家的患者，吸烟的受试者，和/或已知有近亲已被诊断出患有胃癌的受试者)特别相关。可以通过胃镜进行此类检查，其中检视胃壁以评估是否存在胃癌。如果观察到胃肿瘤，则可以通过内窥镜切除术(如果处于早期)或通过手术(如果处于晚期)治疗肿瘤。

替代地，该方法可用作常规胃镜检查的后续措施。如果内窥镜检查和/或随后的组织病理学检查(例如通过升高的olga评分)发现胃中存在癌前状态，则该方法可用于告知进一步的患者处理。这可以是建议以适当时间间隔进行后续胃镜检查的形式。例如，如果已经确定存在caga+幽门螺杆菌感染，则与不存在caga+幽门螺杆菌感染相比，可有益于以更短的时间间隔进行后续胃镜检查。

可以通过本领域已知的方法合成肽。可以通过有机合成(例如固相合成)较纯地和大量地获得肽。肽合成的方法是本领域众所周知的，例如使用肽合成机器。当然，可以从肽合成公司订购肽。

肽也可以是动物、植物、细菌或病毒来源的。如本领域中已知的，然后可以从生物体中纯化肽。可以使用重组技术，例如使用真核细胞、细菌细胞或病毒表达系统来产生肽。详细信息请参见currentprotocolsinmolecularbiology,(ausubeletal,eds.,)johnwiley&sons,ny(currentedition)。

幽门螺杆菌在caga序列中显示出一些遗传多样性，因此可能期望使用可鉴定几种菌株的一种肽或一组肽。seqidno1至seqidno7代表这样的一组肽，因为世界上所有caga+幽门螺杆菌分离株的95％携带这些序列变体中的至少一种。因此，可能有用的是提供本发明肽(seqidno1-330)中的两种或更多种的混合物(“cocktail”)。在一个实施方式中，这种混合物包括选自包括seqidno1至seqidno13或由seqidno1至seqidno13组成的肽中的至少两个、优选三个、更优选四个、更优选五个、更优选六个或更优选七个肽。在一个实施方式中，该序列选自seqidno1至seqidno7。优选的混合物包括seqidno1、2、3、4、5、6和7，seqidno1、2、3、4和5，seqidno2、3、4、5、6和7以及seqidno2、3、4和5。seqidno1至seqidno5存在于所谓的cagaabc、abcc和abccc类型中，而seqidno6和seqidno7仅存在于abd类型中。因此，在一个实施方式中，一个序列选自seqidno1至5，并且一个序列选自seqidno6和7中的一个。seqidno6和7的肽对于亚洲的幽门螺杆菌菌株的诊断特别有用。

在另一个实施方式中，所述肽选自seqidno8至seqidno13的肽。

检测多于一种的幽门螺杆菌菌株的另一种有用的方法是使用包含存在于seqidno8、9、10和12中的基序epiya的肽。

一种或多种肽可以包括在试剂盒中。该试剂盒可以用于如本文所述的诊断。试剂盒可包括一种或多种肽或其混合物、结合缓冲剂和检测剂(例如第二抗体)。试剂盒可以包括固定肽的底物(例如固体支持物、例如微量滴定板、例如已经预先吸附有本发明的肽的elisa板)、各种稀释剂和缓冲剂、标记的缀合物或其他用于检测特异性结合的抗原或抗体的试剂(例如第二抗体)，以及其他产生信号的试剂(例如酶底物、辅因子和色原)。试剂盒的其他合适的组分可以通过本领域技术人员容易地确定。

实施例

实施例1

使用肽阵列实验(peptidearrayexperiments)，通过三步法鉴定了相关的caga-肽。通过将阵列与来自消化不良患者群体的幽门螺杆菌感染的和幽门螺杆菌未感染的个体的合并样品或单个血清样品一起培养，分析了肽的抗体结合特征。幽门螺杆菌感染的个体具有已知caga状态(caga基因存在/不存在)的感染。

如前所述(thorelletal,bmcevolbiol2016:16:53)，从马那瓜(尼加拉瓜)的个体获得血清样本，该个体由于消化不良而接受内窥镜检查。这些患者均具有已知的幽门螺杆菌感染状况，并且可获得其幽门螺杆菌分离株的基因组序列。

幽门螺杆菌的公开基因组序列获自ncbi。2013年8月从genbank下载了幽门螺杆菌的可用的完整基因组(n＝49)。去除了实验菌株b8、rif1、rif2、um298和um299，其余44个完整菌株用于比较基因组学。下载了如在2013-11-1的genbank中可获得的全基因组测序分离株，包含开放阅读框信息的所有分离株均被使用，但用于在动物中传代的菌株或实验衍生出的菌株除外。还使用了来自序列读取档案数据库(sequencereadarchivedatabase)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)在登记编号(accessionnumber)srp045449下的先前公开的尼加拉瓜基因组序列。

除了这些可公开可获得的基因组序列外，在澳大利亚分离的幽门螺杆菌菌株的序列是从barryjmarshall教授(universityofwesternaustralia,wa,australia)获得的。

为了鉴定可用基因组中推导的caga蛋白序列，使用来自菌株26695(nc_000915.1)的caga序列实施使用blastp的相似性搜索。在我们的基因组序列集合中，发现了245个菌株/分离株包含caga基因，并将这些分离株的所有推断出的caga蛋白序列用于后续分析。

实施例2

使用肽阵列分析测定了对caga-肽的抗体应答。使用激光打印合成技术打印中密度阵列。在这些芯片上，将大约8600个不同的15-氨基酸(15-mer)幽门螺杆菌肽点到每个芯片上。此后，将芯片与1/1000稀释的患者血清或1/1000稀释的10种不同血清样品的集合一起培养，然后洗涤并随后通过荧光染料缀合的兔抗人igg抗体进行培养。最后，进行荧光图像扫描和数字图像分析以检测与芯片上每种肽的抗体结合。芯片印刷和抗体分析由pepperprint公司(海德堡，德国)进行。

实施例3

高密度阵列是使用芯片上光刻合成技术(on-chipphotolithographicsynthesis)制成的。在这些实验中，将大约200000个不同的15-mer幽门螺杆菌肽点到每个芯片上。此后，将芯片与1/1000稀释的患者血清或1/1000稀释的10种不同血清样品的集合一起培养，随后洗涤并随后通过荧光染料缀合的兔抗人igg或兔抗人iga抗体培养。最后，进行荧光图像扫描和数字图像分析以检测与芯片上每种肽的抗体结合。芯片印刷和抗体分析由schafer-n公司(哥本哈根，丹麦)进行。

实施例4-caga的b细胞表位的鉴定

通过评估与重叠的15-mer肽和血清样品的集合的血清抗体结合来筛选整个caga序列。使用实施例2的中密度阵列，该阵列上点有覆盖整个caga序列的肽，具有10个氨基酸的序列重叠(n＝234个肽)。在后续实验中，使用实施例3的高密度阵列，具有覆盖整个caga序列的15-mer肽，但是这次具有14个氨基酸的序列重叠(n＝1172个肽)。在这两种情况下，幽门螺杆菌菌株26695都被用作caga肽序列的来源。在阵列上分别评估与每个肽的抗体结合，并使用两个血清集合(一个由来自10个幽门螺杆菌感染(hp+)的个体的集合血清而组成，而另一个由来自10个未感染(hp-)的个体的血清组成)。

将hp+血清集合的抗体结合与hp-集合的结合进行比较。线性b细胞表位定义为至少四个氨基酸的拉伸(stretch)，其中hp+组中的抗体结合比hp-组中的抗体结合高出至少2倍。通过这种方式，确定了幽门螺杆菌caga包含18个不同的线性b细胞表位，具有22个氨基酸的平均长度(表1和图1)。这些表位都可用于诊断caga+幽门螺杆菌感染。

表1

¹起点和终点位置是指在菌株26695的caga中的氨基酸位置。

实施例5-鉴定具有高诊断潜力的15-mercaga肽

测定各个血清样品的抗体与识别的表位的结合，以评估具有或缺乏caga+幽门螺杆菌的幽门螺杆菌感染的个体与针对不同表位的抗体反应的频率。由于18个表位各自跨越多于一个的15-mer肽，因此再次使用了重叠的肽，这一次在序列的肽之间具有10或11个氨基酸的重叠。此外，由于在不同的幽门螺杆菌分离株中的caga具有相当大的序列多样性，因此包括了每种肽的序列变体。因此，对于来自26695caga的每个重叠的15-mer肽序列，如果在我们的245个全球范围的caga序列数据库中发现一个序列变体至少存在两次，还使用该肽的每个可用的序列变体。总共，使用高密度阵列分析了18个已识别的表位中的1144个不同的caga肽和序列变体。每个肽都用来自具有或不具有caga+幽门螺杆菌感染的个体以及来自未感染对照的各个血清样品(n＝48)进行分析。

具有高频率的响应个体和强抗体结合的表位将适合用于诊断caga+幽门螺杆菌感染。先前已知的评估caga抗体的方法的一个问题是假阳性个体(即，在测试中呈阳性的未感染幽门螺杆菌的个体)的数量很高。因此，具有良好区分能力的那些肽得到鉴定：在具有caga+感染的个体中有较强的抗体应答，而在具有缺乏caga的感染的个体和未感染幽门螺杆菌的个体中只有最小的反应。

对使用roc曲线的肽的区分能力进行了分析，并将roc曲线的曲线下面积(auc)(rocauc)用作诊断能力的估计值。

来自18个已识别的caga表位的1144个不同肽(包括序列变体)的中间值rocauc为0.53(图2a)。由于rocauc为0.53非常接近掷硬币的诊断准确性(即，对诊断无用)，因此这突出了依赖于对整个caga蛋白的抗体应答的现有血清学检测的假阳性率高的问题。

在不同的表位中，rocauc分布不均，其中，表位3-4、8-14和17-18包含具有高诊断能力的肽中的大多数(图2b)。

在1144个肽中，鉴定出rocauc高于0.7的176个caga肽(表2)。这些肽中的每一个均可用于诊断幽门螺杆菌caga+感染。

表2

实施例6

即使rocauc小于0.7的诊断程序也可能具有诊断能力。为了对此进行评估，鉴定出一些肽，一致比例的caga+个体对这些肽具有抗体应答，但具有caga阴性菌株或缺乏幽门螺杆菌感染的个体中没有任何一个对这些肽具有这种抗体应答。以这样的方式，鉴定出rocauc小于0.7的123个肽，其真阳性率大于10％，假阳性率为0％(表3)。这些肽中的每一个也可用于幽门螺杆菌caga+感染的诊断。

表3

¹auc-受试者工作特性(roc)曲线的曲线下方面积。

²fpr-假阳性率(％)，基于所有测试的肽(n＝1144个肽)的第95个百分位数的截止值。

³tpr-真阳性率(％)，基于所有测试的肽(n＝1144个肽)的第95个百分位数的截止值。

实施例7-鉴定用于诊断caga+幽门螺杆菌感染的关键氨基酸序列

实施在被鉴定为高诊断性的肽中的幽门螺杆菌caga的b细胞表位的详细定位。该定位使用高密度肽阵列进行。针对与每个所选的肽的序列变体的抗体结合，测试各个血清样品(n＝48)。这样做是为了定位每个肽中有助于抗体结合的氨基酸位置，因此对于诊断应用而言包括该位置是至关重要。

我们选择了具有最高诊断潜力的肽，并且针对每个所选择的肽，我们创建了300种不同的序列变体。这是通过所谓的完整单残基取代而完成的。这意味着，对于每个肽的15个氨基酸位置中的每个位置，我们创建了20个不同的序列变体，这些变体仅在该位置的序列不同；在该位置，这20个变体具有20个不同的常见蛋白质氨基酸中的各一个。由于每个氨基酸位置有20个不同的序列变体，并且肽的长度为15个氨基酸，因此总共有300个不同的序列变体。先前已经描述了该过程(hansenetal,plosone2013:8(7):e68902)。该分析确定了肽中给定的残基位置对于肽与抗体的结合是否不重要，即天然序列中的氨基酸残基是否可以在不影响结合的情况下被自由地取代。

以这种方式，由48个血清样品中的每一个测试所选肽的所有变体的抗体结合。我们观察到了，哪些肽变体获得的rocauc得分明显/显著得低于原始肽，并且基于此信息，我们能够鉴定出对caga+幽门螺杆菌感染的区分能力至关重要的序列基序。

这揭示了肽的关键部分跨越5-6个氨基酸，并且在这些关键序列的某些位置上存在冗余。某些表位的关键序列在表4中示出，而它们的rocauc水平在图3中示出。表4的肽对于幽门螺杆菌感染和胃癌诊断和治疗(包括癌症的预防)特别有用，因为它们具有较高的特异性。

表4

¹“x”是指本文所述的任何一种氨基酸。

²auc表示为中间值，括号内为四分位数范围(n.a＝不适用)。

³测试的不同15-mer肽序列的数量。

⁴seqidno13的auc数据包括序列13的序列变体。该数据包括在15个氨基酸中的至少12个具有完全匹配的所有肽。