用于生产手性胺的方法与流程

本发明涉及用于使用转氨酶生物催化剂生产胺、更特别是手性胺的方法。
背景技术：
：胺并且特别是手性胺是许多制药应用、农业化学应用和化学应用中的关键结构单元。手性胺在制备各种生理活性物质，例如药物活性物质中是非常重要的。在许多应用中，仅一种特定的光学活性形式的手性胺，(r)或(s)对映体，具有期望的生理活性。(手性)胺可以通过化学合成路线和生物催化合成路线生产。用于合成光学活性手性胺的化学方法通常是具有挑战性的纯化操作的多步骤的过程。另一方面，通过一步法进行的手性胺的化学合成需要高化学控制、区域控制、非对映体控制和对映体控制。在过去的十年期间，与本领域已知的化学方法相比，使用转氨酶(ec2.6.1.x；也称为氨基转移酶)的生物催化合成路线已被认为是用于手性胺合成的非常强有力的方法。转氨酶(ta)是磷酸吡哆醛(plp)依赖性酶，并且在辅因子磷酸吡哆醛(其在反应期间连续再生)存在下，催化氨基基团(-nh2)从氨基供体(例如胺，比如2-丙胺)转移到前手性氨基受体，生成(手性)胺以及副产物。转氨酶(ta)催化的转氨反应在图1中示意性地示出。转氨酶，特别是(r)-和(s)-选择性转氨酶，作为用于生产手性胺的合适的催化剂已经因此受到了广泛的关注，因为它们允许从前手性氨基受体直接不对称合成(光学活性)手性胺。实际上，假如r1和r2不同(且不是-nh2)，则图1中所示的产生的胺(胺产物)是手性胺。尽管转氨酶催化的手性胺的合成存在较高的对映体选择性和区域选择性，但转氨反应是可逆反应，通常具有不利的热力学平衡，该热力学平衡比胺产物侧(即图1反应箭头的右侧)更有利于底物侧(即图1中反应箭头的左侧)，因此限制了获得高手性胺产率。因此，获得了包含手性胺产物和氨基供体的胺混合物，这需要进一步纯化手性胺。然而，由于通常在转氨过程中，氨基供体和形成的胺具有非常相似的特性(由于它们的主要官能团相似)，通常难以进一步分离它们。另外，转氨酶催化的手性胺合成容易受到底物和产物的抑制。底物溶解度问题也可能阻碍该反应。本领域中，已经提出了若干种方法来处理上述转氨反应的缺点。例如，在迄今为止报道的几乎所有转氨反应中，过量提供氨基供体以将反应的热力学平衡转移到胺产物侧。更特别地，与酮基底物相比，提供从5到100倍范围(或甚至更多)的过量氨基供体。然而，在反应完成后，过量的(未反应的)氨基供体被浪费，这涉及高的供体底物成本。在文献中，还描述了其他物理和化学策略(例如由guo等人在greenchem.[绿色化学],2017,19,333-360中总结的)。例如，在提供过量的氨基供体之后，通过去除形成的胺产物、副产物和/或通过进行生化级联反应，平衡可以转移到反应的胺产物侧。本领域中已经开发的其他手性胺合成路线基于底物与产物之间的不同的pka和疏水性进行底物和产物的分离，例如由rehn等人在j.biotechnol.[生物技术杂志],2014,179,50-55中和rehn等人在j.mol.catal.b:enzym.[b酶分子催化杂志],2016,123,1-7中描述的。例如，等人在org.processres.dev.[有机工艺研究与开发],2015,19(7),793-799中描述了与选择性溶剂萃取产物手性胺组合的酶法合成手性胺的工艺装置，该工艺装置包含通过支持性液膜分离的在不同ph下的所谓的反应相和所谓的反萃相。更特别地，研究了丙氨酸作为氨基供体用于在使用液膜萃取与酶级联的组合的原位产物去除(ispr)方法中还原胺化水难溶性酮(4-苯基-2-丁酮)。ispr策略通过一体的富集步骤(不需要任何额外的纯化步骤)有助于非常高(高于98％)的产物纯度，并消除了产物以及副产物的抑制。然而，对于使用异丙胺(ipa)作为氨基供体的反应，产物溶液受穿过膜的ipa污染，再次导致供体底物的损失和低的产物纯度。因此，尽管ipa通常更有利于反应平衡，但ipa反应需要进一步的下游操作，以得到如用ala所实现的相似的纯度。以此方式，用于获得足够量的所期望的手性胺的生产路线仍然复杂，这负面地影响了所形成胺产物的回收经济性。此外，本研究中使用的液膜装置不稳定，因为膜孔中的液体在操作期间容易泄漏，需要定期再生液膜。另外，该液膜装置对跨膜压差敏感。因此，该装置不太适合长期、大(工业)规模手性胺的合成和分离。例如，在us2009/0298134中描述了用于生产高产率对映体选择性氨基酸和手性胺的方法，该方法在转氨酶生物催化剂存在下使酮酸或酮和氨基酸供体反应以产生酮酸副产物和氨基酸或胺产物。酮酸副产物与过氧化物的进一步反应增加了额外的氨基酸或胺产物的产率。然而，这使得手性胺的生产复杂，这涉及相对较高的加工成本。技术实现要素：尽管本领域已经作出了努力，但仍需要提供用于生产胺，更特别是手性胺的改进的方法，这些方法使用转氨酶生物催化剂将热力学平衡转移到胺产物侧，从而避免氨基供体的损失。本发明的目的是提供此类方法，同时允许长期的、可扩展的应用。本发明的另一个目的是提供用于生产具有高产率和高产物纯度的手性胺的简化方法，这些方法与现有技术方法相比更有效且更具成本效益。因此，根据本发明的一个方面，提供了如所附权利要求中陈述的用于生产(光学活性)手性胺的方法。该方法包括以下步骤：在转氨酶的存在下，在第一溶液(或反应溶液)中进行前手性氨基受体(prochiralaminoacceptor)和氨基供体的转氨反应，从而在所述第一溶液中形成手性胺产物和副产物。氨基供体的分子量(mw)至少为150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)(称为高分子量(hmw)氨基供体)。可替代地，将氨基供体附在(affixedon)(连接到(linkedto)，固定在(immobilizedon))(化学惰性)支持物上，氨基供体和支持物的总分子量是至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)。氨基供体(或氨基供体和支持物一起)的高分子量有利地提供了在进行转氨反应之后对下游加工的改进。更特别地，由于氨基供体(或氨基供体和支持物一起)的hmw，仅有限的下游加工或者有利地甚至不进行进一步的下游加工要在进行转氨反应之后进行，以回收具有高产率和高产物纯度的胺产物。因此，与本领域中已知的方法相比，可以改进形成的胺产物的回收和纯化。有利地，过量地提供供体胺，从而将热力学平衡转移到转氨酶催化反应的胺产物侧。在所附权利要求中阐述了本发明的进一步有利的方面。因此，手性胺的生产方法是将第一溶液(或反应溶液)中的供体胺和前手性氨基受体之间的转氨酶催化反应与基于多孔膜的对产生的手性胺的分离相结合。有利地，基于膜的mwco(和/或孔径)选择膜，以仅使所形成的胺产物穿过膜。因此，使产生的手性胺穿过膜从第一溶液中选择性地去除，从而形成第二溶液(有利地是渗透物、或渗透物溶液)，同时，基于其(高)分子量，过量提供的供体胺、转氨酶、和形成的副产物保留在反应溶液中。因此可以形成具有高产物纯度的手性胺。因此，本发明的方面的方法允许将热力学平衡转移到转氨酶催化反应的胺产物侧，从而减少并且甚至避免过量提供的氨基供体的损失。因此，过量提供的氨基供体仍可用于进一步的转氨酶反应。以此方式，与现有技术方法相比，可以减少将反应的热力学平衡转移到胺产物侧所需的过量氨基供体的量，从而降低底物成本。实际上，与此相反，在现有技术中，过量的氨基供体在转氨反应期间/之后被浪费，因此必须定期提供过量的氨基供体以保持转氨酶反应持续进行，这涉及到高的供体底物成本。根据本发明的另一方面，提供了手性胺生产和分离装置(或设备)(4)，其包含：-用于保持氨基供体和前手性氨基受体的第一容器(5)，第一容器(5)与用于保持包含转氨酶的第一溶液(1)的酶罐(6)处于流体连接，以及用于将氨基供体和前手性氨基受体从第一容器(5)提供给酶罐(6)从而在罐(6)中的第一溶液(1)中形成手性胺和副产物的装置，有利地在第一容器(5)和酶罐(6)之间布置阀(12)；-任选地，用于保持惰性气体的第二容器(7)，其与酶罐(6)处于流体连接，以及用于向酶罐(6)提供惰性气体流的装置；-布置在酶罐(6)的下游的膜装置(8)，所述膜装置(8)与酶罐(6)处于流体连接，并且所述膜装置(8)包含由多孔膜(3)与第二区室(10)分离的第一区室(9)，有利地在酶罐(6)和膜装置(8)的(第一区室(9))之间布置(三通)阀(11)；-膜装置(8)的第一区室(9)被配置为从酶罐(6)接收第一溶液(1)(包含形成的手性胺)，第二区室(10)被配置为保持第二溶液(2)，有利地，第二溶液(2)是第一溶液的渗透物(或滤液)(所述渗透物通过使手性胺产物从第一溶液(1)渗透穿过多孔膜(3)而形成)；-用于回收(收集)包含形成的胺的第二溶液(2)(有利地是渗透物溶液)的第三容器(13)，所述第三容器(13)布置在膜装置(8)的下游，所述第三容器(13)与膜装置(8)的第二区室(10)处于流体连接，有利地，在膜装置(8)的(第二区室(10))和第三容器(13)之间布置用于控制第二溶液(2)的流速的装置(例如阀)；-任选地，用于将第一溶液(1)(有利地包含过量供体胺)从膜装置(8)的第一区室(9)再循环回酶罐(6)中的装置。有利地，该多孔膜是纳米过滤(nf)膜，有利地，是聚合物纳米过滤膜或陶瓷纳米过滤膜。有利地，该多孔膜针对氨基供体和转氨酶的mwco为至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)，和/或该多孔膜的孔的孔径范围为从0.5nm到100nm(有利地是从0.5nm到50nm，有利地是从0.5nm到20nm，有利地是从1nm到10nm)。有利地，手性胺生产和分离装置(4)包含用于对多孔膜(3)施加压力的装置。附图说明现在将参考附图更详细地描述本发明的方面，其中相同的附图标记展示了相同的特征，并且在附图中：图1示意性地表示转氨酶催化的转氨反应，由此氨基受体(底物酮)和氨基供体(底物胺)被转化为胺产物和副产物(酮)。假如r1和r2不同(并且不是氨基基团-nh2)，则胺产物是手性胺；图2示意性地表示本发明有利方面的膜装置(8)，其中多孔膜(3)分离含有第一溶液(1)的第一区室(9)和含有第二溶液(2)的第二区室(10)。第一溶液(1)是在例如(s)-立体定向性胺转氨酶(s-ata)存在下，氨基供体和前手性氨基受体(酮底物)之间发生转氨反应从而形成手性胺和副产物的反应溶液。第二溶液(2)有利地是通过使胺产物渗透穿过多孔膜(3)而形成的渗透物溶液。任何过量的胺供体被膜(3)截留；图3示意性地表示手性胺生产和分离装置(4)；图4.1显示了使用不同的氨基供体(图4.1的右侧)和获得的实验斜率(图4.1的左侧)时，转氨酶3hmu在37℃下在498nm处的吸光度随时间而增加；图4.2显示了使用不同的氨基供体(图4.2的右侧)和获得的实验斜率(图4.2的左侧)时，转氨酶3hmu在37℃下在498nm处的吸光度随时间而增加。在图4.2中，与图4.1相比，还包括ad5的结果；图4.3示意性地表示以ba为氨基受体并以peg-c(或ad6，参见表1)作为胺供体的模型转氨反应。图5.1显示了在转氨酶ta_3hmu存在下，分别使用氨基供体peg-a、peg-c、和ipa进行转氨反应时，苄基丙酮(ba)底物随时间的转化率；图5.2显示了在不同的ta-u3hmu负载量下，使用ad3(图5.2a)、ad6(图5.2b)或ipa(图5.2c)时，ba随时间的转化率；图5.3显示了使用ad3(图5.3a)、ad6(图5.3b)或ipa(图5.3c)时，ta_3hmu(黑点)和ta_v2(白点)的稳定性；图5.4：显示了用于苄基丙酮(ba)不对称胺化的胺供体类别(左)和相应的24h转化率(右)。a：使用1当量的ad；b：使用5当量的ad；c：使用25当量的ad；图6显示了当使用不同的hmw氨基供体peg-a负载量时，底物ba随时间的转化率；图7显示了当使用不同的hmw氨基供体peg-c负载量时，底物ba随时间的转化率；图8显示了当使用不同的lmw氨基供体ipa负载量时，底物ba随时间的转化率；图9.1显示了当使用不同的hmw或lmw氨基供体负载量时，反应24h后底物ba的转化率；图9.2显示了当使用不同胺供体负载量时，底物(ba)的24h转化率。使用3.125mg/ml粗提物冻干的ta_3hmu；图9.3显示了当使用不同的胺供体负载量时，ba底物(左轴)的48h转化率和mppa的形成速率(右轴)。使用0.5mg/ml的加热纯化的ta_v2；图10显示了相对于hmwpeg-a和peg-c，测量的几种多孔(纳米过滤，nf)膜的截留率；图11显示了使用dknf膜测量的1m3p、ba和peg-a的截留率；图12显示了使用200nf膜测量的1m3p、ba和peg-a的截留率；图13显示了使用dknf膜测量的1m3p、ba和peg-c的截留率；图14显示了使用200nf膜测量的1m3p、ba和peg-c的截留率；图15显示了使用200nf膜测量的1m3p、ba和ipa的截留率；图16显示了间歇性在线/离线纳米过滤偶联酶促反应：ba底物随时间的消耗；图17显示了nf-1间歇性开/关测试：使用desaldk-ge膜时，截留率(条形)和总渗透物流速随时间(0.5h、2h、5h、6h、7h)的变化；图18显示了nf-2间歇性开/关测试：使用200膜时，截留率(条形)和总渗透物流速随时间(1h、4h、5h)的变化；图19显示了使用desaldk(图19a)和200(图19b)进行纳米过滤之前(黑条)和之后(白条)的mppa产物和ba底物的浓度；图20显示了在线纳米过滤(desal-dk膜)偶联酶促反应；图21显示了在线纳米过滤(200膜)偶联酶促反应。具体实施方式根据本发明的方面，用于生产(光学活性)手性胺的方法包括以下步骤：在转氨酶的存在下，在第一溶液(1)(或反应溶液)中进行前手性氨基受体和氨基供体的转氨反应，从而在所述第一溶液中形成手性胺产物和副产物(酮)。转氨反应(在反应溶液中)在图1中示意性地示出。在本发明的方面中，氨基供体是高分子量(hmw)氨基供体，该高分子量氨基供体的分子量是至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)；或者所述氨基供体附在(连接到，固定在)(惰性)支持物上，所述氨基供体和支持物的总分子量是至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)。有利地，氨基供体是hmw氨基供体，该hmw氨基供体的分子量是至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)。可替代地，假如氨基供体附在支持物上，则该氨基供体是附在(连接到，固定在)(惰性)支持物上的低分子量(lmw)氨基供体，该氨基供体和支持物的总分子量是至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)。lmw氨基供体的分子量低于150g/mol。有利地，该lmw氨基供体选自由以下组成的组：异丙胺、甘氨酸、丙氨酸、丁胺和赖氨酸。更有利地，hmw氨基供体的分子量或(lmw)氨基供体和支持物的总分子量是至少180g/mol，有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol。有利地，该支持物(或载体)是惰性支持物，即不主动参与转氨反应。有利地是，该支持物是聚苯乙烯支持物，有利地是包含氯的聚苯乙烯支持物(比如，携带氯甲基官能团的交联聚苯乙烯树脂(或表面氯甲基化的聚苯乙烯珠)，例如，以作为梅里菲尔德(merrifield)肽树脂市售)。在本说明书的上下文中，(lmw)氨基供体和支持物的总分子量是指(lmw)氨基供体的分子量和支持物的分子量之和。本发明的方法使用高分子量(hmw)氨基供体(或连接到支持物的(lmw)氨基供体，总结构一起具有高分子量)，而本领域中描述的转氨反应到目前为止始终使用具有分子量低于150g/mol的低分子量氨基供体。例如，等人在org.processres.dev.[有机工艺研究与发展],2015,19(7),793-799中在转氨反应中使用分子量分别为约89g.mol-1和59g.mol-1的丙氨酸和异丙胺作为氨基供体。本领域技术人员实际上并不期望使用具有更高分子量的氨基供体在转氨反应(已知为立体定向的)中发生反应，因为空间位阻越高，hmw氨基供体的取代基的尺寸就越大。因此，迄今为止，大的(或hmw)氨基供体从未被用于生物催化转氨反应。事实上，较大的氨基供体对转氨反应来说相当具有挑战性。在本申请中，令人惊讶地观察到，使用高分子量(hmw)氨基供体(或(lmw)氨基供体连接到支持物，总结构一起具有高分子量)的方法确实在转氨反应中成功地做出反应。此外，已经观察到使用这种hmw氨基供体(或(lmw)氨基供体连接到支持物，总结构一起具有高分子量)在进行了转氨反应之后允许改进的下游加工(即，有限的下游加工或甚至不进行进一步的下游加工)(与现有技术方法相比)。更特别地，本发明各方面的方法更有效，其允许在不损失将平衡转移到胺产物侧所需的过量氨基供体的情况下增加形成的胺产物的体积生产力。从而形成具有高产率和高产物纯度的胺产物。在本说明书的上下文中，“氨基受体”是指接受来自氨基供体或供体胺的氨基基团的羰基化合物。有利地，该氨基受体含有酮(或酮基)官能度，并且也被称为“受体酮”、“酮底物”、“酮基底物”或“底物酮”。受体酮的选择通常取决于所期望的手性胺。在本说明书的上下文中，“氨基供体”、“供体胺”、“胺供体”、“胺底物”、“氨基底物”或“底物胺”是指通过向受体酮提供氨基基团(nh2)而与转氨酶和受体酮反应的任何分子。在本发明的方面中，有利地，hmw氨基供体是胺或氨基酸，有利地，hmw氨基供体是胺。有利地，氨基供体包含至少一个氨基基团(即，一个、两个、三个或更多个氨基基团)。因此，氨基供体可以包含一个氨基基团或多于一个氨基基团。因此，至少有一个氨基基团可以用于转氨作用。有利地，氨基供体包含至少一个伯氨基基团。更有利地，氨基供体包含两个(伯)氨基基团。在这种情况下，一个氨基基团可以用于转氨反应，而另一个氨基基团可以连接到另一个氨基供体以形成又一更大的氨基供体。以此方式，可以(进一步)减少将反应的热力学平衡转移到胺产物侧所需的过量的氨基供体，从而(进一步)降低底物成本(与现有技术方法相比)。更有利地，hmw氨基供体是具有以下通式的胺：其中，取代基r3和r4彼此相同或不同(在上述通式中未描述与碳键合的氢)；并且其中r3和r4各自独立地选自由以下组成的组：氢；直链或支链的饱和烷基基团；直链或支链的不饱和烷基基团；环烷基基团；杂环基基团；杂环基烷基基团；芳基基团；芳烷基基团；杂芳基基团；酰基基团；羟基基团；直链或支链的饱和醇；直链或支链的不饱和醇；烷氧基基团；芳氧基基团；氨基基团；烷基氨基基团；环烷基氨基基团；芳基氨基基团；酰氧基基团；酰氨基基团；氰基基团；腈；羧基基团；硫代基团；硫醇基团；氨基羰基基团；氨甲酰基基团；芳氧基羰基基团；苯氧基羰基基团；烷氧基羰基基团；卤代烷基基团；和卤素。例如，亨斯迈公司(huntsman)提供的市售聚醚胺可以用作hmw氨基供体。聚醚胺具有高度通用性且价格低廉，含有附接至聚醚主链末端的伯氨基基团。有利地，hmw氨基供体选自由以下组成的组：(高度柔性的)聚(乙二醇)双(3-氨基丙基)；1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪；聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)(即由亨斯迈公司提供的peg-a、)；o-(2-氨基丙基)-o′-(2-甲氧基乙基)聚丙二醇(即peg-b)；o,o′-双(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇(即由亨斯迈公司提供的peg-c、)；以及1,2-双(3-氨基丙基氨基)乙烷。在本发明的方面中，有利地，前手性氨基受体是酮底物。更有利地，前手性氨基受体是具有以下通式的酮底物：其中取代基r1和r2彼此不同(并且r1和r2都不是氨基基团-nh2)；并且其中r1和r2各自独立地选自由以下组成的组：氢；直链或支链的饱和烷基基团；直链或支链的不饱和烷基基团；环烷基基团；杂环基基团；杂环基烷基基团；芳基基团；芳烷基基团；杂芳基基团；酰基基团；羟基基团；直链或支链的饱和醇；直链或支链的不饱和醇；烷氧基基团；芳氧基基团；氨基基团；烷基氨基基团；环烷基氨基基团；芳基氨基基团；酰氧基基团；酰氨基基团；氰基基团；腈；羧基基团；硫代基团；硫醇基团；氨基羰基基团；氨甲酰基基团；芳氧基羰基基团；苯氧基羰基基团；烷氧基羰基基团；卤代烷基基团；和卤素。更有利地，氨基受体是选自下组的酮底物，该组由以下组成：苯乙酮(分子量约120g/mol)、邻-溴苯乙酮(分子量约199g/mol)、苄基丙酮(分子量约148g/mol)、和2-溴-4-乙酰乙酰苯胺(分子量约256g/mol)。苯乙酮也可以称为1-苯基乙-1-酮、甲基苯基酮或苯乙酮。邻-溴苯乙酮也可以称为2′-溴苯乙酮。苄基丙酮也可称为4-苯基-2-丁酮、甲基(2-苯基)-乙基酮、1-苯基-3-丁酮。在本发明的方面中，有利地，该方法进一步包括以下步骤：-通过多孔膜(3)从第一溶液(1)中分离手性胺(即通过膜分离)。有利地，通过膜接触器(或液-液(膜)萃取)或通过膜过滤(或渗透)进行膜分离步骤。更有利地，通过膜过滤(渗透)进行膜分离步骤，从而对所述膜(3)施加压力以迫使第一溶液(1)穿过膜(3)，手性胺产物由此从第一溶液(1)渗透穿过膜(3)而形成第二溶液(2)或渗透物溶液(或滤液)。有利地，施加5巴或更高的压力，有利地5巴至30巴之间，有利地10巴至30巴之间。由于有利地过量提供hmw氨基供体(与提供的氨基受体的量相比)，使热力学平衡转移到转氨反应的胺产物侧。此外，在本发明的有利方面中，仅胺产物穿过膜(3)形成第二溶液(2)(有利地是渗透物溶液)，而(过量的)hmw氨基供体由于其hmw(或其大尺寸)而被膜保留，有利地是，不会损失任何的氨基供体到第二溶液(2)中。此外，由于膜保留了过量的氨基供体，过量的氨基供体可以与新供应的氨基受体一起再次使用，从而连续地将热力学平衡转移到转氨反应的胺产物侧，同时仅过滤胺产物以形成第二溶液(2)。因此，与现有技术方法相比，可以减少过量氨基供体的量，从而降低底物成本(其中过量氨基供体在转氨反应期间/之后被浪费，因此必须定期提供过量的氨基供体以保持转氨酶反应持续进行)。以此方式，本发明提供了基于尺寸排阻法生产和分离(手性)胺产物的非常有效且具有成本效益的方法。由于hmw氨基供体迄今为止从未被用于生物催化转氨反应，因此在本领域中从未在转氨反应后进行此类基于尺寸排阻法的分离。参照如图2中所示的本发明的方面的实施方案，多孔膜(3)分离第一溶液(1)(包含在第一区室(9)中)和第二溶液(2)(包含在第二区室(10)中)。第一溶液(1)是在转氨酶存在下，氨基供体和前手性氨基受体(酮底物)之间进行转氨反应从而形成手性胺产物和副产物的反应溶液。转氨酶例如可以是(s)-立体定向性胺转氨酶(s-ata)(一种用于以严格立体定向方式生产(s)-胺化合物的重要生物催化剂)。第二溶液(2)有利地是通过使来自转氨酶反应的胺产物渗透穿过多孔膜(3)而形成的渗透物溶液。过量的胺供体被膜(3)截留。分别含有第一和第二溶液(1，2)的第一和第二区室(9，10)包含在用于本发明有利方面中的所谓膜装置(8)中。第一溶液(1)可以是水溶液，有利地是碱性水溶液；或有机溶剂溶液。有利地，可以使用水性缓冲液，比如磷酸盐缓冲液、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、epps(3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸)、hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、ches(n-环己基-2-氨基乙磺酸)。对于本领域技术人员将显而易见的是，选择合适的缓冲液取决于转氨反应中使用的转氨酶的最适ph值(即取决于转氨酶活性最佳的ph)。对于大多数转氨酶，最适ph在7和10.5之间。有利地，缓冲液的ph范围在8.5至10.5之间，有利地在9至10之间，有利地，缓冲液的ph是9.5。第二溶液(2)可以是水溶液，或者第二溶液(2)可以是有机溶剂溶液(条件是第一溶液(1)是溶剂)。有利地，多孔膜针对氨基供体、转氨酶和副产物中的每种的截留分子量(mwco)为至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)。在本说明书的上下文中，截留分子量(mwco)是指其中80％的溶质被膜保留的最低分子量(或者80％被膜保留的分子的分子量)。在本发明的有利方面中，膜(用于膜装置(8)中)的选择因此取决于起始底物(的分子量)并且因此取决于要形成和回收的所期望的手性胺产物。在本发明的有利方面中，基于膜的mwco选择膜，以产生针对氨基供体、转氨酶和形成的副产物中的每种的至少60％、有利地至少80％、有利地至少90％、有利地至少95％的截留率。还选择膜的mwco，使得使用该膜产生针对形成的手性胺产物的低于40％、有利地低于20％、有利地低于10％有利地低于5％的截留率。对于本领域技术人员将显而易见的是，除了氨基供体、转氨酶、未反应的氨基受体(或未反应的酮底物)(如果有的话)和形成的(副)产物的分子量(或尺寸)之外，膜的截留率还取决于那些分子的(三维)形状(如线性或球形)、电荷、结构和浓度，以及它们在反应溶液(1)和/或第二溶液(2)(有利地是渗透物溶液)中的溶解度参数。根据所选择的膜，例如，mwco范围可以在150至300g/mol之间、150至900g/mol之间、180至1200g/mol之间、280至600g/mol之间、300至500g/mol之间或300至750g/mol之间。因此，如在现有技术的转氨反应中使用的低分子量氨基供体(具有低于150g/mol的分子量)不会被膜截留，并且会穿过膜，从而浪费过量(未反应)的氨基供体底物并污染第二溶液(有利地是渗透物溶液)。因此，由于导致胺产物纯度较低，将需要进一步的纯化步骤。如在本发明的方面中，与其相反，使用hmw氨基供体(具有至少150g/mol的分子量)或附在支持物上的(lmw)氨基供体(氨基供体和支持物的总分子量是至少150g/mol)，则避免了对第二溶液的这种污染。从而降低了底物成本(因为没有过量的氨基供体的浪费)，并且降低了用于进一步回收形成的胺产物的成本(与现有技术方法相比)。有利地，多孔膜(3)是纳米过滤膜。有利地，纳米过滤膜是聚合物纳米过滤膜或陶瓷纳米过滤膜。有利地，这些膜是化学惰性的，并展现出高的机械、热和水热稳定性，有利于长期使用。更有利地，多孔膜的孔的孔径小于1μm。有利地，多孔膜的孔的孔径范围为从0.5nm至100nm，有利地从0.5nm至50nm，有利地从0.5nm至20nm，有利地从1nm至10nm(如通过本领域技术人员已知的渗透孔度法(permporometry)或氮吸附技术测量的)。在本发明的有利方面中，基于膜的mwco和/或膜的孔的孔径选择膜，以产生针对氨基供体、转氨酶和形成的副产物中的每种的至少60％、有利地至少80％、有利地至少90％、有利地至少95％的截留率。还选择膜的mwco和/或孔的孔径，使得使用该膜产生针对形成的手性胺产物的低于40％、有利地低于20％、有利地低于10％、有利地低于5％的截留率。用于膜装置(8)中的合适的膜对于本领域技术人员来说将是显而易见的。可以使用市售的膜，比如nfx、nfw、来自阿法拉伐公司(alfalaval)的nf-99-hf、dowfilmtectmnf90、dknf等。在本发明的有利方面中，与提供的氨基受体的量相比，过量提供氨基供体以将热力学平衡转移到转氨反应的胺产物侧。因此，第一溶液(1)中存在的基本上全部可用量的氨基受体将在转氨反应中发生反应(在反应溶液中留下过量的未反应的氨基供体，并且没有未反应量的氨基受体)。仅在转氨反应不能完全完成的情况下，未反应的氨基受体在反应溶液(1)中仍然可用。基于其分子量(类似于形成的胺产物的分子量)，它也将穿过选择的膜(3)。例如，使用2-溴-4-乙酰乙酰苯胺(分子量约256g/mol)作为酮底物，peg-a(分子量约400g/mol)作为hmw氨基供体，以及具有mwco范围从280至600g/mol的多孔膜：反应溶液(1)中形成的胺产物(分子量约256g/mol)将穿过膜(3)形成第二溶液(2)(有利地是渗透物溶液)，而过量的氨基供体(分子量约400g/mol)将被膜(3)保留在第一溶液(1)中。反应溶液中未反应的酮基底物(如果有的话)也将能够穿过所选择的膜(基于酮基底物的分子量，与形成的胺产物的分子量相似)进入第二溶液。仅在未反应的氨基受体(酮底物)穿过膜的情况下，才要将第二溶液中的酮底物进一步从也收集在其中的形成的胺产物分离。对于本领域技术人员将显而易见的是，因为酮底物和胺产物由于它们的主要官能团不同而不具有相似的性质，该纯化(分离)是容易的。例如，可以进行溶剂萃取以从形成的胺产物中分离未反应的氨基受体(酮底物)(因此在这种情况下，二者均存在于第二溶液中)。例如，第二溶液中未反应的苄基丙酮底物(氨基受体)可以通过用叔丁基甲醚萃取从所述溶液中进一步去除，而形成的胺产物1m3p(1-甲基-3-苯基丙胺)可以通过在ph12下用叔丁基甲醚萃取然后高真空下蒸发溶剂从第二溶液中分离。如本发明中使用的用于生产(光学活性)手性胺的转氨反应通常包含以下步骤：-提供氨基受体和氨基供体；-使氨基受体和氨基供体与转氨酶，比如(r)或(s)-选择性转氨酶反应；以及-获得所期望的(光学活性)手性胺和副产物(酮)。在本说明书的上下文中，“转氨酶”是指具有酶活性的多肽，其能够使用磷酸吡哆醛(plp)作为转氨酶反应中的辅酶，将氨基基团(-nh2)、一对电子、和质子从伯胺转移到受体分子的羰基(c＝o)。如本文中使用的转氨酶可以是天然存在的(野生型、非工程化的)转氨酶，或由人类操纵产生的或工程化的非天然存在的转氨酶，比如重组多肽或工程化以具有修饰或改进的酶活性的变体多肽。(r)或(s)-选择性转氨酶能够催化氨基基团从氨基供体转移到受体分子，从而分别形成r-特异性或s-特异性手性胺。如本文使用的转氨酶可以呈游离形式，固定在合适的支持物或基质(比如交联葡聚糖或琼脂糖、二氧化硅、聚酰胺或纤维素)上，或包封在聚丙烯酰胺、海藻酸盐、纤维等中。如本文使用的转氨酶可以呈含有转氨酶的全细胞形式，或者呈作为转氨酶的宿主的工程化全细胞形式。此类固定或包封的方法是技术人员已知的。对于本领域技术人员将显而易见的是，根据所期望的手性产物和可用底物(即酮受体和氨基供体)选择适当的转氨酶。底物的转氨作用可以在生物反应器中，使用通常在确定浓度下的酶与底物的等分试样进行。将反应参数(比如ph、温度和混合)保持在有利于最佳生物催化活性和稳定性的水平。该反应还可以通过在宿主中表达所期望的转氨酶而在体内进行。所期望的宿主可以例如选自下组：酵母属物种(saccharomycessp.)、毕赤酵母属物种(pichiasp.)、汉逊酵母属物种(hansenulasp.)、节杆菌属物种(arthrobactersp.)、假单胞菌属物种(pseudomonassp.)、大肠杆菌物种(e.colisp.)。所期望的生物转化过程发生在宿主细胞中，其中该宿主细胞表达所期望的用于聚醛酶化(carboligation)的酶。在本发明的有利方面中，可以从各种微生物获得转氨酶(也称为氨基转移酶ec2.6.1.18)。有利地，转氨酶获得自以下生物体，这些生物体选自由以下组成的组：反硝化无色杆菌(achromobacterdenitrificans)、反硝化无色杆菌y2k-2、土曲霉(aspergillusterreus)、蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、蜡样芽孢杆菌k-22、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacepacia)、紫色色杆菌(chromobacteriumviolaceum)、大肠杆菌(escherichiacoli)、人苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)、菜豆(phaseolusvulgaris)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、褐家鼠(rattusnorvegicus)、河流孤菌(vibriofluvialis)、和河流孤菌js17。有利地，转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌(ruegeriapomeroyi)的3hmu(即来自波氏硅杆菌(silicibacterpomeroy)的iii类氨基转移酶)，或来自鲁杰氏菌属物种(ruegeriasp.)tm1040的3fcr；有利地，转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌的3hmu。这些转氨酶在作为宿主的大肠杆菌bl21(de3)(购买自例如)中表达。在本发明的方面中，有利地，-前手性氨基受体是选自下组的酮底物，该组由以下组成：苯乙酮、邻-溴苯乙酮、苄基丙酮、和2-溴-4-乙酰乙酰苯胺；-氨基供体选自由以下组成的组：(高度柔性的)聚(乙二醇)双(3-氨基丙基)；1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪；聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)(peg-a)；o-(2-氨基丙基)-o′-(2-甲氧基乙基)聚丙二醇(peg-b)；o,o′-双(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇(peg-c)；和1,2-双(3-氨基丙基氨基)乙烷；以及-转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌的3hmu，或来自鲁杰氏菌属物种tm1040的3fcr，有利地，转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌的3hmu。更有利地，-前手性氨基受体是选自下组的酮底物，该组由以下组成：苯乙酮、邻-溴苯乙酮、苄基丙酮、和2-溴-4-乙酰乙酰苯胺，有利地是苄基丙酮；-氨基供体是聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)(peg-a)或o,o′-双(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇(peg-c)；以及-转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌的3hmu或来自鲁杰氏菌属物种tm1040的3fcr。甚至更有利地，-前手性氨基受体是选自下组的酮底物，该组由以下组成：苯乙酮、邻-溴苯乙酮、苄基丙酮、和2-溴-4-乙酰乙酰苯胺，有利地是苄基丙酮；-氨基供体是聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)(peg-a)或o,o′-双(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇(peg-c)；以及-转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌的3hmu。最有利地，-前手性氨基受体是选自下组的酮底物，该组由以下组成：苯乙酮、邻-溴苯乙酮、苄基丙酮、和2-溴-4-乙酰乙酰苯胺，有利地是苄基丙酮；-氨基供体是聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)(peg-a)；以及-转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌的3hmu。可替代地且最有利地，-前手性氨基受体是选自下组的酮底物，该组由以下组成：苯乙酮、邻-溴苯乙酮、苄基丙酮、和2-溴-4-乙酰乙酰苯胺，有利地是苄基丙酮；-氨基供体是o,o′-双(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇(peg-c)；以及-转氨酶是来自波氏鲁杰氏菌的3hmu。通过本发明的方面的方法产生的胺产物可以进一步用作药物产品合成中的中间体。在本发明的方面的实施方案中，使用手性胺生产和分离装置进行该方法。这样的装置(4)示意性地示于图3中。用于生产手性胺并随后分离(回收)手性胺的装置(或设备)(4)包含：-用于保持氨基供体和前手性氨基受体的第一容器(5)，第一容器(5)与用于保持第一溶液(1)(即，氨基供体和前手性氨基受体在转氨酶存在下进行转氨反应从而形成手性胺和副产物的反应溶液)的酶罐(6)处于流体连接，以及布置在第一容器(5)和酶罐(6)之间的阀(12)；-任选地，用于保持惰性气体的第二容器(7)，其与酶罐(6)处于流体连接，以及用于向酶罐(6)提供惰性气体流的装置；-布置在酶罐(6)的下游的膜装置(8)，所述膜装置(8)与酶罐(6)处于流体连接，并且所述膜装置(8)包含由多孔膜(3)与第二区室(10)分离的第一区室(9)；以及布置在酶罐(6)和膜装置(8)的(第一区室(9))之间的(三通)阀(11)；-膜装置(8)的第一区室(9)被配置为从酶罐(6)接收第一溶液(1)(包含形成的手性胺)，第二区室(10)被配置为保持第二溶液(2)，有利地，第二溶液(2)是第一溶液的渗透物(或滤液)(通过使手性胺从第一溶液(1)渗透穿过多孔膜(3)而形成)；-用于回收(收集)形成的胺产物的第三容器(13)，所述第三容器(13)被布置在膜装置(8)的下游，所述第三容器(13)与膜装置(8)的第二区室(10)处于流体连接；-任选地，用于将第一溶液(1)(有利地包含过量供体胺)从膜装置(8)的第一区室(9)再循环回酶罐(6)中的装置(例如，通过图3中的循环泵p-2)。有利地，该多孔膜是纳米过滤膜，有利地，是聚合物纳米过滤膜或陶瓷纳米过滤膜。有利地，该多孔膜针对氨基供体和转氨酶的mwco为至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)，和/或该多孔膜的孔的孔径范围为从0.5nm到100nm(有利地是从0.5nm到50nm，有利地是从0.5nm到20nm，有利地是从1nm到10nm)。有利地，装置(4)包含用于对多孔膜(3)施加压力的装置。更具体地，参考图3，第一容器(5)与酶罐(6)处于流体连接(图3中的p-1是渗滤泵)。氨基供体和前手性氨基受体从第一容器(5)进料至酶罐(6)，其中该反应在转氨酶存在下在第一溶液(1)中发生(并且任选地在惰性气体(比如n2气)存在下，从第二容器(7)进料至酶罐(6)，第二容器(7)与酶罐(6)处于流体连接)，从而形成手性胺和副产物。氨基供体是高分子量(hmw)氨基供体，该高分子量氨基供体的分子量是至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)；或者该氨基供体附在(连接到，固定在)(惰性)支持物上，该氨基供体和支持物的总分子量是至少150g/mol(有利地是至少200g/mol，有利地是至少300g/mol)。有利地，过量提供氨基供体(或附到支持物上的氨基供体)(相对于提供的氨基受体的量)。可替代地，在随后的间隔中以等摩尔量提供氨基供体和氨基受体(在第一容器(5)和酶罐(6)之间布置阀(12))。膜装置(8)与酶罐(6)处于流体连接(膜装置(8)位于酶罐(6)的下游)。在酶罐(6)之后的膜装置(8)中，将发生在第一溶液(1)中的转氨酶反应中形成的手性胺产物的分离。膜装置(8)包含由多孔膜(3)与第二区室(10)分离的第一区室(9)。有利地，基于膜的mwco(和/或孔径)选择膜(3)，以仅使所形成的胺产物穿过膜(3)。将第一溶液(1)(包含所形成的手性胺的转氨反应的反应溶液)进料到膜装置(8)的第一区室(9)。通过多孔膜(3)从第一溶液(1)中分离手性胺(即通过膜分离)。包含形成的手性胺的第一溶液(1)从而与多孔膜(3)接触。有利地，通过对多孔膜(3)施加压力(有利地通过施加5到30巴之间的压力)迫使包含形成的手性胺的第一溶液(1)穿过多孔膜(3)。从而，在酶罐(6)中的溶液(1)中的转氨反应中形成的手性胺产物将从第一溶液(1)穿过多孔膜(3)而被提取(有利地是渗透)，形成第二溶液(2)(有利地是渗透物溶液)。基于氨基供体的高分子量和选择的膜(3)的mwco(和/或孔径)，过量的(未反应的)氨基供体不能穿过多孔膜(3)。由于转氨酶的高分子量，转氨酶也会被多孔膜(3)保留在第一区室(9)中。因此，含有过量氨基供体的未穿过膜(3)的第一溶液(1)(的部分)可以从膜装置(8)的第一区室(9)再循环到酶罐(6)中，以与来自第一容器(5)的新供应的氨基受体进一步进行转氨反应。因此，在转氨反应中不会损失过量的氨基供体。此外，如在转氨反应中，氨基受体形成高分子量的副产物，后者也将被选择的具有适当mwco值(和/或孔径)的多孔膜(3)保留。因此，副产物保留在第一溶液(1)中并在那里积累。不希望受理论的束缚，据信在第一溶液(1)中累积的副产物将聚合，并且因此有助于(甚至增强)将转氨反应的热力学平衡转移到胺产物侧。另一方面，基于氨基供体的低分子量和选择的膜(3)的mwco(和/或孔径)，形成的手性胺产物将穿过膜(3)并可以从膜装置(8)的第二区室(10)中回收。此外，由于第二溶液(2)(有利地是渗透物溶液)不受过量(未反应的)氨基供体的污染，因此可以从具有高产物纯度的第二溶液(2)中回收形成的手性胺。回收的胺可以被收集在第三容器(13)中，该第三容器(13)被布置在膜装置(8)的下游并且与其第二区室(10)处于流体连接。手性胺的生产和分离能以连续或分批模式进行(后者通过在酶罐(6)和膜装置(8)(其的第一区室(9))之间添加(布置)(三通)阀(11)进行)。由于有利地提供了与所提供的氨基受体量相比的过量的氨基供体，或者可替代地，以等摩尔量提供了氨基供体和氨基受体，因此基本上全部可用量的氨基受体将在转氨反应中发生反应。未反应的氨基受体(如果还有的话)(例如，假如转氨反应不能完全完成)也将与形成的胺产物一起穿过膜(3)。仅在后一种情况下，要进行进一步(容易的)纯化步骤以分离第二溶液中的胺产物和氨基受体。实施例在实施例中，所有的化学品都具有分析级纯度并且获得自西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich)。实施例1：转氨反应中的大氨基供体表1中列出的hmw氨基供体在针对与ta酶的反应的可行性研究中进行了测试(hmw氨基供体是市售的，并且相对便宜)。更具体地，在本研究中，通过进行甘氨酸氧化酶测定来研究hmw氨基供体的ta酶接受性(如weiβ等人在anal.chem.[分析化学]2014,86,11847-11853中描述的)。另外，从酶库中选择出25种野生型转氨酶。转氨酶的选择是基于ta可用性、广泛的底物和氨基供体范围以及稳定性进行的。表2a列出了选择的转氨酶。在测试的25种酶中，两种野生型ta接受表1所列的高分子量氨基供体作为底物。更具体地，在经测试的转氨酶中，((s)-选择性)ta酶3hmu(表示为ta_3hmu，来自波氏硅杆菌的iii类氨基转移酶))被证明是当用表1中列出的hmw氨基供体进行甘氨酸氧化酶测定时最有活性的酶。另外，ta酶3fcr(表示为ta_3fcr)对这些hmw氨基供体具有活性。观察到的最佳接受性是转氨酶ta_3hmu与氨基供体peg-a和peg-c的组合。表1：经测试用于与ta酶反应的hmw氨基供体表2a通过甘氨酸氧化酶测定测试的在大肠杆菌bl21(de3)中表达的不同ta在测试的不同反应条件中，图4.1总结了使用表1中列出的选择的氨基供体时用最佳ta酶(即ta_3hmu)获得的结果。更具体地，图4.1显示了使用不同的氨基供体(图4.1的右侧)和获得的实验斜率(图4.1的左侧)时，ta_3hmu在37℃下在498nm处的吸光度随时间而增加。最终底物浓度总计为在ches缓冲液(100mm，ph9.5)中的2.5mm的乙醛酸盐、20mm的大氨基供体、7.28u/ml辣根过氧化物酶、0.12mg/ml纯化的甘氨酸氧化酶、3mm4-氨基安替比林、以及4.7mm香草酸，总反应体积为150μl。将具有空pet28a(+)载体的细胞用作阴性对照。将使用2.5mmα-mba的反应用作阳性对照。上述(光度)测定是半定量的：吸光度的增加(图4.1中的斜率)与酶活性相关。然而，由于该测定是多酶反应，所以很难进行准确的定量。尽管如此，图4.1中获得的趋势和实验斜率表明，hmw氨基供体被ta_3hmu充分地接受。此外，在生物催化实验中使用的浓度下，没有观察到大氨基供体分子的严重的抑制作用。几乎所有测试的大氨基供体的活性确实与阳性对照α-mba(1-苯基乙胺)的活性相当，α-mba是模型氨基供体中最容易脱氨基的(参见guo等人在greenchem.[绿色化学],2017,19,333-360中)。表2b报告了对hmwad1-7进行ta筛选的结果，将α-mba用作阳性对照。第一次筛选的重点是在ad1、2、5和7下，评价7种野生型生物催化剂(如表中所列)。在测试的实验条件下，确实可以观察到，在ad2和ad7存在下，来自波氏硅杆菌(ta_3hmu)的(s)-选择性ta表现出高活性。用其他测试酶仅观察到适度的活性。然后用三种市售hmw(ad3、4和6)对ta_3hmu进行进一步测试。与其他测试的大ad相反，这些分子具有典型的聚乙二醇主链。结果表明，ta_3hmu的活性确实与使用阳性对照α-mba胺供体所实现的活性大致相当。图4.2描绘了表2b中总结的结果(其中，与图4.1相比，还包括ad5的结果)，这些结果是在与上文图4.1所讨论的相同条件下获得的。n.d.：未确定(未测试)；0：未检测到活性表2b：对hmwad1-7进行ta筛选，将α-mba用作阳性对照鉴于上文，已经证明大(或hmw)氨基供体被转氨酶充分接受。因此，hmw分子可以用于不对称合成工业用手性胺的转氨反应中。实施例2：转氨反应中的氨基受体底物为了进行转氨酶反应以获得工业上重要的手性胺，ta酶必须充分接受氨基供体以及氨基受体底物(即酮基底物)。另外，来自i类底物(从热力学角度看是困难的底物)的底物被考虑用于与ta酶的反应。i类底物酮基底物列于表3a中。表3a：i类底物酮基底物在ta_3hmu酶存在下，使用hmw氨基供体和底物1a、1b和1c，进行手性胺的不对称合成。通过tlc分析或通过手性gc分析，针对所有测试的反应定性地检测产物形成。在不施加平衡移动策略的情况下，底物1a和1b很难胺化，并且检测到非常低的产物形成。然而，根据本发明的有利方面，使用底物1a或1b进行转氨反应，然后使用膜装置(8)分离形成的胺产物，将进一步将热力学平衡转移到反应的产物侧，从而提高所产生的胺产物的产物纯度。对于转氨反应的后续研究，仅使用酮底物1c(苄基丙酮，缩写为ba)，因为其转氨作用相对容易(与苯乙酮相比)(参见图4.3，示出了模型转氨反应，其中ba为氨基受体，ad6(参见表1)被用作胺供体)。预期由于它们的主要酮官能团相似，其他酮基底物(有利地，表3a中所列的酮基底物)将以与底物1c相同的方式表现。此外，基于实施例1中获得的结果和经济评估(氨基供体购买便宜)，仅选择hmw氨基供体peg-a和peg-c进行进一步优化。同样在这里预期，由于其hmw和相似的主要氨基官能团，其他hmw氨基供体(有利地，表1中所列的hmw氨基供体)将以与peg相同的方式发生反应。使用由enzymicals公司(德国)提供的ta_3hmu的冻干粗提物并使用peg-a和peg-c作为氨基供体进行不对称胺合成实验(酶活力是970mu/mg，基于苯乙酮检测的光度测定法)。对于第一个测试，使用了相当大量的酶(12.5mg/ml冻干粉末，对应于约6mg/ml的总蛋白含量)。除聚乙二醇分子(peg)外，还研究了常见且便宜的lmw氨基供体ipa。与peg不同，peg可由具有适当mwco和/或孔径的多孔(纳米过滤)膜(3)保留，lmw氨基供体ipa将渗透形成第二溶液(2)。运行转氨反应时获得的趋势如图5.1中所示。图5.1示出了使用氨基供体peg-a(用菱形点描绘)、peg-c(用十字描绘)和ipa(用正方形描绘)时，底物ba随时间的转化率。使用12.5mg/ml的ta_3hmu粗提物粉末(10mmba、250mm氨基供体、以及在100mmches缓冲液(ph9.5)中的0.1mmplp)。还使用从德国莱比锡城c-lecta股份有限公司(c-lectagmbh)购买的胺转氨酶ta_v2进行不对称胺合成实验。经纯化的酶以冻干粉末的形式供应，ta_v2的活性为1.73u/mg。所有反应均以1ml体积进行，该体积含有12.5-0.78mg/ml的ta_3hmu或ta_v2粉末、10-500mm胺供体(ipa、peg-a和peg-c)、10mmba模型底物(溶解于dmso中)、以及在100mmches缓冲液(ph9.5)中的0.1mmplp。最终dsmo浓度为5％(v/v)。在30℃和1000rpm下温育时，在不同时间段后采集样品(500μl)，补充25μl三氟乙酸(tfa)，并准备进行超高效液相色谱(uplc)。开发了超高效液相色谱(uplc)分析方法用于反应定量。当使用peg-a、peg-c和ipa时，uplc可以通过定量底物和产物来跟踪反应过程。由在194/210nm处进行uv检测的uhplc(thermoscientifictm)确定底物(ba)和产物(mppa)浓度。使用1μl注射液加到c18反相柱(watersacquitybehc181.7μm2.1x50mm)上来实现色谱分离。柱温保持在40℃。使用在水(dh2o)中的流动相a0.1％甲酸(fa)和在乙腈(acn)中的流动相b0.1％fa进行梯度洗脱程序。洗脱程序如下：0-4min99％-30％a；4-5min30％-1％a；5-5.1min1％-99％a；5.1-7.5min99％a；流速均为400μl/min。将胺供体ad3和ad6在alltimahpc18hl5μ,4.6x250mm上通过具有elsd检测器的hplc进行分析。用于peg分析的洗脱剂是：a)dh2o，0.1％fa；b)acn，0.1％fa。当比较图5.1中所示的随时间的转化趋势时，可以得出，在进行转氨反应20h后，当使用250mmhmw氨基供体peg-a或peg-c时，实现了约40％ba转化，而lmw氨基供体ipa转化了超过80％的初始ba底物。然而，由于ipa的lmw，反应溶液(1)中过量的ipa不会被随后分离过程中使用的多孔(纳米过滤)膜(3)保留，而基于其hmw的hmwpeg将被具有适当mwco和/或孔径的这样的膜(3)截留。基于尺寸排阻法对过量(hmw)氨基供体(和穿过膜的形成的胺产物)进行分离将进一步增强向胺产物侧的平衡移动，并且也将提高所产生的胺产物的产物纯度(与本领域仅使用lmw氨基供体的方法相比)。此外，使用不同负载量的ta_3hmu冻干粗提物进行了测试。由于无法采用光度法观察到生物转化，因此不可能持续按时间进行酶反应。因此，必须使用仅提供少量测量点的费力的停止酶测定。正如预期的，当酶负载量减少时，初始反应速率降低。在ipa供体胺存在下，实现了更高的转化率。然而，反应终点降低，这减少了酶的量(参见图5.2c)。图5.2b显示了在ad6存在下ta_3hmu的稳定性。图5.2中的实验条件：10mmba；250mmad；0.1mmplp；5％dmso；100mmches缓冲液，ph9.5，30℃，1000rpm。如上文已经讨论的，在转氨酶反应中使用ipa作为胺供体，需要非常高的过量的胺供体的量(例如50-100倍)，这使下游加工复杂化，并可能阻碍ta的稳定性和活性(参见例如slabu,i.等人在catal.today[今日催化]306,96-101(2018)；savile,c.k.等人在science[科学]329,305-9(2010)；dawood,a.w.h.等人在chemcatchem[催化化学]10,951-955(2018)中)。因此，探索了ta_3hmu对ipa以及hmwad3和6的稳定性。正如预期的，在ipa的存在下，ta_3hmu快速失活(参见图5.3c)，因此证实这种胺供体(以25倍过量提供)阻碍了ta_3hmu的稳定性和活性。与ipa相比，存在大量胺供体(参见图5.3a和图5.3b)。图5.3中的实验条件：10mmba；250mm胺供体(ad3、ad6或ipa)；0.1mmplp；5％dmso；100mmches缓冲液，ph9.5，30℃，1000rpm。使用3.125mg/ml酶。在进行不对称合成反应72小时后，添加新鲜的酶。直到反应完成，ta_3hmu一直是有活性的。在测试的存在下，酶的稳定性可能与这些双官能伯胺的内在性质有关，这些双官能伯胺的特征是在主链中重复的氧丙烯单元。选择的hmw胺供体的聚乙二醇主链由于赋予的亲水性和柔性可用于多种聚合物，可以增强酶活性和稳定性。如前文已经提及的，除了ta_3hmu以外，还测试了耐溶剂性ta_v2。令人惊讶的是，ta_v2，最近被工程化用于在高ipa浓度下工作(参见t.等人在chembiochem[生物化学]18,1482-1486(2017)中)，当使用hmw胺供体时也具有活性和稳定性。如图5.3(白点)中所示，就最终转化率和反应速率而言，ta_v2酶优于ta_3hmu。在后一方面，就纯度而言，酶配制剂可能发挥了很大的作用，并且当这两种酶均以纯化形式使用时，可以进行准确的比较。然而，对于工业应用，使用纯化酶会导致额外的操作成本。通过提供25倍过量的hmw胺供体，使用粗提物冻干粉ta_3hmu和加热纯化的冻干的ta_v2分别实现了约45％和65％的转化率(参见图5.4a)。在图5.4中，将这些结果与先前的研究进行了比较，在先前的研究中，使用了各种灵巧胺供体进行热力学平衡转移(参见图5.4b-e)。除了合成性二胺1a和2a(其通过副产物的自发环化和随后的环芳构化极大地取代了ta反应的平衡)以外，其他所有灵巧胺供体均实现了显著较低的转化率(图5.4)。然而，比如邻二甲苯二胺(1a)(参见green等人在angew.chem.int.ed.engl.[应用化学英文国际版]2014年9月26日；53(40):10714-7中)或者丁-2-烯-1,4-二胺(2a)(参见martnez-montero,l.等人在adv.synth.catal.[先进合成和催化]358,1618-1624(2016)中)等二胺通常是昂贵的、高毒性的，且形成难以去除的聚合物，因此增加了下游加工成本。发现替代性末端生物二胺3a、4a和5a(其需要接近化学计量的供体负载量)可提供多种底物的高转化率。对于邻位取代的酮底物，在形成的胺产物与卤素原子之间的稳定相互作用驱动反应至几乎完成(参见galman,j.l.等人在greenchem.[绿色化学]19,361-366(2017)中)，而非活性酮转化率却大大降低(图5.4c)。最近探索了ta_3hmu酶对邻位1,2-二胺6-8a的接受性。热力学平衡可以通过自发二聚化和随后的氧化芳构化向产物侧转移(参见payer等人在europeanj.org.chem.[欧洲有机化学杂志]2017,2553-2559(2017)中)。然而，即使使用20mg/ml的ta_3hmu，ba的转化也很差(图5.4d)。值得注意的是，通过仅使用3mg/ml的粗提物ta_3hmu，hmwad3或ad6分别将ba转化率提高到45％和51％。实施例3：氨基供体负载量的影响为了证明使用过量氨基供体进行转氨的益处(用于模型反应的热力学平衡转移)，研究了氨基供体负载量的影响。对于这组实验，将ta_3hmu粗提物粉末浓度设定为3.125mg/ml。将运行具有不同氨基供体负载量的转氨反应时获得的趋势示于图6至8中。图6、图7和图8显示了当使用不同的氨基供体负载量时ba随时间的转化率。实验条件：10mmba；10mmad(1x)；100mmad(10x)；200mmad(20x)；400mmad(40x)；0.1mmplp；5％dmso；3.125mg/ml冻干粗提物ta_3hmu；100mmches缓冲液，ph9.5，30℃，1000rpm。图9.1显示了当使用不同的氨基供体负载量时，反应24h后底物ba的转化率。正如预期的，过量的氨基供体将平衡转移到产物侧。反应速率增加，这使氨基供体的量(图6至8)以及最终转化率(图9.1)提高。对ta_v2酶的不同胺供体负载量也进行了探索。正如预期的，对ta_v2酶的过量的hmw胺促进了产物侧平衡(将针对ta_3hmu的图9.2与针对ta_v2的图9.3进行比较)，这提高了更高的反应速率(参见图9.3)。与ipa相比，大的ad3和ad6是粘性的，并且更重要的是，它们空间体积大。因此，以高过量的hmwad进行工作是不利的，并且对于随后的实验，胺供体浓度被设定为250mm(25倍过量)。实施例4：膜筛选和离线测试对几种市售的多孔纳米过滤膜进行了测试(从而研究其分离性能)。更具体地，评价了膜截留hmw氨基供体peg-a和peg-c的能力。制备peg-a和peg-c的水溶液(300ml)。将250mmhmwpeg-a或peg-c溶于ph值为9.5的100mmches缓冲液中。使用高压不锈钢错流膜(过滤)装置。测试装置基本上由进料容器(容量大约为1l)、用于循环的齿轮泵、以及矩形膜壳体组成。在膜装置中，使用以下市售的纳米过滤膜：nfx、nfw、200、solsepnf010206、gekhduracid、dknf、来自阿法拉伐公司的nf-99-hf、dowfilmtectmnf90、flux、performance和selective。测试在室温下进行。从而将穿过膜的渗透物收集在置于天平上的容器中。在稳态条件(稳定通量)下采集渗透物和渗余物(后者是被膜截留(保留)的溶液，即不穿过膜)的样品，并如下计算膜截留率：其中cp和cr分别表示渗透物和渗余物中氨基供体的测量浓度。结果如图10(和表3b)中所示。从此图中可以看出，一些膜能够保留超过80％的hmwpeg-a和/或peg-c。然而，由于ipa的低分子量，ipa不会被这些膜保留，相反，其很容易穿过。实际上，从图10和表3b中的结果可以看出，除puramem膜以外，所有聚合物膜通过尺寸排阻机制保留了超过80％的经测试的jeffamines。相比之下，小ba和mppa溶质穿过聚合物纳米过滤膜的运输是一个极其复杂的过程，且取决于空间效应、唐南(donnan)效应、介电效应和输运效应的组合(参见mohammad,a.w.等人在desalination[脱盐]356,226-254(2015)中)。为了进一步离线研究底物/产物分离，除了显示对ad6的最高截留率的desaldk-ge膜(dknf(莱恩泰科公司(lenntech)))以外，还选择了200(赢创公司(evonic))(200和dk是两种商业化的、ph稳定的纳米过滤(nf)膜)。在使用这种有机溶剂纳米过滤(osn)膜时，也观察到相对较高的通量。n.a，由于通量很低，未进行测试表3b：膜对ad3(400g/mol)和ad6(600g/mol)的截留率。使用含有250mmad3或ad6、0.1mmplp、100mmches缓冲液(ph9.5)的合成溶液。实施例5：组分分布通过进行离线膜提取实验(用模型溶液进行离线纳米过滤)，研究了酮基底物(苄基丙酮，ba)、hmw或lmw氨基供体(ad)(hmw-peg-a、hmw-peg-c或lmw-ipa)和手性产物(1-甲基-3-苯基丙胺，1m3p(或mppa))的分布。另外，制备在进行转氨反应24h后具有预期成分的(模型)水溶液，并随后使用根据本发明的方面的膜装置分离。使用200或dknf作为膜装置中的市售纳米过滤(nf)膜。更具体地，将5mmba(苄基丙酮)酮基底物、5mm1m3p(1-甲基-3-苯基丙胺)胺产物、250mm氨基供体(hmw(ad3或ad6)或lmwad)和0.1mm磷酸吡哆醛(plp)溶于ph9.5的100mmches缓冲液中。使用高压不锈钢错流膜(过滤)装置，该装置专门设计用于基于水性溶剂的流和基于有机溶剂的流。测试装置基本上由进料容器(容量大约为1l)、用于循环的齿轮泵、以及矩形膜壳体组成。将穿过膜的渗透物收集在置于天平上的容器中。在室温，在10、20和30巴的压力下对膜进行测试。在稳态条件(稳定通量)下采集渗透物和渗余物(后者是被膜截留的溶液，即不穿过膜)的样品，并如下计算膜截留率：其中cp和cr分别表示渗透物和渗余物的测量浓度。在室温下进行膜测试，并施加三种压力(即10、20和30巴)。在稳态条件(稳定通量)下采集渗透物和渗余物样品，并计算截留率。结果总结在表4至8中，且如图11至15所示。p＝10巴p＝20巴p＝30巴1m3p-7.18-59.16-21.53ba48.4137.2942.50peg-a73.9094.5097.14表4：使用hmwpeg-a和dknf膜，反应组分的截留率(以％计)p＝10巴p＝20巴p＝30巴1m3p8.121.2919.15ba39.7537.3841.56peg-a79.7686.97表5：使用hmwpeg-a和200nf膜，反应组分的截留率(以％计)p＝10巴p＝20巴p＝30巴1m3p26.69-120.91-98.31ba66.1340.7742.29peg-c67.5787.7694.01表6：使用hmwpeg-c和dknf膜，反应组分的截留率(以％计)p＝10巴p＝20巴p＝30巴1m3p5.36-28.05-27.18ba43.0037.8841.72peg-c53.9276.3682.15表7：使用hmwpeg-c和200nf膜，反应组分的截留率(以％计)p＝10巴p＝20巴p＝30巴1m3p26.0030.3838.74ba12.3218.9218.46ipa6.5239.9451.08表8：使用lmwipa和200nf膜，反应组分的截留率(以％计)正如预期的，基于其hmw，氨基供体peg-a和peg-c被nf膜充分地保留(参见表4至表7)。在30巴的压力下操作时，膜截留了最高量的hmwad。从表8可以看出，在相似压力下操作时，虽然200nf膜也保留了lmwipa，但其保留程度与hmw氨基供体不同。此外，可以看出，当使用含有peg而不含有ipa的溶液时，有利于保留酮基底物和提取胺产物。实际上，当使用peg溶液时保留了约40％的ba底物(参见表4至7)，而在使用ipa溶液时最大保留了18％的ba底物(参见表8)。此外，可以看出，当使用peg溶液而不是ipa时，胺产物优先被提取，甚至被过度浓缩。实际上，离线测试显示(参见图11-15)，两种膜都部分保留了ba。相反，mppa溶质比因此达到负截留率的溶质更快地跨膜输运。令人惊讶的是，与200相比，desaldk显示出更高的ba/mppa选择性。这一结果表明，在膜的亲水性与其在保留底物的同时渗透产物胺的能力之间存在相关性。正如预期的，两种膜对hmw胺的保留率(截留率)均>80％。总体而言，膜研究表明nf可用于(模型)手性产物的ispr。通过使用稳定且高度选择性的膜，可以容易地解决热力学平衡以及产物抑制问题，而不会持续污染产物流。实施例6：间歇性在线/离线nf偶联酶促反应在证明了反应和分离操作的有效性之后，进一步研究了实施过程。反应规模从1ml放大到500ml(数据未显示)。反应以600ml体积进行，该体积含有2mg/ml的ta_v2粉末、250mm的ad6、10mm的ba底物(溶解在dmso中)、以及在100mmches缓冲液(ph9.5)中的0.1mm的plp。最终dsmo浓度为5％(v/v)。反应16h后，将550ml反应混合物转移到膜装置中，并进行2次间歇性纳米过滤测试。将剩余的50ml反应混合物不经过滤而用作对照。在第一次纳米过滤(持续时间6h，dk，20巴)后，将收集的渗透物和渗余物混合，并再添加5mm的ba底物。也添加另外的底物至对照条件。反应16h后，进行第二次纳米过滤(持续时间5h，200，20巴)。在不同的时间段后采集反应渗透物和渗余物样品，并准备用于定量分析。表9总结了测试的每个步骤。表9：间歇性在线/离线nf测试的总结。图16显示了间歇性在线/离线纳米过滤偶联酶促反应：ba底物随时间的消耗。ba底物和ad6的初始量分别为10和250mm；第一次纳米过滤在反应16h后运行(desal-dk膜，20巴)。反应24h后，向酶罐e-1中添加ba(5mm)。第二次纳米过滤在反应39h后运行(200膜，20巴)。而且如表9中总结的，使用溶剂稳定性ta-v2酶间歇进行第一不对称胺化偶联nf分离。根据稳定性实验，约55％的ba在16h内转化(图16，反应_1)。在随后的6h内由于仅2％的ba底物进一步转化，几乎达到了热力学平衡(图16，对照反应_1)。相比之下，6h的nf增加了额外10％的底物转化率，因此显示出原位产物去除对热力学平衡转移的益处(图16，nf-1)。添加5mm底物后，在16h内在nf反应混合物和对照中均转化了额外约17％的ba(图16，反应_2和对照反应_2)。尽管反应速率降低，但ta-v2酶在对照和nf系统中仍然具有活性，因此证明该酶在hmw胺供体(ad6)存在下可以承受nf装置的机械应力(高压和高搅拌速率)。使用200进行的选择性产物去除提高了产物的平衡，从而增加了额外15％的产物形成(图16，nf-2)。根据膜筛选和离线测试，当使用这两种膜时，保留了超过80％的peg-c(图17和图18)。desal-dk选择性地过度浓缩mppa(1-甲基-3-苯基丙胺)产物，然而，与该产物一起，约58％的未反应底物在渗透物流中损失了。使用desaldk时观察到的渗透物通量下降可能与膜与mppa和ba溶质的相互作用有关(参见vanderbruggen等人在environ.sci.technol.[环境科学与技术]35,17,3535-3540中)。更可能的是，通量下降是由于膜基质的收缩(参见yang,x.j.等人在j.membr.sci.[膜科学杂志],190(2001)45-55中)。desaldk是为水性系统设计的纳米过滤膜，因此在长时间暴露于mppa、hmw胺和ba溶质中时，它可能会损失其结构完整性。尤其是用于提高底物溶解度的共溶剂dmso，可能会影响膜的性能。对测试膜的目视观察确认了这种假设。相比之下，在视觉上没有观察到200膜的活性表面的变化。相反，这种有机溶剂纳米过滤(osn)膜即使暴露于较高的底物浓度和dmso共溶剂浓度时也是稳定的。除了胺供体保留和热力学平衡转移以外，高选择性膜还会提高产物在较低稀释水流中的浓度。由于mppa产物(其比溶剂(缓冲液)穿过desal-dk膜的输送更快)的选择性去除，mppa浓度从5.9mm提高到7.3mm，而ba底物的部分保留减少了产物流污染(图19a)。即使选择性较低，200也可以在较低的稀释流中提高热力学平衡转移和mppa浓度(图19b)。实施例7：在线纳米过滤偶联酶促反应高反应速率与相对较低的渗透物通量和选择性产物去除的组合表明具有通过p-1渗滤泵(图3)连续底物给料的在线nf可作为进一步流程优化的智能给料策略。渗滤取决于渗透物流速，因为渗滤以相同的渗透速率发生。因此，反应速率和渗透速率必须匹配。当高度浓缩的底物溶液(ba200mm，在dmso中)进行渗滤时，ba在酶罐6中积累(图20)。此外，性能最佳的desal-dk膜与大量ba、mppa和dmso不相容，而溶剂稳定性200在高底物浓度下显示出较低的产物选择性(图21)。图20显示了在线纳米过滤(desal-dk膜)偶联酶促反应。渗透物通量很低，因此手动渗滤ba(40mm)。1.5h后，18％的ba转化。实验3h后，通量突然增加；200mmba进料溶液以相同的渗透速率自动渗滤，因此酶罐(参见图3，酶罐(6))中的ba渗余物浓度(黑点)增加。当通量增加时，ba保留急剧下降(黑线)；mppa浓度随ba的添加增加不大(浅灰色点)。图21显示了在线纳米过滤(200膜)偶联酶促反应。随着底物浓度(黑线)的增加，选择性产物去除(黑条)降低。由于渗透速率和反应速率不匹配，ba在酶罐(参见图3，酶罐(6))中积累。上述实施例1-7证明，hmw供体可成功地用于转氨过程，即用于手性胺的合成和膜辅助的原位产物回收。当前第1页1 2 3