本发明涉及癌特异性基因表达调节能力及对干细胞转染能力优秀的重组腺病毒及上述重组腺病毒转染干细胞，以及利用该方法传递基因及癌特异性治疗剂。
背景技术：
随着基因传递载体的腺病毒的各种有点被发掘，在癌症基因治疗中其使用频率呈持续增加趋势。如使用基因疗法治疗癌症时，无需长期并持续表达治疗基因的优点。另外，由于被用于载体的病毒而诱导的宿主免疫反应不会有太大的问题，或者反而会成为有点。因此，腺病毒作为癌症治疗用的遗传基因传达体备受瞩目。特别是，只在癌细胞(肿瘤)内繁殖的选择性杀伤癌细胞腺病毒对正常细胞没有影响，只会选择性并消灭癌细胞，因此被视为新一代未来治疗剂。
但是，作为基因治疗剂，全身注射腺病毒会蓄积在肝组织而诱发毒性或因血液中生成中和抗体，在体内维持时间短，并腺病毒达到肿瘤部位的传递效率低的缺点。因此，在遗传因子治疗中，迫切的需求开发即能维持着腺病毒的优势，并肿瘤部位的特异性及传递效率高的基因治疗剂。
基因治疗剂之一的间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)，在骨髓等多种组织中容易分离，并易于体外培养和增值。另外，体内注射细胞时，可移动到损伤部位，代替损伤细胞，分泌多种生长因子及细胞因子，有抑制疾病及促进损伤部位再生效果。另外，msc具有移动到肿瘤的肿瘤指向性(tumortropism)特征，并且不表达共刺激分子(co-stimulatorymolecule)。所以免疫反应低或不产生免疫反应，可进行全身性注射，自我治疗甚至可以进行异体治疗的优点。
因此，利用没有免疫源性，并具有肿瘤靶点性的msc，试着努力开发出干细胞治疗剂。利用间充质干细胞和腺病毒基因的治疗试着被开发为治疗剂，但没有特定受体的间充质干细胞很难被腺病毒感染。所以到目前为止，间充质干细胞很难作为腺病毒的载体。
甚至，为了基因治疗剂产业发展，一直需要不是自体来源，而是品质不变和能减少单价的异体来源细胞治疗剂的开发。
技术实现要素：
技术问题
本发明的发明人们改善了全身注射和干细胞转染率低的腺病毒，并持续研究注射后高效率传递腺病毒的方法。即使在浓度低的情况下，有优秀的干细胞的转染能力和癌特异性基因表达调节能力的腺病毒、上述腺病毒转染干细胞的开发、利用上述干细胞可以全身给药、对癌的靶向能力优秀及不引起肝毒性等问题。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供包含血清型35的纤维蛋白突触(fiberknob)，并改善转染能力的重组腺病毒。
上述血清型35的纤维蛋白突触(fiberknob)序列编号1的序列组成。
上述重组腺病毒可进一步包括基因表达控制序列和调节靶基因表达的靶基因。
具体地，上述重组腺病毒是5'至3'方向(a)拷贝(copy)6个hre(缺氧反应元件)的结构域序列；(b)拷贝2个afp(α-feto蛋白)增强子a序列，(c)拷贝1个afp启动子的增强子b序列，和(d)包括afp启动子序列的基因表达控制序列；上述基因表达控制序列有效连接(operativelylinked)的靶基因；和血清型35纤维蛋白突触(fiberknob)序列。
另外，本发明提供了上述含有重组腺病毒的间充质干细胞(mesenchymalstemcell,msc)。
上述间充质干细胞可包括抗癌间充质干细胞并包含靶基因和序列编号1序列的重组腺病毒。
上述重组腺病毒可进一步包括控制目的基因表达的基因表达控制序列。
上述基因表达控制序列可以包括序列编号5的afp启动子序列或序列编号8的tert启动子序列。
上述间充质干细胞可被大于0.01moi至小于100moi浓度，并包含靶基因及序列编号1的重组腺病毒，最多可转50小时。
上述组合物用于全身或局部给药。
发明效果
本发明的重组腺病毒具有优秀的转染干细胞和调节特异性基因表达的能力，并且即使在低浓度也能够导入干细胞的特性。特别是，当利用本发明的腺病毒时，由于在低浓度下也可感染到干细胞，因此在导入腺病毒的过程中降低干细胞的凋亡率，从而具有提高了基因治疗剂的生产效率的优点。另外，被导入本发明腺病毒的干细胞具有生存能力和癌细胞杀伤能力更强的优点。载入到干细胞上的腺病毒能够自我增殖，因此在应用于基因治疗时可以提高治疗效果，并且由于注射的干细胞不会残留在体内而不会引起副作用。此外，与其他腺病毒治疗剂相比，被载入本发明腺病毒的干细胞及其组合物比其他腺病毒治疗剂更适合全身给药，并且不会引起肝毒性和免疫反应。因为能够进行异体治疗，可降低治疗剂的成本。
附图说明
图1为，由本发明实施方案制备，由重组afp启动子控制表达荧光素酶控制质粒的启动子及大小。
图2为，由本发明实施方案制备的重组afp启动子，对肝癌特异性结果。
图3为，由本发明实施方案制备，被载入启动子基因表达腺病毒的穿梭载体的结构。
图4为，根据本发明实施方案制备的配备有肝癌特异性启动子，并有复制缺陷型腺病毒的同源重组过程和结构。
图5为，根据本发明实施方案制备，可被修饰afp启动子调节的腺病毒制备过程。
图6a,6b,6c,6d,6e及6f为，根据本发明实施方案制备，载入肝癌特异性启动子的重组腺病毒的细胞系来确认，是否具有基因表达活性并在低氧状态下是否基因表达量增加。图6a至6d为，肝癌细胞系的结果。6e和6f分别表示，正常细胞系和肺癌细胞细(a549)的结果。
图7为，根据本发明实施方案制备，包含肝癌特异性启动子的腺病毒在肿瘤组织中表达gfp荧光水平的结果。
图8为，受修饰的afp启动子调控病毒复制的腺病毒，具有肝癌细胞特异性杀伤腺病毒穿梭载体的结构。
图9为，受修饰的afp启动子调控病毒复制的腺病毒，具有肝癌细胞特异性杀伤腺病毒穿梭载体的同源重组过程和结构。
图10a,10b,10c,10d及10e为，根据本发明实施方案制备，载入肝癌细胞特异性杀伤腺病毒对不同细胞系的杀伤结果。图10a,10b,10c为，对肝癌细胞系的肝癌细胞特异性杀伤效果。图10d及10e为，正常细胞系的杀伤结果，并且在正常条件(normoxia)及低氧条件(hypoxia)时的杀伤效果。
图11为，根据本发明实施方案制备，载有肝癌特异性启动子的重组腺病毒在正常条件(normoxia)和低氧(hypoxia)下的复制能力。
图12为，根据本发明实施方案制备，载有肝癌特异性启动子的重组腺病毒在正常氧气浓度(肿瘤周边部位；normoxia，红色框)及低氧浓度(肿瘤中央部位；hypoxia，蓝色框)的复制能力，在spheroid培养的肝癌组织(hep3borganoidsystem)，通过荧光染色确认。
图13为，根据本发明实施方案制备，载有肝癌特异性启动子的重组腺病毒的增殖能力和抗癌效果(细胞实验)，对肝癌皮下模型(afp+hep3bxenograftmodel)效果的结果。
图14为，根据本发明实施方案制备，载有肝癌特异性启动子的重组腺病毒，对肝癌同种移植模型的抗癌效果的结果。
图15为，根据本发明实施方案制备，载有肝癌特异性启动子的重组腺病毒的抗肿瘤效果的结果。
图16a为，表达35型纤突(k35)，并且不可克隆的腺病毒的制造方法。
图16b为，腺病毒纤突(fiber)末端表达rgd，并且不可克隆的腺病毒的制造方法。
图16c为，腺病毒纤突(fiber)变形，对间充质干细胞转染效率(trasductionefficiency)的结果。
图17为，根据本发明实施方案制备的重组腺病毒纤突(fiber)变形而出现基因传递效率的结果。
图18为，根据本发明实施方案制备，被腺病毒转染间充质干细胞的癌细胞杀伤能力，通过mmt试验确认，并且通过q-pcr检测间充质干细胞内病毒增殖能力。
图19为，根据本发明实施方案制备的人体肝癌原位移植(orthotopic)模型构建过程。
图20为，确认根据本发明实施方案构建的人体肝癌原位移植(orthotopic)模型的肿瘤生成及生长的荧光(荧光素酶)照片。
图21为，根据本发明实施方案制备的腺病毒载入间充质干细胞，并注射到肿瘤组织后，体内肿瘤组织的表达靶向性及腺病毒增殖的荧光(荧光素酶，luc)照片。
图22为，根据本发明实施方案制备，并能被msc传递基因，具有肝癌杀伤性腺病毒的同源重组过程及构造。
图23a及23b为，根据本发明实施方案制备，并能被msc传递基因，可表达luc肝癌杀伤性腺病毒的同源重组过程及构造。
图24a及24b为，载入根据本发明实施方案制备，并转染间充质干细胞的腺病毒，比较根据腺病毒纤突(fiber)变形而出现基因传递效率的结果。图24b为，根据本发明实施方案制备，并转染至间充质干细胞的腺病毒的荧光(luc)基因表达效率的结果。
图25为，根据本发明实施方案制备，可转染至干细胞，并表达治疗基因腺病毒的构造。
图26为，根据本发明实施方案，可被干细胞转染，并表达治疗基因slrp6的肝癌靶向性腺病毒同源重组过程及构造。
图27为，根据本发明实施方案制备的肝癌特异性杀伤腺病毒，对细胞系[(肝癌细胞，hep3b、huh7、hep1)及正常细胞(hdf)]的杀伤效果比较图表。
图28为，根据本发明实施方案制备的肝癌特异性杀伤腺病毒对间充质干细胞杀伤能力的结果。图表的纵轴表示间充质干细胞的生存率(cellviability)，图表的横轴表示感染间充质干细胞的腺病毒(ha2bm-d19-k35/slrp6)的浓度，各个实验组为感染后经过时间(2天、5天)。
图29为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞中增殖能力的结果。图表的纵轴表示腺病毒的数量(adgenomecopies,vp/ml)，图表的横轴表示感染间充质干细胞的腺病毒(ha2bm-d19-k35/slrp6)，各个实验组为感染后经过时间(2天、5天)。
图30a及30b为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞的体内抗癌效果的结果。
图31为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞的体内抗癌效果，通过定量的方式显示结果。
图32为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞的体内抗癌效果，通过离体(exvivo)图像确认的结果。
图33a及33b为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞的体内抗癌效果，通过肿瘤重量(33a)及增值(flux)(33b)的差异来比较的结果。
图34为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞在体内对肝数值变化影响的结果。
图35为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞被全身投药时，在体内分布的结果。
图36为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞对肝癌组织影响的结果。
图37为，根据本发明实施方案制备，并载入肝癌特异性杀伤腺病毒的间充质干细胞对肝癌组织影响的结果。
图38a,38b,38c及38d为，根据本发明实施方案，表达wnti的hcc-靶向oad构造及特征的结果。图38a是hcc-oad-wnti构造，38b是wnt信号通路相关的基因的表达的结果，图38c是hcc-oad-wnti对hcc杀伤作用的结果，38d是在缺氧和正常氧气条件下hcc-oad-wnti对hcc杀伤能力。
图39为，根据本发明实施方案，载入hcc-oad-wnti的间充质干细胞(hcc-oad-wnti/msc)对癌细胞杀伤效果的结果。未治疗组(untreated)、msc单独处理(msc)、裸病毒(nakedad)组(hcc-oad-wnti)作为对照组进行了实验。
图40为，根据本发明实施方案，载入hcc-oad-wnti的间充质干细胞(hcc-oad-wnti/msc)的药动力学特征的结果。
具体实施方式
本发明具有向间充质干细胞的基因传递能力优秀、在低浓度下有优异的向间充质干细胞的转染能力、基因表达调节能力优秀的重组腺病毒的间充质干细胞(ad-msc)。包括本发明的间充质干细胞(ad-msc)及基因传递成分，并包含本发明的间充质干细胞(ad-msc)及抗癌治疗的成分。
在下文中，将更详细地描述本发明。
但是，本发明可以进行多种变更，并具有多种形态，以下所述的特定实施例和说明只是为了帮助本发明的理解，而不是将本发明限定为特定的发起形式。本发明的范围应被理解为包括本发明思想及技术范围内的所有变更、均等物或替代物。
根据本发明的一个方面，本发明包括含有序列编号1的纤突序列重组腺病毒。另外，本发明提供了上述载入了重组腺病毒的间充质干细胞(ad-msc)。
上述腺病毒，由于中等的基因组大小、易于操作、高滴度、靶细胞范围广，以及极好的感染性而被广泛用作基因传递载体。基因组的两端均包含100-200bp的itr(反向末端重复序列)，这是dna复制和包装所必需的顺式元件。基因组的e1区(e1a和e1b)调节宿主细胞基因转录和转录的蛋白质编码。e2区(e2a和e2b)参与病毒dna复制的蛋白质编码。目前开发的腺病毒中，缺少e1区的无复制能力的腺病毒被广泛使用。同时，从常规腺病毒载体上去除e3区，以提供插入外源基因的位置。(thimmappaya,b.etal.,cell,31:543-551(1982)；及riordan,j.r.etal.,science,245:1066-1073(1989))
本发明的腺病毒具有包含序列编号1纤突的特点。经常规研究表示，腺病毒用作基因或细胞疗法的载体的可能性，但腺病毒在血液中迅速去除或引起其他免疫反应，从而导致治疗效率降低的问题。作为对此的解决方案，已经提出将腺病毒安装在间充质干细胞中，但是将腺病毒引入间充质干细胞的效率非常低，并且使用高浓度的腺病毒来提高腺病毒的引入率时干细胞的生存能力减少，并且存在干细胞在到达肿瘤部位之前死亡的问题。所以难以将载入腺病毒的间充质干细胞用于实际治疗。
然而，本发明的包含序列编号1纤突的腺病毒被重组时，导入间充质干细胞的效率非常优异，并且具有即使在低病毒浓度下也可以良好导入的特征。因此，本发明具有非常重要的可专利性，因为它解决了在常规基因治疗中的问题，即腺病毒的缺点及向间充质干细胞的引入效率低的问题。
在本发明的一个实施方案中，当将本发明的腺病毒引入间充质干细胞中时，确认了即使在0.02moi浓度也能将载体很好地转染至间充质干细胞(图18)。另外，当使用其他载体时，100moi或500moi不能很好地引入病毒载体(图17及图24)。利用本发明的重组腺病毒时，确认了即使在5moi下也能很好地载入载体。
为了优化利用载有本发明ad的间充质干细胞的抗癌效果和到达目标部位，并载入ad-的msc达到最佳效果，可调整载入(loading)干细胞内的腺病毒(ad)的量。
具体可使用0.001moi至100moi的腺病毒，转染msc50小时或更短。优选转染量为0.01moi至100moi或更低。更具体为，用含有浓度小于50moi，或0.01moi至50moi，或浓度为2moi至10moi的血清型35的突触(knob)，并转染间充质干细胞腺50小时或更短。在这种情况下，解决了腺苷病毒含量过多而影响msc自身生存率下降的问题，同时优化了ad在msc中的增殖。体内注射msc达到目的部位时，ad增殖能够获得更大的抗癌效果，可通过病毒增殖和msc生存率达到均衡的最佳条件来制作被ad转染的msc。
本发明的腺病毒可以进一步包括基因表达控制序列。上述基因表达调节序列，可包括在常规腺病毒，如果在本发明的技术领域内被熟知的都被纳入本发明中。
上述基因表达调节序列可插入e1a基因的启动子序列的位置，可控制e1a基因的表达。另外，本发明的基因表达控制序列的基因组优选插入缺失的e1区域(e1a区域和/或e1b区域，优选e1b区域)和/或e3区域，更为优先插入到缺失的e1领域。另外，本发明的基因表达调节序列-表达基因组也可插入到缺失的e4领域。如本文所用，与病毒基因组序列结合使用的术语“缺失”，不仅是指包括该序列被完全缺失，而且包括部分缺失。
作为一个具体的例子，当本发明的基因表达控制序列位于e1a基因的上游时，即当本发明的基因表达控制序列与e1a基因序列自动连接时(hre-ea-eb-afpm-e1a)，重组腺病毒的复制受本发明的基因表达控制序列的调控。本发明的基因表达控制序列位于缺失的e3基因区域中时，可将以“基因表达控制序列-靶基因”的形式插入至缺失的e3基因区域中。本发明的基因表达控制序列位于缺失的e4基因区域中时，可将以“基因表达控制序列-靶基因”的形式插入至缺失的e4基因区域中。
插入重组腺病毒的靶基因，应优选插入启动子-靶基因的基因组。在此种情况下，作为启动子可以使用本发明的基因表达控制序列(例如，ea-eb-afpm，ea2-eb-afpm或hre6-ea2-eb-afpm)或常规的启动子。与目标基因结合的常规启动子应优选来自动物细胞，更优选来自哺乳动物细胞，以调节目标基因的转录。所述启动子来自哺乳动物病毒及哺乳动物细胞基因组，例如u6启动子，h1启动子，cmv(巨细胞病毒)启动子，晚期腺病毒启动子，牛痘病毒7.5k启动子，sv40启动子，hsvtk启动子，rsv启动子，ef1alpha启动子，金属硫蛋白启动子，β-肌动蛋白启动子，人il-2基因启动子，人ifn基因启动子，人il-4基因启动子，人淋巴毒素基因启动子，人gm-csf基因启动子，诱导型启动子，癌细胞特异性启动子(例如tert启动子，psa启动子，psma启动子，cea启动子，e2f启动子和afp启动子)和组织特异性启动子(例如白蛋白启动子)，并且不限于此。
为表达靶基因的表达构建体中，优选多腺苷酸化序列偶联于靶基因的下游。上述聚腺苷酸化序列是小的生长激素终止子(gimmi,e.r.,etal.,nucleicacidsres.17:6983-6998(1989))、源自sv40的聚腺苷酸化序列(schek,n,etal.,mol.cellbiol.12:5386-5393(1992))、hiv-1polya(klasens,b.i.f.,etal.,nucleicacidsres.26:1870-1876(1998))、β-珠蛋白polya(gil,a.,etal,cell49:399-406(1987))、hsvtkpolya(cole,c.n.andt.p.stacy,mol.cell.biol.5:2104-2113(1985))或多瘤病毒polya(batt,d.bandg.g.carmichael,mol.cell.biol.15:4783-4790(1995))，并且不限于此。
另外，由于腺病毒可以包装多达野生型基因组的约105％，因此它可以另外包装约2kb。(ghosh-choudhuryetal.,emboj.,6:1733-1739(1987)).因此，插入到腺病毒中的上述外源序列可以进一步与腺病毒基因组结合。
腺病毒携带的外源基因与附加体的复制方式相同，因此对宿主细胞的遗传毒性非常低。因此，已确定使用本发明的腺病毒基因传递系统的基因治疗将非常安全。
如本文所用术语“k35纤维”是指腺病毒血清型35的纤维蛋白或编码该蛋白的核苷酸序列。腺病毒是一种带有衣壳(capsid)的70-90nm无包膜病毒，它由三种主要的暴露结构蛋白，六邻体(hexon)，纤突(fiber)和戊烯碱基(pentonbase)组成。从衣壳的各个顶点突出呈球形(knob)的蛋白质称为纤维。腺病毒通过上述纤维蛋白与感染细胞的受体结合，并且根据血清型表现出而出不同的感染及症状。
上述k35纤突序列可以包括序列编号1的核苷酸序列，并且可以由序列编号1的核苷酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中，将传递靶基因的纤突转化为k35时，其结果为即使在低浓度的腺病毒也能够良好地将基因导入间充质干细胞(msc)。另外，为了将腺病毒引入间充质干细胞中，间充质干细胞被高浓度腺病毒感染时生存能力降低，例如间充质干细胞的死亡。间充质干细胞被低浓度的腺病毒感染时，证实了腺病毒转染间充质干细胞后发生增殖。因此当使用上述间充质干细胞时具有更好的抗癌作用。
例如，本发明的腺病毒中包括的基因表达控制序列以5'至3'方向是(a)hre(hypoxia-responseelements)结构域序列，(b)afp(alpha-fetoprotein)启动子增强子a序列，(c)afp启动子的增强子b序列，及(d)包含afp启动子序列的基因表达控制序列，并且包含上述靶基因与基因表达控制序列有效连接(operativelylinked)。
因此，本发明的腺病毒从5'到3'方向包括(a)6个拷贝(copy)的hre(hypoxia-responseelements)结构域序列；(b)2个拷贝的afp(alpha-fetoprotein)增强子a序列，(c)1个拷贝的afp启动子的增强子b序列，及(d)afp启动子序列的基因表达控制序列。并且包含上述与基因表达控制序列有效连接(operativelylinked)的靶基因和血清型35纤维蛋白突触序列的腺病毒。
例如，本发明的腺病毒可包括包含5mmtert启动子在内的基因表达调节序列和所述基因表达调节序列的可启动连接的靶基因。
上述基因表达控制序列是指能够控制表达，并且在特定条件下才能表达靶基因的序列。
如本文所用，术语“afp启动子”是指促进afp(alpha-fetoprotein)蛋白表达的启动子，其在卵黄囊和胎儿发育期间在肝脏中高表达的血清蛋白。由于除了成年肝癌患者外几乎没有检测到afp蛋白，因此它被用作肝癌的有用标志物，由于调节其表达的增强子活性的差异，血清中afp的表达水平因人而异。因此，当使用由afp启动子和增强子的特定组合组成的表达控制序列时，可以在癌细胞中特异性表达传递的靶/治疗基因。上述，afp启动子的序列可以包括序列编号5的核苷酸序列。
如本文所用，术语“hre结构域序列”是指低氧-反应性增强子序列。在缺氧条件下，细胞中特定基因的表达受调节。(bunnandpoytonphysiol.rev.76:839-885(1996)；dachsandstratfordbr.j.cancer74:5126-5132(1996)；guilleminandkrasnowcell89:9-12(1997))大多数肿瘤细胞的血液供应不足，因为肿瘤细胞比正常形成血管的内皮细胞生长更快，因此导致肿瘤缺氧。在大多数固体性瘤当中会发生这种低氧状态会导致，如糖酵解酶(glycolyticenzyme)或促血管生成因子(proangiogenicfactor)幸存因子的产生，使它们对放射疗法或化学疗法具有耐受。缺氧反应的主要介质是转录复合物hif(hypoxiainduciblefactor)-1α，它在各种基因的调控位点与hre相互作用。上述基因包括糖酵解酶编码基因，如血管内皮生长因子(vegf)基因、烯醇酶1、gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)。本发明可利用在低氧条件下调节基因的表达，并且与hif-1α相互作用的序列hre。在本发明中，hre不仅极大地改善了重组腺病毒的肿瘤细胞选择性，而且具有增加腺病毒增殖能力的作用。
根据本发明正确实施方案，本发明的基因表达控制序列，可包括hre序列，并且为了改善hre序列的转录活性，可包含hre重复序列。更优选的是，本发明的基因表达调节序列可重复1到10次，更为优选的是1到8次，最优选的是重复5到7次。例如6复制(copy)的hre(hypoxia-responseelents)域序列可包含序列号2的序列。
上述基因表达调节序列是为了提高传达基因的表达效率，可以包括序列编号3的增强子a的序列，上述增强子a的序列包括重复序列的形式。本发明的重复序列可能连续重复(immediatelyadjacent)，或可在不影响启动子或增强子活性范围内，适当长度的链接核苷酸之间可不连续重复(discontinuousrepeated)。
本发明的基因表达调节序列中所包含的增强子a序列的序列编号3核苷酸序列，优选的是重复1到10次，更为优选的是2到6次，最优选的是3到5次重复的序列。
根据本发明的正确实施方案，本发明的基因表达控制序列从5'至3'方向上为hre结构域序列、增强子a序列、增强子b序列及afp启动子序列。另外，优选的是hre序列重复6次，而强子a序列重复2次。
根据本发明的正确实施方案，本发明的重组腺病毒进一步包括作用并连接于上述基因表达调节序列的靶基因。
在本发明说明书中，术语“可操作地连接(operativelylinked)”是指核酸表达控制序列(例如，启动子、信号序列或转录调节子结合位点的阵列)与另一个核酸序列之间的功能性结合。由此，可调节序列调节其他核酸序列的转录和/或翻译。与本发明的基因表达控制序列可操作连接的表达靶基因(目的基因)的类型无特别限制。
上述表达对象的基因在目的部位是为了表现基因功能，并在基因角度也可以说是靶基因，上述靶基因也包括治疗基因。上述治疗基因在本发明的说明中也可被称为治疗性转基因(therapeutictransgene)。在本发明的说明中，术语“治疗性转基因(therapeutictransgene)”是指显示体内疾病或症状的改善或治疗效果的核苷酸序列。上述治疗性转基因为在癌细胞中表达并显示出治疗效果的核苷酸序列。
上述靶基因是如肿瘤抑制基因、自杀基因、抗原性基因、免疫增强基因、细胞毒性基因、细胞生长抑制基因、细胞凋亡基因、抗新血管生成基因、转移抑制基因、抗体基因、免疫调节基因、可被选择为由本发明载体传递的核苷酸组成。
本发明中说明书的术语“肿瘤抑制因子基因(tumorsuppressorgene)”是指能够通过在靶细胞中表达而抑制肿瘤表型或诱导凋亡的核苷酸序列。实施本发明时有用的肿瘤抑制基因，包括p53基因、apc基因、dpc-4/smad4基因、brca-1基因、brca-2基因、wt-1基因、视网膜细胞瘤基因(leeetal.,nature,1987,329,642)、mmac-1基因、腺瘤性息肉病螺旋蛋白(adenomatouspolyposiscoilprotein)(美国专利公报5,783,666号)，结肠癌缺失(dcc)基因，mmsc-2基因，nf-1基因，位于3p21.3号染色体上的非喉癌抑制基因(chengetal.proc.nat.acad.sci,95:3042-3047(1998))，mts1基因，cdk4基因，nf-1基因，nf-2基因和vhl基因。
本发明中，能通过抗肿瘤腺病毒转运到细胞中的外源基因序列是诱导癌细胞死亡并最退化肿瘤的癌症治疗基因，可包括抑癌基因，免疫调节基因[例如：细胞因子基因，趋化因子基因和共刺激因子(costimulatoryfactor:b7.1、b7.2及t细胞活性所需的共分子)]、抗原性基因、自杀基因、细胞毒性基因、细胞生长抑制基因，促细胞死亡基因及抗新血管生成基因，但不限于此。
自杀基因是表达一种物质的核酸序列，该物质诱导细胞容易被外部因素杀伤或引起细胞毒性。众所周知的自杀基因是胸苷激酶(tk)基因(美国专利第5,631,236号、第5,601,818号)。表达tk基因产物的细胞易受更昔洛韦(gancyclovir)的选择性杀伤作用。肿瘤抑制基因是指编码抑制肿瘤形成的多肽的基因。肿瘤抑制基因是哺乳动物中天然存在的基因，并且该基因的缺失或失活被认为是肿瘤发生的必要前提。肿瘤抑制基因的例子有apc，dpc4，nf-1，nf-2，mts1，wt1，brca1，brca2，vhl，p53，rb，mmac-1，mmsc-2、视网膜细胞瘤基因(leeetal.nature,329:642(1987))、腺瘤性息肉病螺旋蛋白(adenomatouspolyposiscoilprotein)(美国专利公报5,783,666号)、位于3p21.3号染色体上的非喉癌抑制基因(chengetal.proc.nat.acad.sci,95:3042-3047(1998))，结肠癌缺失(dcc)基因、mts1基因，cdk4基因，vhl,p110rb,p16及p21等肿瘤抑制基因ink4家族的成员及其治疗有效片段(例p56rb、p94rb等)。本领域技术人员将理解，除上述示例基因外，所有其他已知的抗肿瘤基因也可用于本发明。
在本发明的说明书中，术语“抗原基因(antigenicgene)”是指在靶细胞中表达并产生免疫系统可识别的细胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。此抗原基因的实例包括癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,cea)，her-2，psa(prostatespecificantigen)和p53(levine，a.，国际专利申请公开wo94/2167号)。为了促进对免疫系统的识别，可以将抗原基因与mhci型抗原结合。
本发明的说明书中的术语“细胞毒性基因(cytotoxicgene)”是指，在细胞中表达并显示出毒性作用的核苷酸序列。这种细胞毒性基因的实例包括编码假单胞菌外毒素(exotoxin)、赖氨酸毒素、白喉毒素、cd(cytosinedeaminase)、super-cd(super-cytosinedeaminase)，tk(thymidinekinase)等核苷酸序列。
本发明说明中的术语“细胞生长抑制基因(cytostaticgene)”是指在细胞中表达并在细胞周期中终止细胞周期的核苷酸序列。此种细胞增殖抑制基因的实例包括p21、视网膜母细胞瘤基因、e2f-rb融合蛋白基因、编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的基因(如，p16，p15，p18和p19)、生长停止特异性同源盒(growtharrestspecifichomeobox:gax)基因(国际专利申请公开wo97/16459和wo96/30385号)等，但不限于此。
在本发明说明中的术语“凋亡基因(apoptoticgene)”是指表达并诱导程序性细胞凋亡的核苷酸序列。此细胞死亡基因包括p53、trail、mda-7(il-24)、腺病毒e3-11.6k(来源于ad2和ad5)或腺病毒e3-10.5k(来源于ad)、腺病毒e4基因、p53途径基因和胱天蛋白酶编码基因。
在本发明的说明中的术语“抗血管生成基因(anti-angiogenicgene)”是指被表达并从细胞中释放出抗血管生成因子的核苷酸序列。抗血管生成因子包括伐他汀(vastatin)、血管抑素、tie2(pnas,95:8795-800(1998))和血管内皮生长因子(vegf)的抑制剂、内皮抑素、vegf诱饵蛋白、vegftrap、vegfsirna等。
抑制浸润而抑制转移抑制基因，包括brms1、crsp3、drg1、kai1、kiss1、nm23及多种timp(tissueinhibitorofmetalloproteinase)。
本发明说明中的术语“抗体基因(antibodygene)”是指与正常细胞不同，优先或独占性与癌细胞的表达抗原结合，产生够诱导癌细胞凋亡的特定抗体的核苷酸序列。此抗体基因包括编码anti-dr4/dr5,anti-ctla-4,anti-pd-1,anti-pd-l1,anti-her2/neu,anti-vegf,anti-vegfr,anti-cmet,anti-survivin,anti-egfr,anti-wnt,anti-ly49等。
在本发明的说明书中的术语“免疫相关基因(immune-relatedgene,immune-modulatinggene)”是指调节免疫相关因子表达的所有基因，包括细胞因子(如干扰素-α、-β、-δ、-γ)、白细胞介素(如il-1、il-2、il-4、il-6、il-7、il-10、il-12、il-17、il-18、il-19、il-20、il-23)、集落刺激因子(如gm-csf、g-csf)基因、趋化因子家族(单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)、单核细胞趋化蛋白2(mcp2、单核细胞趋化蛋白3(mcp3)、单核细胞趋化蛋白4(mcp4)、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip-1α)、巨噬细胞炎性蛋白1β(mip-1β)、巨噬细胞炎性蛋白1γ(mip-1γ)、巨噬细胞炎性蛋白3α(mip-3α)、巨噬细胞炎性蛋白3β(mip-3β)、趋化因子(elc)、巨噬细胞炎性蛋白4(mip4)、巨噬细胞炎性蛋白5(mip5)、ld78β、rantes)、sis-ε(p500)、胸腺活化调节趋化因子(tarc)、嗜酸性粒细胞趋化因子、i-309、人蛋白hcc-1/ncc-2、人蛋白hcc-3、鼠蛋白c10等)及辅助刺激因子(costimulatoryfactor：和b7.1、b7.2等活化t细胞所需的辅助分子)。
可通过本法载体传递的基因有cd44v3/6、adp(adenovirusdeathprotein)、ifn-γ、hif-1αsirna、ido2(idolamine2,3-dioxygenase2)sirna、wntdecoy蛋白质、vegfdecoy蛋白质、cmetsirna、microrna(microrna-26a)、mir-99a、mir-143、mir-193a-3p、mir-206、mir-506(fokheadboxq1)、shakt1、shmyo6、nis(sodium-iodinesymporter)、hsv-tk、lmp2a/lmp1、ip-10/cxcl10、pf-4var/cxcl4l1、oncostatinm、靶向cd147的人-鼠嵌合抗体(human-mousechimericantibody)、人抗体(humanizedantibody)、靶向lin28的锌指蛋白、靶向cmet的锌指蛋白、cas9蛋白质、引导rna、talen蛋白质、trail蛋白质、pten(phosphataseandtensinhomologprotein)编码基因。本发明的治疗性转基因不限于此。上述mir-99a靶向mtor，akt1和fgfr3，并且mir-193a-3p靶向psen1基因。
根据本发明的实施方案，本发明的重组腺病毒可包含编码衣壳蛋白基因的编码荧光蛋白的基因序列。此时，可提供易于追踪腺病毒在转入细胞中的位置。
根据本发明，当将荧光标记蛋白插入构成腺病毒衣壳的蛋白中时，dna翻译为蛋白质时才能确认，而对结合ix蛋白的标记蛋白质的病毒而言，无论病毒的感染途径如何，从病毒感染初期开始最终蛋白质表达和病毒定位。因此，本发明可用于非侵入性分子影像工具。
根据本发明正确实施方案，本发明的衣壳蛋白可以是pix。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明可选择的荧光蛋白包括gfp(greenfluorescentprotein),rfp(redfluorescentprotein),cfp(cyanfluorescentprotein),yfp(yellowfluorescentprotein),bfp(bluefluorescentprotein),egfp(enhancedgreenfluorescentprotein),ecfp(enhancedcyanfluorescentprotein),eyfp(enhancedyellowfluorescentprotein),erfp(enhancedredfluorescentprotein),ebfp(enhancedbluefluorescentprotein)、萤光素酶(luciferase)。
上述间充质干细胞(mesenchymalstemcell,msc)是一种成体干细胞的一种，可分化为多种细胞，例如脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞等。间充质干细胞作为基因载体之一，已被广泛研究，但缺乏特异性受体，因此不会被腺病毒感染，这使得很难将它们用作传递基因载体。
然而，本发明的重组腺病毒通过纤维蛋白的修饰，改善了对间充质干细胞的载入，可有效地当做传递靶基因至体内所需位点的传递系统。
间充质干细胞难以导入腺病毒，为用作基因治疗剂水平，需要大量的腺病毒感染干细胞。然而，腺病毒引起的间充质干细胞的活力和特性降低，并且快速凋亡。但使用含有本发明的序列编号1的序列的重组腺病毒载入间充质干细胞上时，通过实验证实了，即使在低浓度的moi下也可导入腺病毒。因此，在载有本发明的重组腺病毒的干细胞(ad-msc)的情况下，具有比其他干细胞更高的生存力，并且充当腺病毒培养体，并且不会引起免疫原性。它可以作为基因治疗中的优秀基因传递载体。
在本发明的实施方案中，干细胞可以全身注射或局部注射。全身注射方法，包括静脉注射、腹腔注射、肺腔注射、尿道内注射(intravesicalinjection)，并且不限于此。在现有的基因治疗中，将腺苷病毒作为基因载体注射体内后，因自身的免疫原性在达到目的部位之前就被消灭或诱发肝毒性。然而，在本发明的载有腺病毒的干细胞(ad-msc)的免疫反应低或不存在，因此可以全身注射，并具有优秀的肿瘤靶向性，且不引起肝毒性等优点。
在这个方面，本发明的组合物可通过全身注射用于基因传递。一直以来，只将腺病毒载体作为基因载体来使用时不能全身注射，并到达目的部位之前，因体内免疫细胞而很难传递基因。载有本发明腺病毒的干细胞(ad-msc)，具有癌特异性、免疫反应低或无、可全身注射，并且有优秀的肿瘤细胞靶向性、不会引发肝毒性，所以可显著提高基因传递效率。
上述间充质干细胞可从骨髓中分离，可利用患者自身或血液银行的数据库，使用异体间充质干细胞。因此，将本发明载入腺病毒的干细胞作为基因传递时，不仅可以进行自我治疗，还能进行异体治疗。因此，可进一步降低基因治疗的价格。
将包含本发明的基因表达控制序列和靶基因的腺病毒载入间充质干细胞的方法，可以通过本领域已知的各种方法来进行。具体可根据本领域已知的病毒感染方法进行基因载入。
本发明的基因表达调节序列、靶基因及包含k35纤突的重组腺病毒，如上述所示，为避免重复记载，省略其器材。
根据本发明的另一种形态，本发明提供了包含序列号1的重组腺病毒的间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)的基因传递用组合物。
上述本发明用于基因传递的组合物，可以是癌症特异性基因传递组合物。
根据本发明实施例，上述腺病毒所包含的基因表达调节序列，设计为可表达对肝癌细胞特异性基因的启动子及增强子。甚至，低氧条件下具有基因表达更优秀的hre域序列。根据本发明具体实施例，afp阳性或阴性的肝癌细胞，都表达特异性基因，并且在正常细胞确认没有表达靶基因。
根据本发明的实施例，本发明利用全癌特异性腺病毒(pan-cancerspecificoncolyticad)，因有肿瘤组织特异性治疗效果，与癌症种类无关可用于治疗。由本发明用于基因传递的组合物，可以根据靶基因的类型而具有不同的效果，因此其不限于癌症的类型。
为避免与上述内容重叠，可省略对本发明的重组腺病毒和干细胞的描述，并且可以应用上述内容。
在本发明的另一方面，本发明从5'到3'包括(a)hre(hypoxia-responseelements)域序列、(b)afp(alpha-fetoprotein)启动子的增强子a序列、(c)afp启动子的增强子b序列、(d)包含afp启动子序列的基因表达调控序列；并提供基因表达控制序列有效连接(operativelylinked)的治疗基因；编码血清型35(k35)纤维蛋白突触的序列；具有药剂学有效浓度，并载入重组腺病毒的间充质干细胞的组成成分。
上述药剂学的组合物可用于癌症治疗。在本发明中，根据本发明的腺病毒所载入的治疗基因的种类和启动子种类不同，而作为治疗对象的癌症种类也会不同，因此不受上述癌症种类的限制。癌症包括胃癌、肺癌、肝癌、子宫颈癌、白血病、胰脏癌、小儿实体癌、结肠癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾脏癌、头颈癌、脑癌、骨瘤、前列腺癌、软组织癌、甲状腺癌、鼻咽癌、食道癌、眼球癌、乳腺癌或胆管癌。
作为本发明的例子，已经证实了用泛癌(pancancer)特异性肿瘤杀伤型(oncolytic)腺病毒，不受上述肿瘤种类的限制，另外载入肝癌治疗基因并证实了结果，所以可用于治疗肝癌。
上述癌症可以是癌细胞或肿瘤组织。在本发明的实施方案中，载入了腺病毒的干细胞，无论是afp阳性肝癌细胞或afp阴性肝癌细胞，都表达了治疗基因，并显示出癌细胞杀死能力。带有腺病毒的干细胞与肝癌细胞的表型无关都可用于治疗。
当使用装有本发明腺病毒的干细胞(ad-msc)治疗癌症时，表达癌症特异性治疗基因，而不影响正常细胞，并且免疫反应低或无。因此，可全身给药，并且对肿瘤细胞具有优异的靶向特性，并且不会对引起肝毒性，这样可以显着提高基因传递效率。此外，由于间充质干细胞在注射入体内后被腺病毒杀死，因此可解决，因体内残留间充质干细胞而引起的副作用的可能性。
本明书所用术语“治疗”是指通过抑制或减轻与疾病相关的临床情况，有益改变的任何行为。另外与未治疗时的预期生存率相比，意味着增加的生存率。在本发明中的治疗可指如凋亡或杀伤肿瘤细胞。
本说明书所用“个体”可以是脊椎动物，主要为哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、人等。
本发明的组合物可以通过进一步包含药学上可接受的载体来配制。在本发明中，术语“药学上可接受的载体”是指不明显刺激生物，并且不抑制使用成分的生物学活性和性质的载体或稀释剂。本发明中的药学上可接受的载体包括食盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水，葡萄糖溶液，麦芽糊精溶液，甘油，乙醇和这些成分中的一种或多种成分混合使用，根据需要可以加入其他常规添加剂，如抗氧化剂，缓冲剂和抑菌剂，为便于注射到组织或器官，可以注射剂形式配制。
另外，为本发明的组合物可进一步包括填充剂，赋形剂，崩解剂，粘合剂和润滑剂。另外，本发明的组合物可在哺乳动物中被注射后，为提供活性成分的快速、持续或延迟释放，可采用本领域公布的方法进行剂型化。
在本发明中术语“给药”是指用任何恰当的方法向患者引入本发明的组合物，本发明的组合物的给药路径为了本法的复合物到达目的组织，可选择口服或非口服等多种途径。腹膜内给药，静脉给药，肌内给药，皮下给药，皮内给药，口服，局部给药，鼻内给药，肺内给药，直肠内给药，应优先选择静脉注射，但不限于此。
如本文所用“有效量”是指延迟或完全停止待治疗的特定疾病的发作或发展所必需的量。在本发明中，可以药物有效量给予组合物。显然，一天的使用量可在正确的医学判断范围内通过处置医生决定。根据本发明的目的，针对特定患者的具体治疗有效量，包括想要达成的反应的种类和程度、根据不同情况是否使用不同的制剂等具体组成物、患者的年龄、体重、健康状态、性别、饮食、给药时间、给药途径及复合组比率、治疗时间、具体的组合物和同时使用的药物等多种因子和在医药领域中熟知的相似因子不同，使用方法也有所不同。
以下，通过制造例和实验例详细说明本发明。下列实施例和实验例只是预示本发明，并不是把本发明的范围限于说明。
实施例
[实施例]实验准备及实验方法
1.实验材料及准备
在本发明实验中使用的细胞系，包括hek293(表达腺病毒e1域的人胚胎肾脏细胞系)、a549(人肺癌细胞株)、afp-阳性hcc(hep3b)、afp-阴性hcc(hep1)，如没有其他说明，可视为从atcc(usa)购买并使用。细胞由含有10％牛胎血清(fbs：gibcobrl)，青霉素(100iu/ml)，及庆大霉素(20μg/ml)的dulbecco’s变化eagle’s培养基(gibcobrl，gaithersburg，md)进行培养。所有的细胞系在37℃、5％co2、加湿的培养箱中保管。从健康成人男性捐赠者的骨髓中分离的人msc从pharmicellco.,ltd.(seongnam，korea)提供。对冷冻保管(cryopreserved)的msc解冻，并用于研究。干细胞培养与含有10％牛胎血清(fbs：gibcobrl)，青霉素(100iu/ml)，及庆大霉素(20μg/ml)的lowglucosedulbecco’s变化eagle’s培养基(gibcobrl，gaithersburg，md)进行培养。所有的细胞系在37℃、5％co2、加湿的培养箱中保管。
对本发明中肝癌特异性，并表达wnti的腺病毒，作为它的标记可交换性使用ha2bm-d19-k35/slp6、ha2bm-d19-k35/wnti或hcd-oad-wnti。
2.统计分析
数据显示为平均±标准偏差(sd)。统计学显著性是由双侧studentt-test或one-wayanova检验(spss13.0软件，spss，chicago，il)决定。低于0.05的p值被认为是统计显著。
[实施例1]肝癌杀死靶向性腺病毒的制作
实验例1-1.重组afp启动子的增强子(enhancer)和沉默子(silencer)区域的肝癌特异性启动子的构建
为了开发肝癌特异性腺病毒，对肝癌患者中表达较高的afp蛋白质的启动子部位进行重组，比较各个启动子活性。
具体而言，5.1kb的被插入afp启动子的phafp5.1，包括增强子a(enhancera，365bp，序列编号3)、增强子b(enhancerb，193bp，序列编号4)、远端沉默子(distalsilencer,90bp)、近端沉默子(proximalsilencer,156bp)、afp小启动子(afpminimalpromoter，300bp，序列编号5)，各部位通过pcr扩增获得dna片段，这些组件依次插入到作为标志基因插入荧光素酶(luciferase)的pgl3-basicvector载体中，并制作修饰afp启动子(图1)。
实验例1-2.比较重组afp启动子的增强子和沉默子区域的肝癌特异性启动子的活性
为了测试实施例1-1中制备的afp启动子的组织特异性荧光素酶的活性，dna转染(transfection)至hcc细胞系中具有afp高表达的huh7、具有中等表达水平的hep3b和hepg2、并且不表达afp的hep1、来自肝癌以外组织的癌细胞脑癌细胞系u343、肺癌细胞系a549、人体正常细胞系bj、wi38、cbhel、imr90等细胞中，并在48小时后溶解(lysis)细胞后，分析荧光素酶活性(luciferaseactivityassay)测定(图2)。
如图2所示，在表达afp的hcc细胞系huh7，hep3b和hepg2细胞系中，萤光素酶活性很高，在不表达afp的hep1、其他组织癌细胞及正常细胞中几乎都没有观察到萤光素酶活性。在实验中使用的启动子中，2个复制(copy)的增强子a和1个复制的增强子b与小型启动子(minimalpromoteer)相结合的a2bm连接的荧光素酶活性为最高，可确认上述质粒载肝癌中表现出的组织特异性。
实验例1-3.受修饰afp启动子调控基因表达的腺病毒穿梭载体的构建
上述实验例1-2的调节荧光素酶表达的多种重组启动子中，利用选择了基因传递效率最好的a2bm和a2bsm，选择表现出最佳基因转移效率的启动子。阴性对照组为afpm，并适应不能复制的腺病毒基因来构建病毒。
不能复制的腺病毒通过使用hindiii和ecori限制酶，将gfp基因插入腺病毒的e1穿梭载体p△e1sp1a中，并制备p△e1sp1a/gfp穿梭载体。通过xhoi和bglii切割在制备载体中分别构建插入afpm启动子的p△e1sp1a/afpm/gfp载体、插入a2bm启动子的p△e1sp1a/a2bm/gfp载体、插入a2bsm启动子的p△e1sp1a/a2bsm/gfp载体。另外，为了在低氧状态下也能防止病毒的活性受到抑制，在上部mlui区域的vegf的hre结构域插入6个重复(copy)afp启动子，并制备了p△e1sp1a/ha2bm/gfp和p△e1sp1a/ha2bsm/gfp穿梭载体(图3)。
实验例1-4.构建由受修饰afp启动子控制基因表达的的腺病毒
在实验例1-3制备的5中e1穿梭载体，通过xmni限制酶切断变为线性化，通过bstbi限制酶切断腺病毒总载体de1为线性化，把穿梭载体和总载体在bj5183大肠杆菌进行同源重组，最终制备afpm-de1/gfp、a2bm-de1/gfp、a2bsm-de1/gfp、ha2bm-de1/gfp
接下来，把上述1-3中制备的5种质粒dna，使用paci限制酶切割并线性化，利用生产腺病毒的细胞系hek293和脂质体(libofectamine)，生产转基因病毒。制备的腺病毒再次感染hek293细胞系，利用cscl梯度法(csclgradient)浓缩并分离后，通过有限稀释测定(limitingdilutionassay)和病毒基因(viralgenome)的吸光度进行用光密度(opticaldensity,od)测量腺病毒效价。
实验例1-5.通过修饰的afp启动子确认对肝癌特异性基因的表达调控
为确认上述实验例1-1中制备的重组包含afp启动子(afpm,a2bm,a2bsm,ha2bm,ha2bsm)和表达调控肝癌特异性基因腺病毒的gfp基因表达，在afp表达水平不同的肝癌细胞系(huh7,hepg2,hep3b及hep1)、其他组织癌细胞系(a549)、人体正常细胞系(hacat)中感染不可复制的腺病毒(afpm-de1/gfp,a2bm-de1/gfp,a2bsm-de1/gfp,ha2bm-de1/gfp及ha2bsm-de1/gfp)后，利用facs检测gfp表达细胞群(population)。另外，为检查低氧状态下的启动子活性的实验组，被各个腺病毒感染后在低氧(0.1％)条件培养后，重新在正常浓度培养的步骤分别进行了2循环(cycle)。结果显示在图6a，6b，6c，6d，6e和6f中。
如图6a,6b,6c,6d和6f显示，afp表达肝癌细胞系(huh7,hepg2及hep3b)中ha2bm-de1/gfp的gfp表达量最高，其次为ha2bsm-de1/gfp。另外，确认了ha2bm-de1/gfp及ha2bsm-de1/gfp，不仅在afp阳性肝癌细胞系，afp不表达肝癌细胞系(hep1)和肺癌细胞系(a549)中，都表现出低氧(hypoxia)环境比正常氧气(normoxia)表达量增加。相反的，所有载体在正常细胞(hacat,图6e)中gfp表达量都很低。因此，证实了根据本发明制备的启动子是癌特异性启动子，并且ha2bm-de1/gfp是五种候选病毒中最好的癌特异性基因表达病毒，并进行了以下实验。
实验例1-6.确认受修饰afp启动子肝癌特异性基因在肝癌组织的表达
为了确认在上述实验例1-4中制备的腺病毒，是否可以在癌症组织内，通过afp启动子调节肝癌特异性基因表达，使用肝癌细胞系hep3b形成肿瘤后，把a2bm-de1/gfp或ha2bm-de1/gfp注射肿瘤内，并观察gfp荧光表达。
为了确认肝癌特异性基因的表达是否受修饰的afp启动子在肝癌组织中的调控，在6周龄裸鼠的皮下注射1x107个hep3b细胞，当形成肿瘤并且肿瘤的大小为200mm3时，以两天间隔在肿瘤内共注射3次5x109vp的a2bm-de1/gfp或ha2bm-de1/gfp。3天后取出肿瘤病制作蜡块，把样本以3μm厚度切片后，在二甲苯(xylene)、100％、95％、80％、70％乙醇溶液依次亲润来进行去蜡(deparafinization)。将其浸泡在0.5％np40溶液中，以增加组织的通透性。然后使用抗吡莫唑唑(anti-pimonidazole)抗体(hp1-100，chemicon，temecula，ca，美国)在4℃反应过夜(overnight)，把缺氧区域被染成红色。第二天，带有alexa568(alexa568)的二抗在常温下杂交(hybridization)2小时，并与anti-gfp抗体(mab3580,chemicon,temecula,ca,usa)在4℃反应过夜反应，gfp蛋白质染成绿色(green)。第二天，结合alexa448(alexa488)的二抗在室温下反应2小时，并用dapi染色(细胞核被蓝色(blue)染色)后，使用荧光的固定(mounting)溶液固定切用共聚焦激光显微镜(confocalmicroscopy)观察。
如图7显示，hre启动子的腺病毒(ha2bm-de1/gfp)在肿瘤细胞中的基因表达高于不具有hre的启动子，并确认hre插入后不仅在肿瘤的正常氧区域，甚至在缺氧区域也得以维持gfp表达。
实验例1-7.构建受修饰的afp启动子调控复制的肝癌特异性细胞杀伤腺病毒
基于先前使用复制缺陷型腺病毒进行的研究的结果，选择了各种类型启动子中最有效和特异性高的a2bm和ha2bm启动子，构建肝细胞特异性杀伤腺病毒。
为了构建肝癌特异性腺病毒(hcc-targetingoadvector),在p△e1sp1a/a2bafpm和p△e1sp1a/ha2bafpm载体中使用xhoi和bglii切断后，分别使用a2bm和ha2bm启动子，在移除e1b19dka并插入优秀的细胞杀伤性腺病毒来制备p△e1sp1a/a2bafpm/d19和p△e1sp1a/ha2bafpm/d19穿梭载体(图8)。
接下来，上述两种穿梭载体和对照组p△e1sp1a/d19穿梭载体，经xmni限制酶切断为线性，腺病毒总载体被betbi限制酶切断后变为线性后，在bj5183大肠杆菌转化并e1同源重组，最终制备对照组病毒和2种肝癌特异性杀伤腺病毒的d19,a2bm-d19和ha2bm-d19(图9)。
将制备的质粒dna用paci限制酶切割线性化后，利用脂质体在hek293中转染，并生产腺病毒。制备的腺病毒再次感染hek293细胞系，利用cscl梯度法(csclgradient)浓缩并分离后，通过有限稀释测定(limitingdilutionassay)和病毒基因(viralgenome)的吸光度进行用光密度(opticaldensity,od)测量腺病毒效价。
实验例1-8.确认受修饰的afp启动子调控复制的肝癌特异性细胞杀伤腺病毒的细胞杀伤能力
为了比较在上述实验例1-7中制备的腺病毒导致的肝癌特异性细胞杀伤能力，分别使用d19，a2bm-d19，或者ha2bm-d19的腺病毒感染多种细胞系(huh7，hep3b，hep1，imr90和mrc5)中，通过mmt进行分析。
如图10a、10b、10c、10d及10e所示，确认d19腺病毒的细胞在癌细胞(huh7，hep3b，hep1)和正常细胞(imr90，mrc5)中的杀伤能力很高。然而，当感染a2bm-d19腺病毒时，它仅在afp表达量高的细胞系中显示出杀伤能力，特别是，正常细胞imr90和mrc5的细胞活力几乎与未处理的细胞组相似或更高。另外，当另外插入了hre的h2bm-d19腺病毒感染时，在缺氧条件下表达afp细胞的细胞杀伤能力显着提高。特别是，在hep3b细胞系中显示出与具有强细胞杀伤能力的d19腺病毒相似的细胞杀伤能力水平。然而，在如imr90和mrc5等正常细胞系中，细胞存活力与未用病毒处理的实验组无差异，因此证实了携带本发明修饰afp启动子的腺病毒具有针对肝癌细胞的特异性杀伤能力。在不表达afp的hep1细胞系中，感染ha2bm-d19腺病毒后，在缺氧条件下细胞杀伤能力提高了约60％，因此在具有高异质性(heterogeneity)的肝癌组织中表达afp以及不表达afp的癌细胞中也能移除癌细胞，所以可期望它具有更好的癌细胞杀伤作用。
实验例1-9.确认受修饰的afp启动子调控复制的肝癌特异性细胞杀伤腺病毒的病毒复制能力
为了确认本发明腺病毒在缺氧条件下，具有明显增强细胞杀伤能力的现象是否与病毒复制能力的增加有关，分别用a2bm-d19或ha2bm-d19腺病毒感染了hep3b肝癌细胞系和a549肺癌细胞系之后，收集细胞培液和活细胞，并再次感染hek293细胞系以进行有限稀释测定。
如图11所示，在肺癌细胞系中a2bm-d19和ha2bm-d19腺病毒的复制能力没有差异，在感染了ha2bm-d19腺病毒的hep3b细胞系中，即使在低氧条件下，病毒复制能力不但没有受阻，相反的与正常氧气条件相比a2m-d19病毒复制能力增加40倍以上。
实验例1-10.球状体(spheroid)组织内的干癌特异性细胞杀伤腺病毒的复制能力验证
为缺氧区在体外自然形成于癌组织内部,通过将肝癌细胞系hep3b注入裸鼠来形成的肿瘤，以提取后进行球状培养(spheroidculture)。球状培养(spheroidculture)时，分别感染a2bm-d19或ha2bm-d19后，对球状(spheroid)部分(section)进行腺病毒复制相关的e1a蛋白质抗体的组织免疫染色。
如图12所示，在感染了a2bm-d19的组织中，仅在被认为是病毒容易接近的正常的氧气区域的球状体边缘(margin)观察到了e1a，在感染了ha2bm-d19的组织中，不仅在球状体边缘还观察到e1a蛋白，而且在预期会形成自然低氧条件的组织中也观察到e1a蛋白。这表明本发明的癌症特异性杀伤性腺病毒ha2bm-d19在低氧条件下以及在体外均不受复制能力抑制。
实验例1-11.体内肝癌特异性细胞杀伤性腺病毒的复制能力及细胞杀伤能力验证
基于体外实验的结果，为了验证体内肝癌特异性腺病毒的细胞杀伤能力和复制能力，将pbs、腺病毒a2bm-d19或腺病毒ha2bm-d19分别注射至裸鼠下注射hep3b细胞系而形成的肿瘤中。使用此方法，检查了与腺病毒在肿瘤组织中复制有关的e1a蛋白的表达，并通过tunel测定法比较了细胞凋亡程度。
如图13所示，使用针对腺病毒的e1a蛋白抗体的免疫染色方法结果，处理插入hre的ha2bm-d19实验组，与用a2bm-d19处理的实验组相比，e1a蛋白的表达显着增加,ha2bm-d19组的肿瘤组织能够观察到e1a在各种组织中均匀分布。在tunel实验结果中，与e1a同样，可以观察到在用载入hre的ha2bm-d19处理实验组中进行tunel染色时，阳性死亡细胞均匀地分布在肿瘤组织中。由此可以确认，即使在肿瘤组织中的低氧条件下，与没有hre的a2bm-d19相比，含有hre的ha2bm-d19在不抑制病毒复制能力的情况下也显示出优异的细胞杀伤作用。
实验例1-12.在体内肝特异性可自行复制腺病毒的抗肿瘤效果通过同种异体移植模型验证
通过从orient(orientinc.,korea)购买的6周龄的雄性裸鼠(balb/c-nu)来进行动物实验。
动物饲养室的温度保持在22±2℃，湿度保持在55至60％，灯光以12小时为单位进行调节，并让动物自由摄入经过辐照灭菌的固体饲料灭菌(中央实验室动物，seoul,korea)和水。
为建立与实际致瘤模型接近的同种异体移植模型，通过切开一只6周龄的雄性裸鼠腹部皮肤切开，将悬浮于20μlhbss的1x106的稳定表达荧光素酶(luciferase)的hep3b细胞与基质胶(matrigel，bdbioscience，sanjose，ca，usa)混合，将混合物直接注入左肝叶并缝合。细胞注射2周后，从小鼠收集血液中分离血清，并使用afpelisa试剂盒(r&dsystems,minneapolis,mn,usa)测量血液中的afp表达量，将afp表达水平为700ng/ml以上的小鼠分为三组用于实验。pbs或两种类型腺病毒(a2bm-d19，ha2bm-d19)，以每两天2.5x1010vp尾静脉住着，并每隔一周间隔腹腔注射200mg/kg荧光素酶(luciferin,promega,madison,wi,usa)，然后使用ivis100(xenogen,alameda,ca,usa)进行光学成像。通过成像(imaging)获得的信号使用igor-prolivingimage软件(xenogen,alameda,ca,usa)进行定量分析。注射病毒5周后，收集血液并使用elisa分离血清，以测量血液中的afp表达量，提取肝癌组织，称重，并制成石蜡块。分别静脉注射pbs，a2bm-d19或ha2bm-d19后，每周通过光学成像确认抗肿瘤作用。
如图14及15所示，腺病毒注射5周后，三组的抗肿瘤作用表现出最显着的差异。在注射a2bm-d19病毒的组中，确认了在六只动物全部肿瘤的大小持续显着增加。另一方面，在给予ha2bm-d19的组被证实，大多数小鼠的肿瘤生长速度减慢，最终证实了当病毒注射5周后，给予ha2bm-d19的组的肿瘤尺寸小于a2bm-d19的组。如使用总(total)通量(flux)值量化肿瘤大小的变化时，5周后注射ha2bm-d19病毒组比注射a2bm-d19的组小5倍。这意味着具有大约82％的肿瘤生长抑制作用，ha2bm-d19给药具有优秀的抗肿瘤作用。此外，在将肝癌特异性杀伤腺病毒的抗肿瘤效果与血清中afp(在给药病毒后5周)表达量相比较时，如总通量(totalflux)数值一样，注射ha2bm-d19比a2bm-d19组低5倍。
[实施例2]制备载有肝癌靶向杀伤性腺病毒干细胞
实验例2-1.优化腺病毒导入msc的效率
为确认针对间充质干细胞(msc，pamicellcorporation)的腺病毒转染效率(trasductionefficiency)，使用表达lacz基因的不同纤突(fiber)的三种类型病毒de1/lacz、del-k35/lacz、del-rgd/lacz，每种病毒以0-200moi感染间充质干细胞(msc，pamicellco.，ltd.)，两天后，通过x-gal染色确认lacz表达。
根据以下方法制备各个修饰纤突腺病毒。
通过插入了序列编号1的35型腺病毒(血清型35)的腺病毒穿梭载体psk5543-k35，与gfp基因插入e1位点并无复制能力的de1/gfp同源重组，构建de1-35/gfp病毒(图16a)。此外，在腺病毒纤突末端插入rgd的腺病毒穿梭载体psk5543-rgd，与gfp基因插入e1位点并无复制能力的de1/gfp同源重组，构建de1-rgd/gfp病毒(图16a)。将制备的腺病毒转染到hek293细胞系中，以增殖产生大量腺病毒。
如图16c所示，当msc感染del-k35/lacz病毒时，显示出最高的基因传递效率。
另外，为了优化ad转染msc的效率，利用不同纤突表达-gfp-ad5的来确认转染效率。de1/gfp(拥有野生波段的ad5载体)、del-k35/gfp(ad血清型35纤维蛋白突触(knob)的嵌合ad5)、del-rgd/gfp(在ad纤突hi顶部包含rgd波段在的ad5载体)、de1-k3s/gfp(包含ad5切断纤突轴(shaft)及ad3纤维蛋白突触的嵌合ad5)、de1-vsvg(12l)/gfp、de1-vsvg(12c)/gfp、de1-vsvg(12r)/gfp。基因转染前24小时内，将msn以，5×10104cells/well的密度接种于24-well。将上述msc细胞分别以0,5,20或100moi的ad处理，进行37℃、48小时培养。gfp表达通过荧光显微镜(olympusix81；olympusoptical,tokyo,japan)确认。
如图17所示，de1/gfp和de1-rgfp在所有moi(multletiplicitiesofinfection)中，转染msc的效率非常低。de1-k3s/gfp的gfp表达水平，根据浓度提升而增加，但是效率依然很低。但是，转染de1-k35/gfp时，对msc的转染效率很高。这与lacz结果一致。特别是序列编号1，包含ad血清型35纤维蛋白突触的腺苷病毒，在5moi也很容易感染间充质干细胞，作为载入间充质干细胞上的腺病毒，已确认其显著效果。最终，利用序列编号1，包含纤突的病毒载体进行了实验。
2-2.验证在msc中用腺病毒对msc的杀伤能力和病毒复制能力
将肿瘤杀伤性腺病毒(h5cmt-rd19-k35/luc)以0.02、0.05、0.1、0.2,0.5或1moi的效价感染msc，并通过mtt实验(assay)确认。另外，为了确认msc中生成的病毒量，通过q-pcr确认了病毒增殖能力。
制备h5cmt-rd19方法如下。
包括6个hre增强子(序列号6)，为了制作由5mtert启动子控制e1a基因表达的腺病毒，首先将腺病毒全部基因作为模板，使用pcr(polymerasechainreaction)扩增rb7△19/e1b55位，获得靶基因。
使用的上游引物为(senseprimer)5'-gcggaattcactcttgagtgccagcgagta-3'，下游引物为(antisenseprimer)5'-cgcggatccacatttcagtacctcaatctg-3'，为了便于克隆，加了ecori和bamhi限制酶部位。将生成的pcr产品用ecori和bamhi切断后插入到pbluescriptⅱsk(+)载体，本研究室所制造包含5mtert启动子的载体，用clai和ecori切断后插入。最后，用xhoi和sali切断了之前制作的pbluescriptⅱ(sk)/5mmtert/rb7△19载体后，添加6个hre序列。从这样制作的pbluescripssk(+)/hre65mtert/rb7△载体中的e1增强子和启动子，插入到p△e1sp1b穿梭载体，用xhoi和bamhi切断并插入。用上述方法制作的e1穿梭载体，用xmni限制酵素切割后，通过bstb限制酵素处理成为单一分支的腺病毒dl324bstb和大肠杆菌b5183同时转变后，诱导基因的同源重组(homologousrecombination)。从bj5183获得的重组质粒dna，重新在dh5α大肠菌转化并扩增dna。从大肠杆菌dh5α中获取同源重组质粒dna，并处理hindiii限制酵，筛选出各个重组腺病毒基因。将上述h5cmt-rd19为模板，替换病毒knob部分k35(序列编号1)的序列，并插入luc基因进行可视化。
如图18所示，确认全癌症特异性杀伤腺病毒的感染时间，并确认是否因浓度增加而提高细胞杀伤性和病毒增殖能力。根据上述结果，利用msc作为细胞传递时，具有细胞杀伤能力的病毒增殖能力增加，而诱导更好地癌细胞杀伤，并与其他传递体比较，具有更优秀的抗癌效果。另外，人体内注入一定时间后，通过腺病毒清除msc，因此msc作为制剂及使用时，也可消除对人体内msc的残存的担忧。在本发明的msc内载入腺病毒的细胞治疗剂，可以增加病毒的产量来达到抗癌作用的最大化，并且最小化msc副作用。
实验例2-3.人肝癌原位(orthotopic)模型构建
为建立与实际致瘤模型接近的同种异体移植模型，通过切开一只6周龄的雄性裸鼠腹部皮肤切开，将悬浮于20μlhbss的1x106的稳定表达荧光素酶(luciferase)的hep3b细胞与基质胶(matrigel，bdbioscience，sanjose，ca，usa)混合，将混合物直接注入左肝叶(图19)。细胞注射2周后，从小鼠收集血液中分离血清，并使用afpelisa试剂盒(r&dsystems,minneapolis,mn,usa)测量血液中的afp表达量，将afp表达水平为300ng/ml以上的小鼠分为三组用于实验。另外，通过发光成像(luminescenceimaging)，非侵入性方法来实时观察荧光注射到裸鼠内的肝癌细胞在体内的肿瘤生成及变化(图20)。
实验例2-4.载有肿瘤杀死腺病毒的干细胞对基因治疗的癌症靶向性。
为确认在肝癌异体移植模型中，ad-mc的肿瘤特异性定位作用(localization)和肝癌选择性腺病毒的复制，首先用h5cmt-rd19-k35/luc以0.2moi、0.5moi和1moi分别感染分别感染msc。24小时后将各个间充质干细胞，以1x106cells尾静脉注射到异体移植模型(裸鼠)。
另外，pbs作为对照组尾静脉注射到异体移植模型。注射2小时到28日，通过荧光成像(luminescenceimaging)实时观察病毒的移动和复制功能。
如图21所示，利用全癌症特异性肿瘤杀伤病毒，注射以0.5moi和1moi浓度感染的ad-msc的治疗组中，成功地移动到肿瘤部位，注射后的第28天，依然可以确认病毒的存在和治疗效果。这表明，本发明的肿瘤杀伤性病毒的病毒复制能力高，能在肿瘤中长期维持着病毒的治疗效果。
实验例2-5.制作与生产载入干细胞的癌靶向性腺病毒
通过对实施例1的肝癌特异性启动子活性比较试验，选择了小且活性优秀的a2bm启动子，并最终选择了即使在低氧条件下也能复制，插入hre的肝癌特异性启动子的ha2bm。另外，根据实验例2-1的结果，选择了对mcs基因传递效率优秀的序列编号1纤突，并为了确认基因传递效率插入记录基因luc后，最终选择ha2bm-d19-k35/luc为候选。为制作病毒，首先使用xmni使△e1sp1a/ha2bm/d19穿梭载体线性化，并使用bstbi使de1-k35总载体线性化，最终在bj5183大肠杆菌(e-coli)转化进行e1同源重组来制作ha2bm-d19-k35(图22)。
接下来，将表达萤火虫的荧光素酶试剂盒与ade3穿梭载体(psp72e3)连接，并制备了psp72△e3/lucade3穿梭载体。为制备表达wnti的hcc靶向性oad载体，从pca14-slrp6e1e2[60]亚克隆wnti编码序列，并连接到psp72△e3来制备psp72△e3/wnti_ade3穿梭载体。利用xmni使ade3穿梭载体(psp72△e3/luc和psp72△e3/wnti)线性化，利用spei使hcc-oad(ha2bm-d19-k35)[48]线性化，并在大肠杆菌bj5183通知进行转化，通过同源重组制备了包含ha2bm-d19-k35/luc(hcc-oad-luc)或ha2bm-d19-k35/wnti(hcc-oad-wnti)的质粒(图23a)。同源重组ad质粒利用paci切断，利用脂质体(lipofectamine)在hek293细胞进行转染，并制备hcc-靶向性hcc-oad-luc及hcc-oad-wnti(图23b)。在hek293细胞生成病毒颗粒后，将hcc-oad-luc及hcc-oad-wnti在a549细胞增殖，并用cscl梯度离心纯化。当260nm(od260)吸光度为1(od260＝1)时vp值计算为1.1x1012vp/ml，病毒纯化后保存于-80℃。
实验例2-6.在msc比较肝癌靶向性腺病毒对干细胞转染效率
在msc确认肿瘤靶向杀伤性腺病毒对msc引进效率，在实验例2-1制备的表达gfp的腺病毒载体，以500moi感染间充质干细胞，并在24小时后确认gfp表达程度。
另外，利用表达luc基因的肝癌靶向杀伤性腺病毒ha2bm-d19-k35/luc(hcc-oad-luc)，对msc分别以0,50,100,或200moi感染2天(感染48小时后)，利用ivis成像系统(xenogencorp,alameda,ca)确认了荧光素酶信号。生物发光(bioluminescence)信号强度由检测领域的每秒获得光子(photon)(p/s)来获得。
如图24所示，感染de1-k35/gfp病毒时，对msc顺利导入基因，以50、100及200moi对msc转化时，腺病毒依赖于浓度而增加luc表达量(p<0.001)。此结果表明，本发明ad有效的转染至msc并表达转入基因。
实验例2-7.启动治疗基因的干细胞载体用肝癌特异性腺病毒的制备以及生产
通过比较肝癌特异性启动子活性实验，选择了短而启动子活性优秀的a2bm，最终选择的肝癌特异性腺病毒为插入了hre的ha2bm启动子，其可在低氧(hypoxia)条件下也能复制病毒。为增加肿瘤细胞杀伤能力，且制备表达slrp6基因来阻断beta-catenin/wnt信号传递的腺病毒，利用spei使ha2bm-d19-k35总载体线性化，并利用xmni使psp72de3/slrp6穿梭载体线性化，把穿梭载体和总载体在bj5183大肠杆菌进行e3同源重组，最终制备ha2bm-d19-k35/slrp6质粒(参考图25及图26)。
将制作的质粒dna，利用paci限酵素切割线性化后，使用脂质体(lipofectamine)于腺病毒生产细胞系hek293来生产转化病毒。产生的腺病毒重新感染hek293细胞系，并利用cscl梯度离心浓缩纯化后，通过极限稀释试验(limitingdilutionassay)和病毒基因(viralgenome)吸光度的光学密度(opticaldensity,o.d)来检测腺病毒效价。
实验例2-8.比较肝癌靶向性腺病毒对肝癌细胞和正常细胞的杀伤性
为确认肝癌特异性杀伤腺病毒ha2bm-d19-k35/slrp6的肝癌细胞特异性杀伤能力，以0.1,0.5,2,10及50moi，分别感染肝癌细胞系hep3b、huh7、hep1和正常细胞hdf，感染72小时后利用mmt分析(assay)确认细胞杀伤能力。
如图27所示，在肝癌细胞系hep3b、huh7、hep1，根据肝癌细特异性细胞杀伤腺病毒浓度上升而增加杀伤能力。另外，在正常细胞hdf没有发现杀伤效果。这意味着ha2bm-d19-k35/slrp6对正常细胞没有杀伤效果，且只对癌细胞产生优秀的靶向性。另外，ha2bm-d19-k35/slrp6不仅在afp阳性(hep3b,huh7)肝癌细胞，且在afp阴性(hep1)肝癌细胞也有着优秀的癌细胞杀伤能力，这意味着ha2bm-d19-k35/slrp6对多种表现型临床肝癌患者适用时，将有着优秀治疗效果。
实验例2-9.优化oad对msc的导入量(dose)
在通过全身循环达到目标组织之前，为了防止细胞提前溶解，将oad导入传递体msc时，优化导入量(loadingdose)非常重要。因此，评价了oad对msc的最佳导入量。
为确认msc中的肝癌靶向杀伤性病毒的细胞杀伤能力，将肝癌特异性腺病毒ha2bm-d19-k35/slrp6，以0.5,1、2、5、10、20及50moi感染msc，并2、5天后进行mtt分析，比较了间充质干细胞的生存率。
如图28所示，msc的生存率在所有导入量，感染5天时明显比感染两天时现住降低(p>0.001)。随着病毒浓度和时间增加，细胞杀伤能力也会增加。这意味着病毒引起的细胞杀伤效果，在体内不仅可以消除肿瘤细胞还能消除msc，如使用msc作为细胞治疗剂时，可消除体内残留msc的担忧。因此，在本发明载入腺病毒的ms作为治疗剂，移动到癌症组织时，病毒含量在msc内增殖，从而最大化了抗癌作用，且到达癌组织后消除msc，消除msc残留而引起的副作用，可提示本细胞治疗剂的安全性。
接下来，为了进一步优化载入oad-的msc，检测了msc中病毒增殖水平。
实验例2-10.确认msc中腺病毒生产量
为确认msc中产生肝癌特异性杀伤腺病毒产量，将肝癌特异性杀伤腺病毒ha2bm-d19-k35/slrp6以0.5、1、2、5、10、20、50及100moi感染msc，并感染后2、5天后使用qpcr比较病毒产量。
如图29所示，以0.5到5moi感染2天后，腺病毒的量增加10倍(fold)增加，最终导致5000倍(fold)更高的产量。但5到50moi的结果，只导致1.8倍(fold)产量增加。moi高于5moi时，病毒生产水平的增加稳定，在相同病毒含量范围，观察到msc存活率显着依赖于含量，所以oad导入msc时，为平衡病毒增值和msc生存率，最终决定5moi及感染2天。
实验例2-11.验证导入肝癌细胞靶向杀伤腺病毒的干细胞(hcc-oad-wnti/msc)抗肿瘤作用
2-11-1.确认表达wnti的hcc靶向性oad特征
使用增强子位点修饰的afp启动子(ha2bm)来制备表达wnti的hcc特异性oad，即hcc-oad-wnti(图38a)。
为评价本发明中制备的hcc-oad-wnti是否可以抑制wnt信号通路，在感染了hcc-oad或hcc-oad-wnti的hep3b细胞中，通过西部印记(westernblot)检查了与wnt和wnt信号转导途径相关的各种下游信号的表达程度。
如图38b所示，处理hcc-oad-wnti后，感染的hep3b细胞wnt表达水平明显低于对照oad(hcc-oad)或阴性对照(未处理组)感染的细胞。此外，hcc-oad-wnti处理显着降低了各种下游信号，如诱导癌细胞快速增值及emt的β-catenin及p-mek(phospho-mapk/erk)。另外，间充质标志e-cadherin(epithelialcadherin)的表达水平，在感染hcc-oad-wnti的hep3b细胞中比未处理的细胞或hcc-oad感染的细胞的表达水平显着提高。这意味着hcc细胞wnt信号通路可有效被hcc-oad-wnti抑制，并最终防止emt。
为评估靶向hcc-oad的wnti表达是否增强oad在hcc细胞中的癌细胞杀伤作用，用临床认证使用的oad(h101)，同源对照hcc-oad或hcc-oad-wnti，在各种moi感染afp阳性hcc细胞。
如图38c所示，与h101或对照hcc-oad相比，hcc-oad-wnti在afp阳性hep3b细胞的所有moi中剂量依赖性更好的诱导了癌细胞杀伤作用(p<0.001)。这意味着wnti表达可以改善肝细胞癌(hcc)特异性oad对癌细胞的杀伤作用。对afp阳性hcc细胞(hep3b)，在10moi时，hcc-oad-wnti的细胞毒性比h101或对照hcc-oad高5.46倍或2.29倍。
ha2bm启动子在低氧条件下，可克服ad复制的低氧介导媒介的抑制，我们评估了在低氧条件下hcc-oad-wnti是否能在ha2bm启动子控制下，有更好的癌细胞杀伤作用。如图38d所示，hcc-oad-wnti在低氧和正常氧气环境中比hcc-oad，有着更好的癌细胞杀伤作用。此外，在低氧条件下，hcc-oad-wnti的癌细胞杀伤功效比正常氧气高1.2倍(p<0.001)。这些结果表明，hcc-oad-wnti可以在afp阳性肝细胞癌中引起强大的细胞杀伤作用，并克服病毒复制能力在低氧条件下调。
2-11-2.hcc-oad-wnti/msc的强大肝癌(hepatoma)治疗作用
为了评估hcc-oad-wnti/msc对hcc的肿瘤杀伤能力，将hep3b细胞和hcc-oad-wnti/msc(用5moi病毒感染2天msc)，以1：1的细胞比例共培养。
如图39所示，从治疗的第1天到第5天，在正常氧气和低氧条件下，未治疗组和msc给药组之间的hep3b存活率没有显着差异，这表明msc不影响癌细胞的生长。相比之下，无论正常和低氧条件下，hcc-oad-wnti和hcc-oad-wnti/msc治疗组，在治疗后第3天和第5天均显着降低了hep3b存活率，
并证实了nakedmschcc-oad-wnti和载入msc的ad均具有afp阳性hcc细胞杀伤能力。另外，用hcc-oad-wnti处理或用hcc-oad-wnti/msc处理的所有hep3b细胞，在治疗第一天都显示出与未处理组相似的生存力。此后，由oad处理过的组中所表现的癌细胞生存率降低是，由增殖媒介细胞变性作用引起的。
另外，在ha2bm启动子治疗的第3天和第5天，在低氧条件下，hcc-oad-wnti和hcc-oad-wnti/msc显示出比正常氧气条件更高的癌细胞杀伤作用。作为参考，在肝细胞癌中，在正常或低氧条件下治疗的第3天或第5天，hcc-oad-wnti/msc的杀伤作用明显强于hcc-oad-wnti(p<0.05，p<0.01)。这些结果表明，在将病毒传递至hcc细胞时，msc中hcc-oad-wnti的病毒复制效率可以增强oad的细胞杀伤作用。
2-11-3.验证载入全身注射的肝癌靶向杀死性腺病毒的干细胞(hcc-oad-wnti/msc)的抗肿瘤作用
评估肝癌原位移植模型(orthotopichcctumormodel)中oad的msc(ad-msc)的治疗效果，将表达荧光素酶的原位hep3b肿瘤模型小鼠，通过尾静脉注射pbs，msc(1x106个细胞)，hcc-oad-wnti(5x108vps)或hcc-oad-wnti/msc(1x106msc用5x108vp感染18小时)。
具体而言，在肝癌细胞移植后的第8天和第12天，分别以5个moi肝癌特异性杀伤腺病毒hcc-oad-wnti(ha2bm-d19-k35/slrp6)感染msc，24小时后尾静脉注射1x106msc。作为对照组，向尾静脉注射pbs和相同量不被病毒感染的msc(1x106个细胞)或感染msc相同量的ad(5x108vp)。
如图30a及图31所示，在对照组(pbs)中，可以观察到肿瘤的快速生长，但是在使用ad-msc的组中肿瘤的生长被显着抑制。如图30a及图30b所示，移植后第35天，全身注射hcc-oad-wnti/msc的抗肿瘤活性明显高于单独使用hcc-oad-wnti或msc的组(p<0.01)，比pbs，msc或hcc-oad-wnti的治疗效果分别提高44.7倍，24.0倍或8.1倍以上。这也可以在原位肿瘤模型小鼠的活体外(ex-vivo)照片中得到证实，在pbs，msc或hcc-oad-wnti处理的肝脏中观察到较大的肿瘤，而在hcc-oad-wnti/msc处理的肝脏中观察到很小的hcc肿瘤(图32及33a)。即使通过测量肿瘤的重量，也观察到了类似的结果(图33b)。作为参考，hcc-oad-wnti/msc的剂量低于常规用于存在肿瘤的小鼠全身治疗时用oad剂量范围
实验例2-12.在体内观察载有肝癌靶向杀伤腺病毒的干细胞对肝数值的变化
为了确认ad-msc在肝癌同位异体移植模型中的肿瘤治疗作用对肝功能的影响，用5moi的癌症特异性杀伤腺病毒ha2bm-d19-k35/slrp6感染msc18小时，通过尾静脉将载有ad的间充质干细胞(1x106细胞)注射于肝癌同位异体移植模型(裸鼠)。分别以pbs，200μl相同量的msc(1×106个细胞)和nakedad(不感染msc的肿瘤杀伤腺病毒ha2bm-d19-k35/slrp6，5×108vp)作为对照，在9日和13日两次进行注射。第二次注射后三天，从四组小鼠中抽血，并检测丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)，并检测非肿瘤正常小鼠的血清水平，以检验其肝脏毒性。具体地，在收集0.5-1ml的小鼠血液之后，在室温下20-30分钟之后，以3000rpm进行30分钟离心。采集血清上清液委托于毒理学检测机构。
如图34所示，用hcc-oad-wnti处理的小鼠表现出最高的ast水平(比pbs处理组高1.6倍；p<0.05)。相反，对于正常小鼠，在用hcc-oad-wnti/msc治疗的小鼠中未观察到ast水平的显着增加。而是，可以确认ast水平维持在与正常小鼠相同的水平。这表明，msc介导oad的肿瘤特异性传递也可以预防由hcc肿瘤引起的肝损害，以及与传统给药的ad相关的肝损害。
实验例2-13.分析体内载有肝癌靶点杀伤腺病毒的干细胞全身注射时生物分布(biodistribution)
由于naked-oad在与kupffer细胞和凝血因子的相互作用下，静脉注射后被迅速并非特异性地隔离在肝脏中，导致肝脏毒性和抗肿瘤作用受限。因此，为了进一步研究hcc-oad-wnti/msc是否可以避免肝细胞隔离，同时增强oad在肿瘤中的积累，分析msc，hcc-oad-wnti或hcc-oad-wnti/msc，全身注射后的体内分布情况。
在同位异体移植模型中全身注射载有肿瘤特异性杀伤性腺病毒的msc后，其对生物分布(biodistribution)进行分析，构建hep3b-luc肝癌同位异体移植模型后，在肿瘤植入后第9天和第13天分别注射pbs，msc(1x106细胞)，ha2bm-d19-k35/slrp6(hcc-oad-wnti，5x108vp)或5x108vp的ha2bm-d19-k35/slrp6腺病毒感染18小时的msc(ad-msc，1×106个细胞)。每组第二次给药后的二十四小时，麻醉小鼠以抽血并安乐死(sacrifice)，提取肝癌组织，正常肝组织，胃，脾，肺，胰腺，心脏和肾脏，并提取dna。具体而言，使用液氮冷冻器官，然后使用研棒将其研磨。将20mg压碎的器官放入新管中，并使用裂解液裂解器官以获得dna。上述dna的浓度使用超小型分光光度计(nanodropspectrometer)测量，使用qiaampdnabloodminikit(qiagen)来提取100ngdna，并通过实时定量聚合酶链反应(real-timequantitativepolymerasechainreaction)测量每个样品中的病毒基因组数量。定量验证每个样品中病毒基因组的数量，以确定肌癌特异性杀伤腺病毒的分布。
如图35a所示，hcc-oad-wnti/msc比nakedhcc-oad-wnti显着降低被肝脏吸收的量(p＜0.001)。另外，hcc-oad-wnti/msc比nakedhcc-oad-wnti，肿瘤蓄积显示4,824.2倍(p<0.001)。这些结果表明，msc可以在全身循环期间有效地保护oad，并降低oad的肝向性(hepatictropism)，由于msc针对肿瘤的性质，从而有效地诱导病毒在肿瘤内蓄积。此外，这些数据表明，因msc介导的oad的肿瘤内定位，即使在低病毒剂量下，也可以通过在全身循环中msc和肿瘤组织中复制病毒来诱导有效的提高抗肿瘤作用。结果，hcc-oad-wnti/msc与肿瘤和肝脏的比例比nakedhcc-oad-wnti高6480.8倍，这表明基于msc的溶瘤性ad的传递可以克服全身注射时的障碍，以提高病毒的治疗效率和安全性，来提高其提高效果。
实验例2-14.观察载有腺病毒靶向杀伤腺病毒的干细胞对肝癌组织学变化
从组织学检测来证实ad-msc在肝癌同种异体移植模型中的肿瘤治疗效果。载有病毒的msc是，由肝癌特异性杀伤腺病毒ha2bm-d19-k35/slrp6(hcc-oad-wnti)以5moi感染msc24小时来制备配备。
将肝癌细胞移植到肝癌同位异体移植模型(裸鼠)后，在第9天和第13天，向肝癌同位异体移植模型(裸鼠)通过尾静脉1×106的msc(ad-msc组；hcc-oad-wnti/msc)。作为对照组，pbs(pbs处理组；pbs)和相同量的未感染病毒的msc(msc；1x106个细胞)，或相同量的未感染msc的ad(5x108vp)(ad处理组；hcc-oad-wnti)，通过尾静脉注射(n＝每组6只)。
最后一次给药后三天，从四组(pbs，msc，ad和ad-msc组)获得肝组织。肝组织用10％福尔马林固定，种植在石蜡中，并切成5μm的厚度。附着在载玻片后，将其依次浸入二甲苯(xylene)和100％、95％、80％、70％的乙醇溶液中以脱蜡(deparafinization)，并进行h&e染色(hematoxylinandeosinstain)，为检测胶原原纤维(collagenfibrils)进行了马森三色(masson'strichrome)染色。接下来，使用人msc的标志物cd90和能够确认细胞增殖程度的pcna(proliferatingcellnuclearantigen)抗体进行免疫组织化学染色(immunohistochemistrystaining)。通过用组织玻片依次浸入二甲苯(xylene)和100％、95％、80％、70％乙醇溶液中来进行脱蜡(deparafinization)，并用0.5％np40溶液来提高组织渗透性(permeability)，且与cd90抗体(abcam,ltd.,cambridge,uk)或pcna抗体(dako，glostrup，denmark)在4℃反应过夜(overnight)后，第二天利用abc-peroxidasekit(chemmatedakoenvisionkit；dako,carpinteria,ca)来进行二抗反应后，利用用苏木精(hematoxylin)染色并用固定液(mounting)固定并用组织显微镜观察。
如图36所示，在对照组(pbs)或msc或ad处理组中，可确认在肝组织中广泛分布的肿瘤，另外证实，作为细胞外基质的主要成分，并帮助肿瘤组织形成和生长的胶原纤维(染成蓝色)，广泛分布于癌组织和癌组织边界部位，但给予ad-msc(hcc-oad-wnti/msc)的组中，确认未检测出肿瘤组织和胶原纤维，并确认保持正常的肝组织形态。
此外，如图37所示，通过msc的标志物cd90染色确认msc的存在，处理msc治疗的小鼠的肝呈阳性，hcc-oad-wnti或hcc-oad-wnti/msc处理的肝组织中，cd90呈阴性。在仅注射msc的组中，msc在肝脏组织中停留很长时间，这表明完成基因转移的msc被装在其中的ad完全清除了，在可以排除由残留的msc引起副作用的意义上，可以说本发明载有ad的干细胞作为治疗剂具有优异的特性。
接下来，作为确认细胞增殖程度的结果，证实了在对照组(pbs)和msc或ad给药组中，发生癌细胞特有的细胞过度增殖,给予本发明ad-msc的组中未观察到肿瘤细胞。与pbs，msc或hcc-oad-wnti/msc处理相比，已证实hcc-oad-wnti/msc处理能显着降低细胞增殖水平，并有效抑制了hcc肿瘤的增殖，从而产生了强大的抗肿瘤作用。
实验例2-15.确认hcc-oad-wnti/msc的药代动力学(pharmacokinetic)改善
为了通过全身给药有效地治疗hcc肿瘤，必须延长oad的血液残留时间，以将oad传递至肿瘤组织。因此，在本发明评估了是否可以延长靶向hcc的载有oad的msc在血液中的残留时间。
为评估从小鼠血液中去除ad的速率，使用oad处理的小鼠的血液样品进行实时定量pcr(q-pcr)。全身注射5x108vp的nakedhcc-oad-wnti或等量的hcc-oad-wnti/msc后，在5、10、30、1小时、6小时、24小时、48小时，从小鼠的眼眶后丛(retro-orbitalplexus)收集100μl全血(n＝3)。使用qiaampdna血液微型试剂盒(qiagen，hilden，germany)，从全血等分试样(aliquot)中提取总dna。使用q-pcr(appliedbiosystems)测量ad基因组的数目。样品共分析了3次，并使用sds19.1软件包(appliedbiosystems)处理了实验结果。nakedhcc-oad-wnti(ad未加载到msc上)被血液迅速清除。相比之下，hcc-oad-wnti/msc在注射后1和24小时的血液水平分别比nakedhcc-oad-wnti高12倍和3200倍，这意味着msc在全身循环过程中有效保护了hcc-oad-wnti。
序列表
<110>基因药物株式会社
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