一种在鼻咽癌检测中应用的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及荧光定量方法检测fmr1基因启动子区域甲基化的试剂盒及其应用。
背景技术：
：鼻咽癌作为是华南地区高发肿瘤，它的治疗以放疗为主，但对于分期靠后尤其是ⅲ期以上，复发性肿瘤的治疗采用放化疗、手术等综合治疗的手段效果欠佳。所以早期诊断对于提高其临床治疗效果显得重要。eb病毒感染是诱发鼻咽癌的高危因素，但在临床实际工作中eb病毒相关检查的灵敏度、特异性较低，在鼻咽癌早诊方面发挥的作用有限，所以目前临床迫切需要鼻咽癌早期诊断的新方法。基因启动子区域cpg岛甲基化能使基因表达沉默，从而引起一系列细胞的分子水平事件。目前国际已经公认基因甲基化是肿瘤发生进展过程中的早期事件。因此通过检测基因的甲基化对于预测细胞的癌变已经开始应用在不同的肿瘤早期诊断上，例如通过外周血中游离dna的基因甲基化早诊大肠癌；通过分析肺泡灌洗液细胞中基因甲基化早诊肺癌，等等。技术实现要素：在本发明中提供一种在鼻咽癌检测中应用的试剂盒，所述试剂盒包括样品dna提取试剂、dna甲基化修饰转化试剂以及基于荧光定量pcr方法检测msf1基因和rassf1a基因甲基化的试剂，并且在msf1和rassf1a基因的甲基化pcr扩增引物序列上都含有cpg序列。在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用pcr方法检测内对照参考基因的试剂，所述内对照参考基因优选为actb基因；检测所述内参基因的试剂包括一对非甲基化位点扩增引物、一条检测非甲基化位点探针。在一种实施方式中，在msf1和rassf1a基因的甲基化pcr扩增的每个引物序列上都至少包括二个cpg序列，并且有一个cpg序列位于5’端；并且检测所述msf1和rassf1a基因的甲基化pcr扩增产物的每个探针上至少包括3个cpg序列，并且cpg不在探针的二端。在一种实施方式中，检测所述actb基因的试剂包括扩增actb基因引物和探针：上游引物序列seqidno:5：aaaaaggaggttggat；下游引物序列seqidno:6：ctcccrcaaaacaaccac；和检测探针序列seqidno:9：ccaccttaccctaaacactacaac。在一种实施方式中，基于荧光定量pcr方法检测msf1基因的试剂包括扩增msf1基因的引物序列和探针：上游引物序列seqidno:1：ttttcgtcgttgtttttcg；下游引物序列seqidno:2：ataatcccatccaactacg；和检测探针序列seqidno:7：ttaaccgcgaaatccgac。在一种实施方式中，基于荧光定量pcr方法检测rassf1a基因的试剂包括扩增rassf1a基因的引物序列和探针：上游引物序列seqidno:3：gcgttgaagtcggggttcg；下游引物序列seqidno:4：cccgtacttcgctaactttaaacg；和检测探针序列seqidno:8：aaacgcgaaccgaacgaaacc。在一种实施方式中，所述样品dna来自于鼻咽组织和/或鼻咽拭子dna。在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒在鼻咽癌检测中的应用。本发明同时使用联合使用msf1和rassf1a基因进行鼻咽癌检测时，灵敏度和特异性较单独使用msf1或rassf1a基因的灵敏度和特异性都明显提高。因为甲基化和非甲基化的dna区别就在用cpg序列，经过亚硫酸盐处理后，甲基化的cpg继续保持cpg序列，而非甲基化的就变成了ug序列了，这样就有了序列的差异。在探针中，把这种序列不放在探针的二端，有利于区分正确匹配和错配；而引物是要把这种差异的序列放在3’端，引物3’端不匹配就不能延伸。gpg序列不放在探针的二端，引物放在3’端，防止后续的qpcr反应产生非特异性，增强了检测的灵敏度和特异性。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是本发明鼻咽癌组织样本中qpcr实验曲线图，其中图1a鼻咽癌组织样本中msf1和actb基因甲基化荧光定量曲线图，msf1基因是短虚线，actb是长虚线；图1b是鼻咽癌组织样本中rassf1a和actb基因甲基化荧光定量曲线图，rassf1a基因是短虚线，actb是长虚线；图1c是非鼻咽癌患者鼻咽黏膜细胞的msf1和actb甲基化荧光定量pcr曲线图，msf1基因是短虚线；actb是长虚线；图2是当msf1基因的引物探针不用本发明所设计的引物探针时检测结果图，msf1基因是短虚线，actb是长虚线；和图3是当rassf1a基因的引物探针不用本发明所设计引物探针时检测结果图，rassf1a基因是短虚线，actb是长虚线。具体实施方式为了使本领域
技术领域：
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例一本发明检测鼻咽癌的试剂盒本发明检测鼻咽癌的试剂盒包括基于荧光定量pcr方法检测msf1基因和rassf1a基因甲基化的试剂和检测内对照参考基因actb的试剂。检测msf1基因和rassf1a基因甲基化的试剂各自包括一对甲基4位点扩增引物、一条检测甲基化位点的探针；检测actb基因包括一对非甲基化位点扩增引物、一条检测非甲基化位点探针。各种序列如表1和表2。1.pcr引物设计在msf1和rassf1a基因的甲基化扩增引物序列上，都含有cpg序列(序列中cg序列)，并且尽量使得cpg序列位于引物的5’端，这样就保证了尽量只扩增出发生了甲基化的dna序列。表1.基因pcr引物序列注：f表示上游引物，r表示下游引物2.探针设计即使是鼻咽癌组织的临床样本，中间也总掺杂有很多正常细胞，而正常的鼻咽细胞的msf1基因和rassf1a是不发生甲基化的，为了提高甲基化dna片段检测的灵敏度，在探针上至少含有3个cpg岛序列，并且cpg位点尽可能位于探针的中间位置，这样万一在pcr扩增环节有部分正常的dna得到非特异性的扩增，也可以在探针杂交环节，降低这种非特异性扩增对检测结果的影响。而内对照的actb是不发生甲基化的，因此只需要设计非甲基化探针。表2.探针序列探针名称探针序列(5’-3’)序列名称msf1-pfam-ttaaccgcgaaatccgac-bhqlseqidno:7rassf1a-pfam-aaacgcgaaccgaacgaaacc-mgbseqidno:8actb-pvic-ccaccttaccctaaacactacaac-bhq1seqidno:9其中msf1和actb，以及rassf1a和actb分别在一个pcr反应体系中进行双重扩增反应。3.鼻咽组织和鼻咽拭子dna提取鼻咽组织和鼻咽拭子的dna都采用商业化试剂盒进行提取，例如天根生化科技(北京)有限公司的tianampgenomicdnakit(离心柱法)4.dna的甲基化修饰转化采用7.5m的亚硫酸铵，70℃处理2个小时对dna进行转化。经过亚硫酸盐处理后，dna中发生了甲基化的cpg岛上的c碱基仍然保持c碱基，而没有发生甲基化的cpg岛上的c碱基则变成了u碱基，这样就造成了甲基化的dna和非甲基化的dna的序列差异，可以为后续的核酸检测方法检出。转化后的dna液体经过磁珠法dna纯化后，可以立即使用或放入-20℃保存待用，作为后续荧光定量qpcr反应的模板。5.荧光定量检测qpcr反应体系配制；需要反应两管，分别为msf1基因和actb组成一管，以及rassf1a基因和actb基因组成一管。每管组成为：补水到20μl。qpcr反应条件：msf1基因和内对照actb基因以及rassf1a基因和内对照actb基因在鼻咽癌组织，和鼻咽非癌组织中的qpcr实验曲线案例如图1，是本发明鼻咽癌组织样本中qpcr实验曲线图，是本发明鼻咽癌组织样本中qpcr实验曲线图，其中图1a鼻咽癌组织样本中msf1和actb基因甲基化荧光定量曲线图，msf1基因是短虚线，actb是长虚线；图1b是鼻咽癌组织样本中rassf1a和actb基因甲基化荧光定量曲线图，rassf1a基因是短虚线，actb是长虚线；图1c是非鼻咽癌患者鼻咽黏膜细胞的msf1和actb甲基化荧光定量pcr曲线图，msf1基因是短虚线；actb是长虚线。可以看见在临床样本中不管是鼻咽癌还是非鼻咽癌组织中，actb基因的反应都是阳性，表明临床来源的样本和实验流程没有问题；而msf1基因和rassf1a基因只有在鼻咽癌组织样本中发生，在非鼻咽癌组织样本中没有检出。以上结果说明，msf1基因和rassf1a基因的甲基化是可以区分鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织；并且用本发明设计的引物和探针的反应产生非特异性少，增强了检测的灵敏度和特异性。图2是当msf1基因的引物探针不用本发明所设计引物和探针时，就容易产生非特异性反应。该样本是非鼻咽癌患者的鼻咽黏膜组织，理论上作为短虚线的msf1基因不应该发生反应，但实际在非鼻咽癌患者的鼻咽黏膜组织ct＝29.2，这样就无法区分鼻咽癌和非鼻咽癌患者。图2中不用本发明msf1基因的引物探针而用以下引物探针(也含有cg碱基，但引物上的cg碱基数目较少，并且不在3’端；探针上的cg碱基不集中在中间区域)。表图2中实验所用引物和探针引物和探针名称序列序列名称msf1-facgttaagtagagtgttagtggtseqidno:10msf1-rtcacactctacacaacgccaatseqidno:11msf1-pccgtcccttcgccgccseqidno:12图3当rassf1a基因的引物探针不用本发明所设计引物和探针时，就容易产生非特异性反应；该样本是非鼻咽癌患者的鼻咽黏膜组织，理论上作为短虚线的rassf1a基因不应该发生反应。但实际在非鼻咽癌患者的鼻咽黏膜组织ct＝27.3，这样就无法区分鼻咽癌和非鼻咽癌患者。图3中不用本发明rassf1a基因的引物探针而用以下引物探针(也含有cg碱基，但引物上的cg碱基数目较少，并且不在3’端；探针上的cg碱基不集中在中间区域)。表图3中实验所用引物和探针引物和探针名称序列序列名称rassf1a-fttttcgaggattaggttcgtseqidno:13rassf1a-rcatataaacaaccacctctactcaseqidno:14rassf1a-paccattttcgcgcactctseqidno:15实施例二.本发明试剂盒的应用用本发明所描述的msf1基因和rassf1a基因甲基化检测试剂盒和方法，基于thermofisher公司的abi7500fastdx荧光定量仪器对临床上经过病理已经确认为鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本，和非鼻咽癌对照人群的鼻咽拭子样本的甲基化值进行了检测，结果如表3和表4。表3.在鼻咽癌组鼻咽拭子样本中检出的msf1和rassf1基因甲基化的ct值，和内参基因actb的ct值。当ct值>40时定为阴性。表4.在非鼻咽癌组鼻咽拭子样本中检出的msf1和rassf1基因甲基化和内参基因actb的ct值。当单独使用msf1基因进行检测时，灵敏度＝95％，特异性＝90％；当单独使用rassf1a基因进行检测时，灵敏度＝90％，特异性＝85％；当联合使用msf1和rassf1a基因进行检测时，灵敏度＝100％，特异性＝95％。有20例肿瘤样本，单独msf1检测出19例，灵敏度就是19/20＝95％；类似的，单独rassf1a灵敏为18/20＝90％。特异性一共有20例非肿瘤样本，单独msf1检出18例非肿瘤，2例假阳性，特异性就是18/20＝90％。类似的，单独rassf1a的特异性为17/20＝85％。当两者联合使用时，使用的是两者的并集，灵敏度＝100％，特异性＝95％。可见，本发明能准确区分出鼻咽癌患者和非鼻咽癌对照，当msf1基因或者rassf1a基因在鼻咽拭子中检出为甲基化阳性时，就怀疑所检测的鼻咽拭子样本中含有癌细胞，可以通过病理方法对鼻咽部癌变情况进行进一步确认。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。序列表<110>敬善生物科技江苏有限公司<120>一种在鼻咽癌检测中应用的试剂盒及其应用<130>pf1901<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttttcgtcgttgtttttcg19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ataatcccatccaactacg19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcgttgaagtcggggttcg19<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cccgtacttcgctaactttaaacg24<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ataataaaaaggaggttggat21<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tcccrcaaaacaaccac17<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttaaccgcgaaatccgac18<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aaacgcgaaccgaacgaaacc21<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ccaccttaccctaaacactacaac24<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acgttaagtagagtgttagtggt23<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tcacactctacacaacgccaat22<210>12<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ccgtcccttcgccgcc16<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ttttcgaggattaggttcgt20<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14catataaacaaccacctctactca24<210>15<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15accattttcgcgcactct18当前第1页12