一种用于米糠脂肪酶的制备方法与流程

本发明公开一种用于米糠脂肪酶的制备方法，其包括：米糠脂肪酶的萃取及纯化制程，从而取得米糠脂肪酶纯化酵素。
背景技术：
：目前米糠多被当作低价动物饲料使用，虽然米糠是种农业废弃物，但其含有很多营养价值，包括：膳食纤维、胺基酸组成均衡、脂肪酸组成均衡、玄米油、富含维生素e、富含维生素b群及矿物质、植物固醇类、阿魏酸、γ-米糠醇。虽然米糠具有如此多元化的营养价值，但其利用率并不高。此外，米糠有油脂酸败的缺点，且容易滋生微生物，所以保存不易。米糠酸败的原因主要来自于米糠本身含有的一种酵素作用，所述酵素称为脂肪酶(lipase)，米糠脂肪酶主要存在于米皮中，在未与脂肪接触时并不会产生作用。但是当自米皮碾下成米糠后，会导致脂肪酶与油脂发生接触，使脂肪酶酵素活性迅速提升，并开始降解脂肪释放出游离脂肪酸，进而造成油脂氧化性酸败，最终导致米糠发生酸败变质(中国专利cn102279166a)。所以对于米糠而言，脂肪酶的存在不利于米糠保存及后续利用。但是，脂肪酶除了可降解酯键释放出脂肪酸外，它还含有许多酵素活性，例如转酯化活性，可用于生质柴油制程。与传统化学反应相比较，脂肪酶的反应条件温和，并具有良好的受质立体选择性(可用于药物制备)，且对环境友善不会造成污染，因此脂肪酶广泛应用于食品、皮革、医药、饲料及清洁等工业领域中。在工业酵素市场方面，2014年全球市场产值达42亿美元，其特征在于脂肪酶约占整体市场10％。就脂肪酶市场分析，预估2020年全球市场将达近6亿美元，2015～2020年间的年成长率可达6.5％，主要用途为清洁工业及食品工业，主要市场以亚洲最大。全球多间企业以酵素切入工业酵素市场，使用的酵素种类以脂肪酶为主，脂肪酶相关产品的用途为生物性催化剂及油污清洁剂，酵素来源为微生物(真菌)及油污分解菌(bacillussp.)。中国专利cn103642771b揭示一种米糠脂肪酶的粗酶提取及保存方法，所述方法包括：第一步进行米糠脱脂作用，按每1g米糠对应3ml正己烷的比例进行，混匀后震荡(170-190rpm)处理25至35分钟，尔后经过充分过滤将滤渣内米糠颗粒取出，于常温下放置4至8小时，每1小时搅拌3至4次以使正己烷充分挥发；第二步进行脱脂米糠脂肪酶的提取，将充分干燥的脱脂米糠颗粒，按每1g脱脂米糠对应8ml蒸馏水的比例进行，混匀后震荡(170-190rpm)处理25至35分钟，再于低温下(2-6℃)离心(2,000-4,000rpm)处理25至35分钟后，取离心上清液即为米糠脂肪酶的粗酶提取液；最后一步进行米糠脂肪酶粗酶保存，将粗酶提取液制成冷干粉或以含有0.5mm氯化钙的磷酸缓冲液(50mm,ph7.0)进行保存。相较于传统磷酸缓冲液研磨提取法，本专利使用蒸馏水震荡法进行米糠脂肪酶的提取，所提取米糠脂肪酶粗酶的比活性较高且纯度好，所述方法操作简单且耗时较短。然所得粗酶未进一步进行纯化以取得纯度较高的脂肪酶。世界专利组织专利wo02/101033a1揭示一种米糠脂肪酶的纯化方法，所述方法包括：第一步进行米糠脱脂作用，按每1g米糠对应10ml乙醚的比例进行米糠脱脂；第二步进行脱脂米糠脂肪酶的提取，将脱脂米糠颗粒置入含有1mmedta的tris-hcl缓冲液(10mm,ph7.5)，搅拌处理12小时后，通过多层棉布过滤，所得滤液通过离心(3,000×g)处理30分钟后，取离心上清液即为米糠脂肪酶的粗酶提取液；最后一步进行米糠脂肪酶粗酶提取液的纯化，使用octyl-sepharose管柱(预先以ph7.5的0.01mtris-hcl缓冲液进行平衡)对米糠脂肪酶粗酶提取液进行纯化，并利用0至40％甲醇进行线性梯度溶离(一个溶离液分划收集量为10ml)，纯化米糠脂肪酶存在于较后期溶离出来的溶离液。最终纯化倍率为6.8倍，活性回收率为20％。本专利虽可取得纯度高的米糠脂肪酶并进行相关详尽的酵素特性分析，然制程复杂、费时且操作危险(使用乙醚进行米糠脱脂)，专利内容偏向学术研究，不利于商业化生产米糠脂肪酶。由以上专利整理得知，cn103642771b虽揭示一种操作简单且耗时较短的米糠脂肪酶提取方法，然所得米糠脂肪酶为粗酶，未进一步纯化取得纯度较佳的脂肪酶；而wo02/101033a1虽揭示一种详细的米糠脂肪酶纯化方法，然使用制程复杂、费时且危险(使用乙醚)，不利于商业化生产大量米糠脂肪酶。由此可知，截至目前为止，米糠脂肪酶的大量生产制程技术未臻完善，因此，若能发展出具有良好酵素萃取纯化效率、简易操作程序以及低成本的新式米糠脂肪酶制备制程，会是吾人所期望达成的。所以本发明提出的米糠脂肪酶的萃取及纯化制程，非常符合专利申请新颖性与进步性特点，具有专利可行性。技术实现要素：因此，本发明的目的在于，提高米糠脂肪酶的萃取及纯化效率，进而能利用米糠脂肪酶来进行高值化的酵素相关产品开发。本发明一种米糠脂肪酶的制备方法，其包括萃取步骤及纯化步骤，萃取步骤：将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液，纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，米糠是未脱脂米糠。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，米糠：酵素萃取溶液的比例为1:2以上。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，米糠：酵素萃取溶液的比例为1:4。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，酵素萃取溶液是含有表面活性剂的蒸馏水。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，酵素萃取溶液是含有表面活性剂为0.1％tritonx-100的蒸馏水。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，纯化步骤分为两阶段进行，第一阶段纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液加入硫酸铵搅拌，得到纯化第一阶段完成的米糠脂肪酶酵素溶液，第二阶段纯化步骤：将纯化第一阶段完成的米糠脂肪酶酵素溶液，加入酒精搅拌后静置，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，酒精浓度为20％以上。本发明米糠脂肪酶的制备方法，其中，酒精浓度为50％。本发明一种米糠脂肪酶的制备方法，其中，其包括萃取步骤及纯化步骤，萃取步骤：将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，酵素萃取溶液是含有表面活性剂的蒸馏水，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液，纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。本发明的功效在于，利用硫酸铵及酒精共沉淀进行酵素纯化，有别于公知采分段式步骤处理(通过硫酸铵沉淀步骤及酒精沉淀步骤)，可以有效地提升米糠脂肪酶制备效率及缩短米糠脂肪酶生产制程，且经过放大规模验证，证实本发明可以应用于商业化生产米糠脂肪酶。附图说明图1是本发明的米糠脂肪酶的制备方法的流程示意图。图2是脂肪酶标准品的脂肪酶酵素活性检量线。图3是牛血清白蛋白标准品的蛋白质浓度检量线(蛋白质浓度分析方法一)。图4是牛血清白蛋白标准品的蛋白质浓度检量线(蛋白质浓度分析方法二)。附图标记:<本发明>1萃取步骤2纯化步骤21纯化步骤第一阶段22纯化步骤第二阶段具体实施方式本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例和随文检附的图式后，将变得明显。参阅图1，本发明一种米糠脂肪酶的制备方法的较佳实施例，其包括萃取步骤1及纯化步骤2。萃取步骤1：将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，搅拌历时30至60分钟，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液，进一步说明的是，酵素萃取溶液是含有表面活性剂的蒸馏水，表面活性剂为0.1％tritonx-100。较佳地，米糠是使用未脱脂米糠，降低进料成本，而米糠：酵素萃取溶液的比例为1:2以上，更佳地，比例为1：4。纯化步骤2：将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。纯化步骤2分为两阶段进行，第一阶段纯化步骤21：将米糠脂肪酶酵素萃取液加入0至60％饱和浓度硫酸铵搅拌，搅拌历时30至60分钟，得到纯化第一阶段完成的米糠脂肪酶酵素溶液，第二阶段纯化步骤22：将纯化第一阶段完成的米糠脂肪酶酵素溶液，加入酒精搅拌，搅拌历时30至60分钟，静置10分钟，再予以离心或重力沉降，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。其中，酒精的最终浓度为20％以上，更佳地，酒精浓度为50％。本发明为了简化取得米糠脂肪酶所进行的萃取步骤1及纯化步骤2，并且提高制程效率，申请人通过戮力研究结果发现，对米糠施以简易酵素萃取步骤1，尔后利用硫酸铵及酒精共沉淀进行酵素纯化步骤2，可以有效地提升米糠脂肪酶制备效率及缩短米糠脂肪酶生产制程，并利用试验工厂等级设备，进行米糠脂肪酶制备制程的放大规模验证。本发明的功效在于，利用硫酸铵及酒精共沉淀进行酵素纯化，可以有效地提升米糠脂肪酶制备效率及缩短米糠脂肪酶生产制程，且经过放大规模验证，证实本发明可以应用于商业化生产米糠脂肪酶，有效提高米糠脂肪酶的萃取及纯化，进而能利用米糠脂肪酶来进行高值化的酵素相关产品开发。本发明将就下面的实验例来做进一步说明，但应了解的是，所述等实验例仅是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。《实验例1：一般实验方法：》1.脂肪酶酵素活性分析：在本实验例1中，各种酵素活性(0,1.05,2.63,5.25,7.88及10.5u)的脂肪酶标准品(lipasefromwheatgerm-typei,sigmal3001)及待测米糠脂肪酶样品，各取0.1ml加入3.2ml受质溶液(表1，含有受质0.55mmp-nitrophenyl-palmitate)，于35℃震荡反应20分钟后，于100℃处理5分钟以中止酵素反应，尔后离心(6,000rpm)处理10分钟，取离心上清液进行400nm吸光值测定。以各种酵素活性的脂肪酶标准品的酵素反应400nm吸光值为y轴、酵素活性为x轴(脂肪酶标准品以15units/mgprotein及protein＝70％的条件进行作图)，制作一条脂肪酶酵素活性检量线(图2)。将待测米糠脂肪酶样品的酵素反应400nm吸光值代入所述检量线，即可求得脂肪酶酵素活性(u)，再将求得酵素活性数值除以0.1(样品取0.1ml进行酵素反应)，即可得每毫升米糠脂肪酶样品的酵素活性(u/ml)。表1.受质溶液组成份。浓度磷酸缓冲液100mm(ph7)p-npp*0.55mmtritonx-1000.4％gumarabic0.1％*p-npp：p-nitrophenyl-palmitate,sigman27522.蛋白质浓度分析方法一：在本实验例1中，使用piercetmmicroplatebcaproteinassaykit(thermo#23252)进行蛋白质浓度分析，依据此套组分析流程进行。配制不同蛋白质浓度(0,0.125,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2mg/ml)的牛血清白蛋白标准品(bovineserumalbumin,bsa)及待测米糠脂肪酶样品，各取9l于96孔微孔盘的微孔中央，再加入4lcrs溶液(compatibilityreagentsolution)，震荡处理1分钟后，于37℃反应15分钟，再加入260lwr试剂(workingreagent)，震荡处理1分钟后，于37℃反应30分钟，再于室温处理5分钟，进行562nm吸光值测定。以各种蛋白质浓度的牛血清白蛋白标准品的562nm吸光值为y轴、蛋白质浓度为x轴，制作一条蛋白质浓度检量线(图3)。将待测米糠脂肪酶样品的562nm吸光值代入所述检量线，即可求得米糠脂肪酶样品的蛋白质浓度(mg/ml)。3.蛋白质浓度分析方法二：在本实验例1中，各种蛋白质浓度(0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200g/ml)的牛血清白蛋白标准品(bovineserumalbumin,sigmaa3803)及待测米糠脂肪酶样品，各取20l加入200l染料溶剂(bio-radproteinassay_dyereagentconcentrate#500-0006)，混合均匀后，于室温反应5分钟，进行595nm吸光值测定。以各种蛋白质浓度的牛血清白蛋白标准品的595nm吸光值为y轴、蛋白质浓度为x轴，制作一条蛋白质浓度检量线(图4)。将待测米糠脂肪酶样品的595nm吸光值代入所述检量线，即可求得米糠脂肪酶样品的蛋白质浓度(g/ml)。《实验例2.不同酵素萃取溶液的米糠脂肪酶萃取效能比较：》本实验例2使用不同酵素萃取溶液，包括：本发明米糠脂肪酶萃取溶液、中国专利cn103642771b萃取溶液及传统萃取溶液，分别对米糠进行脂肪酶萃取，比较不同酵素萃取溶液的米糠脂肪酶萃取效能。实验材料：1.未脱脂米糠及脱脂米糠制备：本实验例2中所使用的未脱脂米糠是购自于联发碾米工厂。关于脱脂米糠制备，首先，将购自于联发碾米工厂的未脱脂米糠，以一为25％(v/v)的比例加入正己烷中进行脱脂反应，于室温下搅拌30分钟，移去上清液后，将脱脂米糠置于滤纸上，并放置于排烟柜中干燥60分钟，而由此所得到的米糠即为脱脂米糠。2.酵素萃取溶液：本实验例2中所使用的酵素萃取溶液包括：蒸馏水(包含有表面活性剂，例如：0.1～1％tritonx-100或sds(十二烷基硫酸钠)或tween20，本发明米糠脂肪酶萃取溶液)、蒸馏水(中国专利cn103642771b的米糠脂肪酶萃取溶液)或50mm磷酸盐缓冲液(ph7，含0.5mmcacl2，传统米糠脂肪酶萃取溶液)。实验方法：参考中国专利cn103642771b的实验方法，对未脱脂米糠或脱脂米糠进行脂肪酶萃取(cn103642771b未对未脱脂米糠进行脂肪酶萃取)。将干燥的脱脂米糠或未脱脂米糠颗粒，按每1g米糠颗粒对应8ml酵素萃取溶液的比例进行，混匀后震荡(180rpm)处理30至60分钟，再以离心(3,000×g)处理30分钟后，取离心上清液即为米糠脂肪酶的酵素萃取液，并对各组酵素萃取液进行脂肪酶酵素活性分析。实验结果：本实验的脱脂与未脱脂米糠及不同酵素萃取溶液所测得的蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性及比活性，结果比较被显示于表2。表2.脱脂与未脱脂米糠及不同酵素萃取溶液所测得的蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。*50mm磷酸盐缓冲液(ph7，含0.5mmcacl2)**使用蛋白质浓度分析方法一进行蛋白质浓度分析注：实验数据为三个独立分析数据的平均值从表2结果可见，当使用米糠为脱脂米糠时，比较三种不同酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。结果发现，以本发明米糠脂肪酶萃取溶液(蒸馏水(包含有0.1％tritonx-100))进行米糠脂肪酶萃取可得最佳的每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。与其他两种酵素萃取溶液相比，本发明酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的每毫升脂肪酶酵素活性，分别为蒸馏水及磷酸盐缓冲液萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的1.6倍及1.7倍；而比活性则分别为1.2倍及1.5倍。当使用米糠为未脱脂米糠时，比较三种不同酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。结果发现，以本发明米糠脂肪酶萃取溶液配方进行米糠脂肪酶萃取可得最佳的每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。与其他两种酵素萃取溶液相比，本发明酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的每毫升脂肪酶酵素活性，分别为蒸馏水及磷酸盐缓冲液萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的1.6倍及1.8倍；而比活性则分别为1.3倍及1.5倍。比较脱脂米糠与未脱脂米糠实验所得米糠脂肪酶萃取液的脂肪酶酵素比活性，结果发现，以本发明米糠脂肪酶萃取溶液进行米糠脂肪酶萃取，不论使用米糠是否经过脱脂处理，皆可萃取得到相同比活性的米糠脂肪酶萃取液；反观其他两种酵素萃取溶液，当使用米糠未经过脱脂处理时，则所萃取得到米糠脂肪酶萃取液的比活性会明显下降或略微下降。由上述实验结果可知，本发明米糠脂肪酶萃取溶液萃取米糠脂肪酶的效能，明显优于中国专利cn103642771b萃取溶液及传统萃取溶液；且不论使用米糠是否经过脱脂处理，本发明米糠脂肪酶萃取溶液皆可达到相同的米糠脂肪酶萃取效能。《实验例3.米糠脂肪酶萃取制程的固液比例研究：》本实验例3使用米糠与酵素萃取溶液的不同固液比例，对米糠进行脂肪酶萃取，比较不同固液比例进行米糠脂肪酶的萃取效率。主要目的为希望通过提高固液比例，以降低酵素萃取溶液使用量及缩小米糠脂肪酶萃取制程的操作体积。实验材料：1.未脱脂米糠：本实施例中所使用的未脱脂米糠是购自于联发碾米工厂。2.酵素萃取溶液：本实施例中所使用的酵素萃取溶液为蒸馏水(包含有0.1％tritonx-100，本发明米糠脂肪酶萃取溶液)。实验方法：首先对未脱脂米糠进行脂肪酶萃取，依据米糠与酵素萃取溶液的不同固液比例，各固液比例(米糠：酵素萃取溶液)为1:1、1:2、1:4及1:8，分别取96g、48g、24g及12g米糠颗粒加入96ml酵素萃取溶液，混匀后震荡(180rpm)处理30～60分钟，再以离心(3,000×g)处理30分钟后，取离心上清液即为米糠脂肪酶的酵素萃取液。实验结果：本实验各固液比例的米糠脂肪酶酵素萃取液所测得的蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及总活性，结果比较被显示于表3。表3.各固液比例的米糠脂肪酶酵素萃取液所测得的蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及总活性。*固液比例为米糠：酵素萃取溶液**使用蛋白质浓度分析方法二进行蛋白质浓度分析注：实验数据为三个独立分析数据的平均值从表3结果可见，当固液比例太高时(固:液＝1:1)，会导致米糠回溶液过于黏稠并呈现半凝固状，使米糠酵素萃取制程无法顺利进行。比较其余三种不同固液比例所得米糠脂肪酶萃取液的每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及总活性。结果发现，与原固液比例(1:8)比较，当固液比例提高至1:4时，每毫升脂肪酶酵素活性增加为2.2倍、比活性增加为1.4倍、总活性增加为2倍；而当固液比例提高至1:2时，每毫升脂肪酶酵素活性增加为3.4倍、比活性增加为1.6倍、总活性增加为2.8倍。由米糠使用量及总活性结果判断，当固液比例提高至1:4时，米糠脂肪酶萃取效率与原制程(固液比例＝1:8)相似；但当固液比例提高至1:2时，则米糠脂肪酶萃取效率较原制程(固液比例＝1:8)为差。由上述实验结果可知，米糠与酵素萃取溶液的不同固液比例确实会影响米糠脂肪酶酵素萃取的效率，当制程使用的固液比例提高至1:4时，米糠脂肪酶萃取效率与原制程(固液比例＝1:8)相似，可有效地降低酵素萃取溶液使用量及缩小米糠脂肪酶萃取制程的操作体积。《实验例4.米糠脂肪酶的纯化制程研究：》本实验例4使用两种不同的酵素纯化方法，对米糠脂肪酶酵素萃取液进行脂肪酶酵素纯化，两种酵素纯化方法分别为本发明特有米糠脂肪酶的硫酸铵暨酒精纯化法及传统硫酸铵纯化法，比较两种酵素纯化方法进行米糠脂肪酶酵素纯化的效率。实验材料：1.未脱脂米糠：本实验例4中所使用的未脱脂米糠是购自于联发碾米工厂。2.酵素萃取溶液：本实验例4中所使用的酵素萃取溶液为蒸馏水(包含有0.1％tritonx-100，本发明米糠脂肪酶萃取溶液配方)。3.酵素沉淀回溶液本实验例4中所使用的酵素沉淀回溶液为50至100mm磷酸缓冲液(ph8.0)。实验方法：首先使用两种固液比例(1:4及1:8)对未脱脂米糠进行脂肪酶萃取，当使用固液比例为1:4时，取7.5g米糠颗粒加入30ml酵素萃取溶液进行酵素萃取；当使用固液比例为1:8时，取3.75g米糠颗粒加入30ml酵素萃取溶液进行酵素萃取。米糠颗粒与酵素萃取溶液混匀后震荡(180rpm)处理30至60分钟，再于室温下离心(3,000×g)处理30分钟后，取离心上清液即为米糠脂肪酶的酵素萃取液。对酵素萃取液进行脂肪酶纯化，分为实验组及对照组。对照组使用传统的硫酸铵纯化法，实验步骤为取25ml酵素萃取液加入9.025g硫酸铵(0至60％饱和浓度硫酸铵)，搅拌混匀30至60分钟，再以高速离心(12,000×g)处理15分钟后，取离心沉淀块即为米糠脂肪酶的对照组纯化酵素沉淀。对照组纯化酵素沉淀以酵素沉淀回溶液进行酵素沉淀回溶，回溶后即为对照组纯化酵素液。实验组使用本专利特有的硫酸铵暨酒精纯化法，实验组实验步骤为取25ml酵素萃取液加入9.025g硫酸铵(0至60％饱和浓度硫酸铵)，搅拌混匀30分钟(总体积为30ml)，分别加入8ml、13.8ml、21.8ml及33.3ml95％工业酒精(最终酒精浓度分别为20％、30％、40％及50％)，于室温下搅拌混匀30分钟后，静置10分钟，再以低速离心(3,000×g)处理10分钟后，取离心沉淀块即为米糠脂肪酶的实验组纯化酵素沉淀。实验组纯化酵素沉淀以酵素沉淀回溶液进行酵素沉淀回溶，回溶后即为实验组纯化酵素液。实验结果：本实验两种酵素纯化方法所制得的纯化酵素液，其蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及总活性，结果比较被显示于表4。表4.纯化酵素液的蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及总活性。*酒精浓度20％、30％、40％及50％表示为实验组，其酵素萃取液经过0至60％饱和浓度硫酸铵处理后，再加入酒精处理，其最终酒精浓度分别为20％、30％、40％及50％；对照组表示为酵素萃取液只经过0至60％饱和浓度硫酸铵处理，而未再进行酒精处理。**使用蛋白质浓度分析方法二进行蛋白质浓度分析***对照组的酵素沉淀以高速离心(12,000×g)处理15分钟后取得；实验组的酵素沉淀以低速离心(3,000×g)处理10分钟后取得。注：实验数据为三个独立分析数据的平均值从表4结果可见，当固液比例为1:8时，与对照组比较，最终酒精浓度20％、30％、40％及50％实验组的每毫升脂肪酶酵素活性分别为对照组的0.46倍、0.45倍、0.44倍及1.05倍；比活性分别为对照组的5.67倍、5.55倍、5.45倍及8.23倍；总活性分别为对照组的0.48倍、0.73倍、0.68倍及3.96倍。当固液比例为1:4时，与对照组比较，最终酒精浓度20％、30％、40％及50％实验组的每毫升脂肪酶酵素活性分别为对照组的0.48倍、0.47倍、0.51倍及1.01倍；比活性分别为对照组的6.35倍、5.72倍、6.28倍及10.07倍；总活性分别为对照组的0.54倍、0.58倍、0.71倍及3.67倍。由脂肪酶总活性结果进行不同固液比的米糠脂肪酶萃取及纯化效率判断，就对照组而言，固液比例1:4的对照组的脂肪酶总活性为固液比例1:8的对照组的脂肪酶总活性的1.94倍，显示将固液比例提高至1:4时，其米糠脂肪酶萃取及纯化效率与原制程(固液比例＝1:8)相似。由脂肪酶总活性结果进行不同酵素纯化法的米糠脂肪酶萃取及纯化效率判断，相较于传统硫酸铵纯化法(对照组)，本发明特有米糠脂肪酶的硫酸铵暨酒精纯化法(酒精浓度50％实验组)的米糠脂肪酶萃取及纯化效率明显较佳，于固液比1:8及1:4情况下，酒精浓度50％实验组的米糠脂肪酶总活性分别为对照组的米糠脂肪酶总活性的3.96倍及3.67倍。然而，当酒精浓度<50％时(酒精浓度20％、30％及40％实验组)，则其米糠脂肪酶总活性较对照组的米糠脂肪酶总活性为低。此外，相较于对照组及酒精浓度20％、30％、40％实验组，酒精浓度50％实验组在进行酵素沉淀取得时，于低速离心(3,000×g)处理10分钟后，极易取得米糠脂肪酶酵素沉淀，甚至使用重力沉降也可达相似沉淀效果；相反地，对照组及酒精浓度20％、30％、40％实验组则较难顺利取得米糠脂肪酶酵素沉淀。由上述实验结果可知，本发明特有米糠脂肪酶的硫酸铵暨酒精纯化法的酵素纯化效能，明显优于传统硫酸铵纯化法；且本发明开发的酵素纯化制程操作容易，不须使用高速离心设备即可顺利取得纯化酵素沉淀，有利于制程放大。《实验例5.米糠脂肪酶制备制程的放大规模验证：》本实验例5使用试验工厂等级设备，对本发明的米糠脂肪酶制备制程进行放大规模验证，以有效地提升米糠脂肪酶制备效率及缩短米糠脂肪酶生产制程。实验材料：1.未脱脂米糠本实验例5中所使用的未脱脂米糠是购自于联发碾米工厂。2.酵素萃取溶液本实验例5中所使用的酵素萃取溶液为蒸馏水(包含有0.1％tritonx-100，本发明米糠脂肪酶萃取溶液配方)。3.酵素沉淀回溶液本实验例5中所使用的酵素沉淀回溶液为50至100mm磷酸缓冲液(ph8.0)。4.试验工厂等级设备4.试验工厂等级设备实验方法：首先对未脱脂米糠进行脂肪酶萃取，依据米糠与酵素萃取溶液的固液比例1:4，于500公升酦酵槽中加入35kg米糠颗粒及140l酵素萃取溶液，进行搅拌(120rpm)处理60分钟，再以卧式连续离心机进行连续式离心处理30分钟后，所收集的离心上清液即为米糠脂肪酶的酵素萃取液。对酵素萃取液进行脂肪酶纯化，分为对照组及实验组。对照组使用传统的硫酸铵纯化法，实验步骤为取上述制备的酵素萃取液(体积为160l)于500公升酦酵槽中，加入60kg硫酸铵(0至60％饱和浓度硫酸铵)，搅拌(120rpm)混匀60分钟，再以卧式连续离心机或连续式高速远心分离机(16,000×g)进行连续式离心处理，然无法取得酵素沉淀。实验组使用本专利特有的硫酸铵暨酒精纯化法，实验组实验步骤为取上述制备的酵素萃取液(体积为160l)于500公升酦酵槽中，加入60kg硫酸铵(0至60％饱和浓度硫酸铵)，搅拌(120rpm)混匀60分钟，此时溶液总体积为200l，再加入200l95％工业酒精，搅拌(120rpm)混匀60分钟，再静置10分钟后，待重力沉降即可得米糠脂肪酶的实验组纯化酵素沉淀(约60kg)。实验组纯化酵素沉淀以酵素沉淀回溶液进行酵素沉淀回溶，回溶后即为实验组纯化酵素液。实验结果：本实验依据传统硫酸铵纯化法，利用试验工厂等级设备进行米糠脂肪酶酵素纯化，然无法取得酵素沉淀(对照组)。本实验使用本专利特有的硫酸铵暨酒精纯化法，利用试验工厂等级设备进行米糠脂肪酶酵素纯化，可顺利取得酵素沉淀(实验组)。取5g实验组纯化酵素沉淀以3ml酵素沉淀回溶液进行回溶，回溶后得总体积为6.5ml的实验组纯化酵素液，其蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及总活性显示于表5。表5.放大规模验证的米糠脂肪酶纯化酵素液(5g纯化酵素沉淀)所测得的蛋白质浓度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及总活性。*使用蛋白质浓度分析方法二进行蛋白质浓度分析注：实验数据为三个独立分析数据的平均值从表5结果可见，本发明的米糠脂肪酶制备制程，使用试验工厂等级设备可顺利地进行放大规模验证，放大规模验证所得米糠脂肪酶纯化酵素液(5g纯化酵素沉淀以3ml酵素沉淀回溶液进行回溶，回溶后总体积为6.5ml)，其蛋白质浓度为0.64mg/ml、每毫升脂肪酶酵素活性为400u/ml、比活性为623u/mg、总活性为2598u。相较于传统硫酸铵纯化法无法顺利以试验工厂等级设备进行放大规模验证，本发明的米糠脂肪酶制备制程使用新颖的硫酸铵暨酒精纯化法，成功地使用试验工厂等级设备完成规模放大验证，且酵素沉淀制程不须利用离心设备或固液分离设备，仅需使用重力沉降法即可顺利取得纯化酵素沉淀，显示本发明的酵素萃取纯化制程可有效地提升米糠脂肪酶制备效率及降低米糠脂肪酶生产成本。为了这本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。相较于传统硫酸铵纯化法无法顺利以试验工厂等级设备进行放大规模验证，本发明的米糠脂肪酶制备制程使用新颖的硫酸铵暨酒精纯化法，成功地使用试验工厂等级设备完成规模放大验证，且酵素沉淀制程不须利用离心设备或固液分离设备，仅需使用重力沉降法即可顺利取得纯化酵素沉淀，显示本发明的酵素萃取纯化制程可有效地提升米糠脂肪酶制备效率及降低米糠脂肪酶生产成本。除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有熟悉本发明所属技艺的人士所共同了解的意义。一熟悉本技艺者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。如本文中所用的，术语“脂肪酶”意指全名为triacylglycerollipase(ec3.1.1.3)具有水解脂肪酯键能力的酵素，其可对油脂进行水解作用，从而产生脂肪酸及醇类。如本文中所用的，术语“萃取”意指利用水、溶剂、缓冲液等，对米糠进行酵素萃取反应，以提取含有米糠脂肪酶的酵素萃取液。而这些操作条件的选择是熟习此项技艺者能例行性地自行决定的。如本文中所用的，术语“纯化”意指利用化学药剂、溶剂、胶体等，对含有米糠脂肪酶的酵素萃取液进行酵素纯化反应，以取得具酵素活性的米糠脂肪酶纯化酵素。而这些操作条件的选择是熟习此项技艺者能例行性地自行决定的。如本文中所用的，术语“试验工厂等级设备”意指利用操作体积100公升以上的系统设备，对米糠脂肪酶制备制程进行放大规模验证。而这些操作条件的选择是熟习此项技艺者能例行性地自行决定的。依据本发明，所述酵素萃取及纯化制程可以采用熟习此项技艺者所详知且惯用的技术来进行。可了解到的是，有关酵素萃取及纯化的操作条件会进一步随着所使用的溶剂以及化学药品等因素而被变动，以便达致最佳的酵素萃取及纯化效果。而这些操作条件的选择是熟习此项技艺者能例行性地自行决定的。如本文中所用的，术语“活性”意指脂肪酶活性，以脂肪酶标准品(lipasefromwheatgerm-typei,5-15units/mgprotein,protein：≥70％,sigmal3001)的活性单位作为代表，以u表示。脂肪酶标准品的1个单位活性(1u)定义为，在酸碱值为7.4(ph7.4)及37℃的环境下，脂肪酶标准品每1小时可对受质三酸甘油酯作用，水解产生1微当量(microequivalent)的脂肪酸。如本文中所用的，术语“比活性”意指每毫克蛋白质所含有的脂肪酶活性，以u/mg表示。如本文中所用的，术语“总活性”意指酵素溶液所含有的总脂肪酶活性，总活性为每毫升米糠脂肪酶酵素溶液活性(u/ml)与米糠脂肪酶酵素溶液体积量(ml)的乘积，以u表示。如本文中所用的，术语“蛋白质浓度”意指每毫升酵素溶液所含有的总蛋白质量，以mg/ml表示。于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的申请专利范围所示者的限制。当前第1页12