棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及棉花分子育种技术领域，尤其涉及棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用。

背景技术：

棉花是一种重要的纤维作物。近年来受国内外行情影响，我国棉花种植面积逐渐减少，作为世界上最大的棉花消费国，我国的棉花生产与需求难以平衡。而棉花产业是社会经济结构中不可或缺的产业，通过提高棉花产量以振兴棉花产业是时代发展的必然选择。植物雄性不育即植物的雄蕊败育的现象，是利用杂交优势的强大工具，棉花三系杂交育种中，恢复系的选育对杂交组合潜力的影响很关键，然而恢复源相对来说比较狭窄，因此，定位恢复基因，从而用分子标记辅助育种或克隆恢复基因合成优良恢复系，具有重要意义。

植物雄性不育系在杂种优势上具有重要地位，开发利用价值巨大。植物雄性不育现象一般分为三类：细胞核雄性不育(geneticmale-sterility，gms)、质核互作雄性不育(cytoplasmic-geneticmale-sterility，cgms)(chenandliu,2014)和胞质型不育(cytoplasmicmale-sterility，cms)，细胞核雄性不育通常为核基因隐性突变，质核互作雄性不育即细胞质雄性不育，一般由线粒体基因突变而引起的核质互作，为母性遗传(budarandpelletier,2001)。现已知超过150个物种的细胞质雄性不育现象，都与异常线粒体基因导致花粉发育受阻有关(bentolilaetal.,2002)。胞质型不育在水稻开发利用较早(pradhanandjachuck,2012)，因其育性恢复基因资源不易找到，在其他作物上应用不多。随着作物杂交种子的大面积推广，杂交种子的生产需要在质和量上都需要提升，才能提高作物产量和产品质量。首先，需要选育育性稳定，制种安全，繁殖系数高，高产稳产的不育系(陈立云等2007)，然后与恢复力强，综合性状优良的恢复系搭配。然而，有些作物恢复源狭窄以及高度自交，如小麦(范濂等1986)、大豆(白羊年等2002)，恢复系综合性状不良，选育强优恢复系耗时耗力。因此，储备更多的恢复基因资源，通过遗传定位、基因克隆实现恢复基因的分子标记筛选和转化，是提高育种效率，加大杂种优势利用水平的重要途径。

目前的相关研究中，关于育性恢复机理在主要农作物中已有较多报道，大部分育性恢复基因都属于编码ppr蛋白的基因家族。研究表明，ppr蛋白识别并结合cms诱导因子，通过rna编辑(pringetal.,1998)、促使cms诱导因子降解(kazamaetal.,2014)、稳定cms诱导蛋白翻译后产物(bellaouietal.,1999)等方式，使雄性不育植物育性恢复。其中两个例子一个是玉米的恢复基因rf2，这是一个乙醛脱氢酶基因；另一个例子为甜菜的一个编码bvorf20蛋白的恢复基因。

ppr蛋白最早在2000年被small和peeters描述为细胞器蛋白(smalletal.,2000)，与此同时aubourg等(2000)也发现拟南芥基因组中存在具有重复单元的蛋白，其典型的结构域为2-27个以35个氨基酸为单元的串联重复，根据串联重复之间是否有间隙，可将ppr蛋白分为p亚族和pls亚族。ppr蛋白的c端为非ppr结构域，包含3种保守的结构域-e、e+、dyw，n端有一段长度可变的细胞器定位序列(sahaetal.,2007)。大量研究表明，ppr蛋白在植物生长发育上具有重要的生理功能，典型的ppr蛋白定位在线粒体和叶绿体，通过其rna结合活性影响细胞器的发生和功能(barkanandsmall,2014)，叶绿体定位ppr蛋白突变影响胚胎发育、光合功能和种子色素沉淀，线粒体定位ppr蛋白突变除了影响胚胎发育外，还与植物雄性不育的育性恢复有关(mannaetal.,2015)。ppr基因先后在矮牵牛(bentolilaetal.,2002)、萝卜(koizukaetal.,2003；brownetal.,2003；desloireetal.,2003)、水稻(kazamaandtoriyama,2003；akagietal.,2004；tangetal.,2014；huetal.,2012))、高梁(kleinetal.,2005)、甘蓝(sharmaetal.,2012)、小麦(rizzolattietal.,2017)中作为恢复基因被发现。萝卜的rfo(koizukaetal.,2003)、orf67(desloireetal.,2003)，油菜的rfp(liuetal.,2016)、rfn(liuetal.,2017)，水稻的rf1(akagietal.,2004)和rf5(huetal.,2012)、rf4(tangetal.,2014)得到图位克隆，乔木也有相应规律。有研究表明扁桃的两个恢复基因rf1和rf2都可能为ppr基因(donosoetal.,2015)。在棉花的相关研究中，yang等(2010)在陆地棉中克隆了5个ppr基因，但没有发现它们在不育系和恢复系之间的表达差异；wu等(2014)将一个ppr基因作为陆地棉cms-d2恢复基因的候选基因，虽然没有深入的研究证明ppr基因在棉花相关恢复系中扮演恢复基因角色的证据，但ppr基因作为候选基因具有深厚的理论依据。

棉花质核互作雄性不育在生产上的应用较晚。最早的相关研究在20世纪60年代，richmond等(1961)通过远缘杂交核置换，在亚洲棉变种×瑟伯氏棉的双二倍体与陆地棉后代中发现不同程度的雄性不育现象，meyer等(1962)通过异常棉×瑟伯氏棉的双二倍体与陆地棉核置换，在杂交后代中发现花粉的育性明显降低，从而推测是异常棉细胞质基因引起了雄性不育。1964年meyer等(1964)报道含有异常棉细胞质的植株大部分花药表现为雄性不育，但由于不育不彻底，未能实现三系配套。在后续的研究中，meyer相继将陆地棉的核置换到野生棉中，获得了具有异常棉、亚洲棉和哈克尼西棉细胞质的雄性不育系，这三种不育系均属于孢子体不育，异常棉、亚洲棉细胞质雄性不育系对环境不稳定，利用价值低；哈克尼西棉细胞质雄性不育系育性稳定，已实现三系配套(meyer1973；1975)。虽然，三系杂交种的审定已经取得了一定进展，但是受制于具有强恢复力的优良恢复系亲本资源匮乏的限制，目前，仍然没有实现三系杂交棉的大面积推广。因此，在三系杂交棉选育过程中，具有强恢复力的优良恢复系选育和改良是育种工作者长期研究的重点和难点。

采用常规育种技术可以实现恢复系改良的目的，但是利用该方法需要年限长，而且转育后每年都需要进行大量的田间测交和鉴定来确保恢复基因的存在，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。另一方面，三系杂交种制种过程中，恢复系的纯度至关重要，一旦混杂，将直接导致杂交种后代出现不育株的情况，严重影响棉花产量。常规育种过程中棉花细胞质雄性不育恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长、消耗大、准确性差，因此，迫切需要一种稳定可靠又快速的鉴定恢复系纯度和选育改良的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用，可以快速、准确地鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系以及棉花恢复系种子纯度。

本发明的目的之一在于提供棉花恢复系恢复基因的分子标记，其由核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物经pcr扩增棉花基因组dna得到。

本发明的目的之二在于提供所述分子标记在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。

本发明的目的之三在于提供所述分子标记在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种用于鉴定棉花恢复系恢复基因的caps标记引物，其为核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物。

本发明的目的之五在于提供所述的caps标记引物在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。

本发明的目的之六在于提供所述的caps标记引物在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。

本发明的目的之七在于提供一种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1、用所述的caps标记引物扩增待测棉花样品的基因组dna，回收扩增产物；

步骤2、扩增产物经限制性内切酶酶切后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，判断原则如下：

若电泳条带只出现663bp特异性条带，且没有出现785bp特异性条带，则待测样品为不含恢复基因位点的棉花材料；

若电泳条带出现663bp特异性条带的同时，还出现785bp特异性条带，则待测样品为恢复基因位点杂合的棉花材料；

若电泳条带仅有785bp特异性条带，且没有出现663bp特异性条带，则待测样品为恢复基因位点纯合的棉花材料。

具体地，所述步骤2的内切酶为hindiii。

本发明的有益效果：

1、本发明以陆地棉胞质不育系6001a和恢复系7r13两个材料为基础，将恢复基因定位至d05染色体上的一个ppr簇，分析对ppr基因测序的差异序列发现了一个适合设计caps标记的位点，并成功开发了一个和恢复基因紧密连锁的caps标记。

2、本发明提供的棉花恢复系恢复基因的分子标记，可以快速、准确地鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系以及棉花恢复系种子纯度。且操作简单，只需提供棉花材料的种子或叶片，提取dna后，用caps标记引物扩增后进行酶切,只需通过简单的琼脂糖凝胶分析即可进行分子标记鉴定，整个标记检测的过程仅需要2.5-3小时。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2为酶切位点分析结果；

图3为caps分析结果；其中m为marker；a代表细胞质雄性不育系6001a；r代表恢复系7r13；f1代表细胞质雄性不育系6001a作为母本，恢复系7r13作为父本的杂交一代；1-22泳道代表f1自交得到f2代不同植株样本；表型中s代表不育系，f代表可育系；基因型中a代表不含恢复基因位点的棉花材料，b恢复基因位点纯合的棉花材料，h为恢复基因位点杂合的棉花材料。

具体实施方式

实施例1分子标记的获得

1、群体构建与表型考察

群体母本为岳阳市农科院在瑟伯氏棉和陆地棉后代选育的细胞质雄性不育系6001a，父本为恢复系7r13，将7r13花粉授给6001a得到可育的f1，f1自交得到f2，f2群体种植在湖南省岳阳市农科院试验田。在群体材料开花后，考察花粉育性3次。表型考察方法为：在天气已连续晴朗数日，近期无极端天气出现的时候，早上9点左右开始，选取长度为5mm以上的花蕾或开放的花，徒手剥开花瓣，花蕾期花药充实或开花当天手捻花药出现花粉的单株，记为可育，花药皱缩或开花当天手捻花药无花粉的单株记为不育。

2、群体基因分型

提取f2群体dna，选择不育单株和可育单株各15株分别等量混合构建成不育单株bulk和可育单株bulk。根据sbsa-seq初定位结果(d05:38463108-55846369)，以两亲本及不育单株bulk和可育单株bulk的dna样品，筛选本实验室的遗传连锁图谱d05上的分子标记以及新开发的标记，得到在两亲本及不育单株bulk和可育单株bulk上有多态性的分子标记。然后用多态性标记对f2群体进行基因分型，按a、b、h读取带型数据。

3、恢复基因定位

根据上一步得到的带型数据，群体分析mon_cgr5388，nau6205，mon_dpl0137，nau3938，bnl3535，cm3，cm51等7个标记，恢复基因定位在nau3938和cm3两个标记之间，然后在这两个标记之间，我们获取其物理位置得到参考序列后，开发了新的ssr标记和utr标记(primerpremier5设计)，最后将基因定位在区间d05:52546929-55129445上。

4、区间ppr基因分析

提取定位区域d05:52546929-55129445的基因组序列，用fgenesh注释该段序列上的基因，并将所有ppr基因单独列出进行比对(fgenesh：http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind)，比对软件为dnaman6.0.3.99。发现序列同源度很高，难以设计特异引物直接扩增编码区。

5、目的基因分析

设计巢式引物扩增ppr基因，经过两轮pcr扩增得到相关差异ppr基因的cds序列，使用的引物和pcr程序为：

第一轮pcr引物：

ppr_54448765-1th-f:agatatgggtaagcttccttcttct(如seqidno.3所示)，

ppr_54448765-1th-r:taggcaaattttcaaacaaactcag(如seqidno.4所示)。

dna模板为6001a和7r13基因组dna50ng。第一轮pcr程序：95℃预变性5min；24个循环：95℃变性30s，58℃复性30s，68℃延伸4min；最后68℃延伸10min；15℃保温。

第二轮pcr引物：

ppr_54448765-2th-f:agatatgggtaagcttccttcttct，(如seqidno.3所示，与第一轮正向引物相同)；

ppr_54448765-2th-r:cattaccaccaacaagattctcacc(如seqidno.5所示)。

dna模板为第一轮pcr产物的1000倍稀释液10μl。第二轮pcr程序：95℃预变性5min；34个循环：95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min；15℃保温。以上两轮pcr扩增体系均为20μl，以longtaqdnapolymerase(tiangen)扩增。pcr产物测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成，差异序列用dnaman6.0.3.99进行比对(见图1)，酶切位点用snapgeneviewerversion2.8.3预测(图2)。

6、caps分析

根据对差异位点的酶切位点分析结果，选用限制性内切酶hindiii作后续分析。设计pcr引物用于扩增分子标记：

ppr_caps-f:agggatggtctctgaagctaat(如seqidno.1所示)，

ppr_caps-r:ccttaccaaccatttccgtaac(如seqidno.2所示)。

实施例2分子标记的鉴定

1、第一步，pcr扩增。核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对棉花基因组dna进行扩增；

dna模板为(6001a×7r13)f2群体单株基因组dna50ng(随机抽取21个样本)、以及细胞质雄性不育系6001a，恢复系7r13，细胞质雄性不育系6001a作为母本恢复系7r13作为父本的杂交得到的f1代的单株基因组dna50ng。扩增体系20μl，以easytaqdnapolymerase(transgen)扩增，pcr程序：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min；15℃保温。

2、第二步，配置酶切体系。每个酶切体系包含：4μlpcr产物、1μlhindiii(neb)、1μlcutsmartbuffer(neb)、4μlddh2o，酶切体系充分混匀后放置于37℃恒温箱酶切12h。

3、第三步，凝胶电泳分析。在酶切体系中加入2μl6×loadingbuffer(neb)，离心混匀，在1％琼脂糖中140v/200ma跑20min后分析带型(图3)。根据带型结果得出：

若电泳条带只出现663bp特异性条带，且没有出现785bp特异性条带，则待测样品为不含恢复基因位点的棉花材料；

若电泳条带出现663bp特异性条带的同时，还出现785bp特异性条带，则待测样品为恢复基因位点杂合的棉花材料；

若电泳条带仅有785bp特异性条带，且没有出现663bp特异性条带，则待测样品为恢复基因位点纯合的棉花材料。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agggatggtctctgaagctaat22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccttaccaaccatttccgtaac22

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agatatgggtaagcttccttcttct25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

taggcaaattttcaaacaaactcag25

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cattaccaccaacaagattctcacc25