OX40单克隆抗体及应用的制作方法

本发明涉及单克隆抗体领域，特别涉及ox40单克隆抗体及应用。

背景技术：

ox40(又称cd134)属于肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)，是相对分子质量约50kd的ⅰ型跨膜糖蛋白。ox40是一个相对保守的分子，主要表达在活化的cd4+和cd8+t细胞表面，其配体ox40l在活化的b细胞、树突细胞和内皮细胞上均有表达。在机体的免疫应答过程中，ox40/ox40l作为一对重要的共刺激分子，为t、b细胞的激活提供了重要的共刺激信号，其信号传导也与效应细胞存在和功能相关。由于ox40/ox40l在机体的免疫应答和自身免疫性疾病的发生发展中发挥了重要作用，并随着生物学功能的进一步揭示逐渐成为临床干预自身免疫性疾病、移植排斥反应和肿瘤的一个理想靶点。研制ox40的抗体，能够为进一步研究、揭示ox40/ox40l的生物学功能(如该分子的作用以及相关信号通路)提供基础。

目前，有几个市售的科研用抗人ox40的鼠源单克隆抗体，如invitrogen公司、lifespanbiosciences公司。但是这几个在售的ox40的鼠源单克隆抗体的特异性不够强，亲和力不够高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供ox40单克隆抗体及应用。该单克隆抗体对抗原具有较强的特异性、较高的亲和力。能用于免疫荧光染色、westernblot、elisa和流式细胞等检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了ox40的单克隆抗体，

(i)、其重链的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:5、6和7所示的氨基酸序列；且

(ii)、其轻链的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:8、9和10所示的氨基酸序列；或

(iii)、(i)或(ii)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)或(ii)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(iv)、与(i)、(ii)或(iii)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的单克隆抗体，

(v)、其重链可变区具有如seqidno:2所示的氨基酸序列；且

(vi)、其轻链可变区具有如seqidno:4中任一项所示的氨基酸序列；或

(vii)、(v)或(vi)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(v)或(vi)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(viii)、与(v)、(vi)或(vii)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的单克隆抗体，所述多个为2个、3个、4个或5个。

本发明还提供了编码所述的单克隆抗体的核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的核苷酸，

(ix)、其重链具有seqidno:1所示的核苷酸序列；且

(x)、其轻链具有seqidno:3所示的核苷酸序列；或

(xi)、(ix)或(x)所述的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xii)、与(ix)、(x)或(xi)所述的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xiii)、如(ix)、(x)、(xi)或(xii)所述的核苷酸序列的互补序列。

本发明还提供了一种表达载体，包括编码所述单克隆抗体的核苷酸。

在此基础上，本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。

本发明还提供了所述单克隆抗体的制备方法，包括：培养所述宿主细胞、诱导ox40的单克隆抗体的表达。

此外，本发明还提供了结合物，包含经化学标记或生物标记的所述的单克隆抗体。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述单克隆抗体或所述结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

本发明还提供了所述单克隆抗体或所述结合物或所述偶联物在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用或用于制备免疫荧光染色、westernblot检测、elisa检测、流式细胞检测的产品中的应用。

本发明还提供了药物，包括所述单克隆抗体或所述结合物或所述偶联物以及药学上可接受的辅料。

此外，本发明还提供了试剂盒，包括所述单克隆抗体或所述结合物或所述偶联物以及可接受的助剂。

本发明提供了ox40的单克隆抗体，(i)、其重链的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:5、6和7所示的氨基酸序列；且(ii)、其轻链的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno:8、9和10所示的氨基酸序列；或(iii)、(i)或(ii)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)或(ii)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(iv)、与(i)、(ii)或(iii)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。与现有ox40单克隆抗体相比，本发明公开的单克隆抗体对抗原具有较强的特异性、较高的亲和力。该单克隆抗体能用于免疫荧光染色、westernblot、elisa和流式细胞等检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示ox40蛋白的纯化(m：蛋白分子量标准；1：诱导表达菌破碎上清；2～4：纯化的ox40蛋白)；

图2示ox40抗体效价的测定结果；

图3示免疫荧光检测ox40单抗的特异性(1：空载对照；2：同型抗体对照；3：8f8单克隆抗体细胞株)；

图4示westernblot检测ox40单抗的特异性(1：空载对照；2：8f8株单克隆抗体)；

图5示本发明提供的8f8单克隆抗体亲和力检测图。

具体实施方式

本发明公开了ox40单克隆抗体及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了ox40单克隆抗体的氨基酸序列，可经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得新的氨基酸序列，且具有与本发明提供的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。或者与公开序列至少有80％同源性的氨基酸序列可作为替代方案。

本发明提供了ox40单克隆抗体的核苷酸序列，其互补序列或因遗传密码的简并性而与本发明公开核苷酸序列不同，但编码相同蛋白的序列，或与本发明公开序列至少有80％同源性的序列可作为替代方案。

本发明提供了ox40单克隆抗体的核苷酸序列，经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与本发明公开核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列可作为替代方案。

本发明采用小鼠腹水生产抗体，也可以采用大规模培养分泌抗体的杂交瘤细胞或稳定表达抗体基因的cho细胞或293f细胞进行抗体的生产。

本发明提供了抗人ox40单克隆抗体的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，在此基础上可以产生基因工程抗体，其所含的重链和轻链可变区序列与本发明公开的可变区序列是一致的。该基因工程抗体包括但不限于：抗体的功能性片段fab,或者是单链抗体，或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段vh-l，或者是重链和轻链的一个或多个cdr的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段，或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。

本发明提供的ox40单克隆抗体及应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1ox40单克隆抗体的生产

1.1.pet32a(+)-ox40重组质粒的构建及鉴定

以人全长ox40cdna为模板，上游引物f：catgccatggaactccactgtgtcggggacacc，下游引物r：cccaagcttttagatggcggcaaccgcacg(下划线分别为noci和hindiii酶切位点)，扩增ox40基因。pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，52℃复性35s，72℃延伸50s，29个循环；72℃延伸5min。pcr产物经电泳及胶回收后连接到原核表达载体pet32a(+)上并转化至大肠杆菌bl21(de3)，经noci和hindiii双酶切鉴定的阳性克隆送至invitrogen公司测序。

1.2.ox40蛋白的原核表达、鉴定及纯化

将测序正确的菌株接种于3mllb氨苄培养基，37℃振荡培养至a600＝0.6～0.8，加入至终浓度为1mmol/l的iptg，于37℃诱导表达，4h后分别取菌液1ml离心收集菌体，sds-page电泳分析目的蛋白的表达情况，并用hrp标记的anti-his抗体对其进行westernblot检测。

1.3.ox40蛋白纯化

验证正确的阳性菌扩大培养后，离心收菌体，用pbs重悬后超声破碎，离心后取上清，用0.45μm的滤器过滤，上样于ni-seproase6ff亲和柱，经镍柱亲和纯化后，取少量上清液做12％的sds-page电泳验证蛋白纯化效果。蛋白纯化结果如附图1所示。其余上清液转移至超滤管中于4℃条件下离心，浓缩蛋白，采用bradford法测定蛋白浓度，并于–80℃冰箱中保存。

1.4.ox40免疫小鼠及滴度测定

将纯化的ox40蛋白免疫balb/c小鼠，初次免疫100μg/只，将蛋白与弗氏完全佐剂1:1比例完全乳化后，皮下多点注射。间隔2周后，进行第2次免疫，将蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化后，皮下多点注射，100μg/只。间隔2周后第3次免疫，方法同第2次。第3次免疫后眼眶取血测定抗体滴度。ox40包被elisa板，20ng/孔，4℃包被过夜，5％的脱脂奶粉37℃封闭1h，pbs-t溶液洗涤3次后加入系列稀释的小鼠血清，37℃孵育1h，用pbs-t洗涤3次，加hrp标记的羊抗鼠igg二抗(1:8000)孵育30min。用pbs-t洗涤3次，tmb避光显色10min，2mol/l的硫酸终止反应，酶标仪450nm测定od值。ox40抗体效价的测定的结果，如附图2所示。

1.5.ox40单克隆抗体的制备和纯化

选取滴度高的小鼠，腹腔注射100μg/只加强免疫，3d后取脾脏，采用peg法与sp2/0细胞融合。hat培养基加压筛选并克隆化筛选阳性克隆(8f8)，将杂交瘤细胞(8f8)接种balb/c小鼠，每只小鼠注射1～5×10⁵个细胞(0.5ml)，注射杂交瘤细胞～11天后处死小鼠，获得腹水，制备并纯化抗ox40抗体。3000rpm，4℃离心10min，去除沉淀，用10倍体积1×pbs溶液稀释腹水，混匀后过0.45μm滤膜。通过proteing(proteingsepharose4fastflow,gehealthcare)亲和纯化腹水,得到纯化的ox40抗体蛋白，用bca法测抗体浓度。

实施例2ox40单克隆抗体的特异性和亲和性

2.1.免疫荧光法检测单克隆抗体对膜表面ox40的识别

将培养的293t细胞以1×10⁵个/ml的细胞密度接种到放置预处理的盖玻片的24孔板中，利用脂质体将plvx-ires-zsgreen及plvxires-ox40-zsgreen分别转染到293t细胞中，于co2培养箱中培养48h。用冰冷的pbs洗3次，每次5min。用3.7％的多聚甲醛于室温固定30min，pbs洗3次，每次5min。1％bsa室温封30min后，加入1％bsa稀释的抗ox40单抗，于室温孵育1h，pbs洗3次，每次5min。加入1:400稀释的dylight594标记的羊抗鼠二抗于室温孵育30min，pbs洗3次，每次5min。利用抗淬灭封片剂封片后于荧光显微镜下观察。结果如附图3所示，说明所制备的单克隆抗体特异性较强。

2.2.westernblot测定单克隆抗体对膜表面ox40的识别特异性

利用脂质体将plvx-ires-zsgreen及plvx-ires-ox40-zsgreen分别转染到293t细胞中，于co2培养箱中培养48h后收集细胞。细胞经预冷的ripa抽提后，将获得的膜蛋白进行sds-page电泳，转膜后用5％脱脂奶粉于37℃封闭1h，之后于37℃用制备的单抗进行孵育，hrp标记的羊抗鼠igg抗体作为二抗，孵育8f8株表达的单克隆抗体及羊抗鼠二抗，最后用化学发光法显色。结果如附图4所示，证明所制备的单克隆抗体特异性较强。

2.3.ox40单克隆抗体的亲和力测定

使用10μg/ml制备的ox40蛋白与传感器进行固化结合，使用sdbuffer(pbs+0.02％tween20+0.1％bsa)配制不同浓度的8f8单克隆抗体(566.7nm、283.3nm、141.7nm、70.8nm、35.4nm、17.7nm、8.84nm)作为流动相，使用分子间相互作用仪(octetk2，palllifescience)进行亲和力检测，程序设定为：baseline240s，loading360s，baseline2180s，association480s，dissociation480s，使用ahc(anti-higgfccapture)传感器。结果如附图5所示，所制备的单克隆抗体与ox40的亲和力为3.25e-09(m)。

实施例3ox40单克隆抗体杂交瘤细胞的抗体基因可变区测序

收获处于对数生长期的单克隆抗体8f8杂交瘤细胞，trizol裂解进行rna提取，反转录后获得cdna，扩增并获得重链和轻链可变区，非功能性vk基因去除，克隆至pmd18-t载体，测序，使用imgt/v-quest数据库进行测序结果比对，进一步分析。

重链碱基序列如seqidno.1所示：

重链可变区氨基酸序列如seqidno.2所示：

轻链碱基序列seqidno.3所示：

轻链可变区氨基酸序列seqidno.4所示：

经与imgt/v-quest数据库进行比对，重链：

cdr1-imgt(seqidno.5)：

cdr2-imgt(seqidno.6)：

cdr3-imgt(seqidno.7)：

轻链：

cdr1-imgt(seqidno.8)：

cdr2-imgt(seqidno.9)：

cdr3-imgt(seqidno.10)：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。