一种用于研究UVB照射致早衰的原代黑素细胞培养方法与流程

本发明涉及放射生物学、细胞生物学技术领域，具体涉及一种用于研究uvb照射致早衰的原代黑素细胞培养方法。

背景技术：

uvb照射：根据不同的生物效应，紫外线可按照波长被划分为四个波段，其中波长在290-320nm之间的波段被称为uvb波段，也称中波红斑效应紫外线。uvb具有中等穿透力，虽然大部分会被臭氧层吸收，但长期或者过量的照射可使皮肤变黑，引起红肿、脱皮等症状，对皮肤有一定的致癌性。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，紫外线辐射(波长100-400nm，包括uva、uvb和uvc)被列为一类致癌物。人们日常所使用的防晒霜标识的spf(sunprotectionfactor)值即对于uvb防护的能力，因此应用uvb进行相应的研究有较高的实用性。

黑素细胞：黑素细胞(melanocyte)位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑素单位，其主要功能是产生黑素小体防止皮肤受到损害。这些细胞位于皮肤的基底细胞层，但其分支位于基底细胞层以上的角质化细胞之间。黑素细胞的主要功能是产生黑色素，其对于皮肤的颜色起着十分重要的作用。同时，黑色素可以保护皮肤不受到紫外线辐射的损伤，其在免疫系统中也起到一定的作用。

细胞衰老：细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生物体衰老基本单位。细胞衰老在形态学上表现为细胞结构的退行性变；在生理学上的表现为功能衰退与代谢低下。细胞衰老分为复制衰老和早熟性衰老，前者为正常的生理性衰老；而后者则为病理性衰老(cell,2017,170(4):816-816)。通常情况下，正常的生理性衰老对于机体是有益的，其可促进新陈代谢，减少有害物质的堆积。然而，病理性衰老是与临床上许多疾病的发生、发展相关而与年龄无关的生命体形态结构与生理功能的退变(才真和王春革,2014,医学综述,20(16):2994-2995)，大量研究表明，具有中等波长的紫外线b(ultravioletbuvb)可诱导细胞进入应激性早衰状态(jcosmetsci,2005)，使黑素细胞(melanocytemc)周期滞于g1期，并能诱导p53的表达，促使黑素细胞早衰(cancerres,1995,55(18))。

目前学术界对于uvb照射原代黑素细胞的研究多在于导致其黑色素含量变化及阐明uvb对于黑色素合成相关分子的影响机制，研究uvb照射原代黑素细胞致其早衰有着相当重要的实质性意义，因此，培养具有更高灵敏性的原代黑素细胞具有重要意义。

技术实现要素：

本发明是在普通用途原代黑素细胞培养方法的基础之上加以改进，提供了一种用于研究uvb照射致早衰的原代黑素细胞培养方法，包括如下步骤：

(1)将皮肤样本在乙醇中浸泡，取出后去除样本上残留乙醇；

(2)去除脂肪和皮下组织，将皮肤样本转移到有盖器皿中，加入胰蛋白酶溶液孵育过夜；

(3)孵育后，弃去消化液，用pbs溶液清洗皮肤样本，弃废液；

(4)分离皮肤真皮和表皮，将表皮置于pbs溶液中，室温下孵育30-60min，获得细胞悬液；

(5)将细胞悬液离心后弃去上清液，用pbs溶液洗涤沉淀；

(6)然后用黑素细胞培养基重悬沉淀，获得的重悬液移至培养器皿，置于二氧化碳培养箱中培养48-72h，获得原代黑素细胞；

(7)继续培养并定期更换培养液；

(8)传代后用于实验或冻存。

进一步地限定，步骤(1)中所述皮肤样本为男性包皮样本。

进一步地限定，步骤(1)中所述皮肤样本在70％乙醇溶液中浸泡，时间为10-30min。

进一步地限定，步骤(2)中所述胰蛋白酶溶液浓度为0.25％；所述孵育是指在4℃冰箱中孵育14-20h。

进一步地限定，步骤(2)中所述皮肤样本被切成宽1-2mm的条状。

进一步地限定，步骤(4)中所述分离皮肤真皮和表皮时，在表皮上滴加一滴pbs溶液。

进一步地限定，步骤(4)中所述孵育是指80-150r/min转速下摇动孵育。

进一步地限定，步骤(5)中所述离心的转速为1500r/min，离心的时间为3min。

进一步地限定，步骤(6)中所述黑素细胞培养基为m254培养基,添加1％(终浓度)人黑素细胞生长补充剂和1％(终浓度)双抗，所述双抗为青霉素和链霉素。

本发明所述培养方法获得的黑素细胞可用于中波红斑效应紫外线uvb照射致细胞早衰的研究。

有益效果

本发明可用于研究不同剂量的中波红斑效应紫外线(ultravioletradiationb,uvb)对原代黑素细胞进行照射致其早衰，以扩充放射生物学研究中目前有限的对于uvb照射致原代黑素细胞黑色素合成含量影响的研究。

本发明建立的一种用于研究uvb照射致早衰的原代黑素细胞培养方法，其优点在于，与常规方法相比，培养出的原代黑素细胞更灵敏、更适用于uvb照射致原代黑素细胞早衰的各种研究，同时为培养用于研究uvb照射致早衰的原代黑素细胞的实验方法提供了一定的参考价值，是用于不同剂量uvb照射原代黑素细胞实验研究的更优选择。

附图说明

图1倒置相差显微镜，100倍下观察分离出的黑色素组织；

图2倒置相差显微镜，100倍下观察培养获得的原代黑素细胞；

图3倒置相差显微镜，100倍下观察培养获得的传代黑素细胞；

图4不同剂量uvb照射原代黑素细胞β-半乳糖苷酶染色实验结果，从左至右依次为0、20、50、80、100mj/cm²五个剂量照射所对应的实验结果。

具体实施方式

本发明中所述70％乙醇即指体积分数为70％的乙醇溶液。

pbs溶液：磷酸缓冲液，成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，其中na2hpo4、kh2po4为二级解离，用于缓冲ph范围，nacl和kcl为增加盐离子浓度，配制方法为：

磷酸二氢钾kh2po4：0.27g，磷酸氢二钠na2hpo4：1.42g，氯化钠nacl:8g和氯化钾kcl:0.2g，加去离子水约800ml，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容至1l。高温高压灭菌后，4℃冰箱保存，1×pbs缓冲液是浓度为0.01m，可直接使用(即本发明中所使用的浓度)，2×pbs缓冲液浓度为0.02m。

0.25％胰蛋白酶溶液：向0.5ml的质量分数为2.5％的胰蛋白酶溶液中加入4.5ml的去ca²⁺、mg²⁺的d-hanks液。所述的黑素细胞培养基为m254培养基(购买自gibco)，添加1％(终浓度)人黑素细胞生长补充剂(humanmelanocytegrowthsupplementhmgs)和1％(终浓度)双抗，其中人黑素细胞生长补充剂购买自gibco，货号为m-254-500；1％双抗购买自碧云天，货号为c0222，其中双抗为青霉素和链霉素。

其他试剂或药品等如无特殊说明均可通过商业化途径购买获得。

实施例1.用于研究不同剂量的中波红斑效应紫外线uvb照射致早衰的原代黑素细胞培养方法。

(1)将皮肤样本在乙醇中浸泡，取出后去除样本上残留乙醇；具体为：成年健康男性包皮样本2个，取自北京某医院泌尿外科。将包皮样本在70％乙醇中分别浸泡20min，取出后用pbs溶液清洗样本，去除样本上残留的乙醇。

(2)尽可能多地剪掉脂肪和皮下组织，将皮肤样本切成宽1-2mm的条状，将条状碎片转移到离心管中，加入0.25％胰蛋白酶溶液，使皮肤样品完全浸泡在酶液中，盖好管口，于4℃冰箱中孵育18小时。

(3)孵育后，弃去表皮消化液(即0.25％胰蛋白酶溶液)，用pbs液清洗皮肤样本，弃废液。

(4)用刀片分离真皮和表皮，弃去真皮，在表皮上滴一滴pbs液以防止分离的表皮在空气中变得过于干燥；将表皮转移到含有pbs溶液的离心管中，使表皮完全浸泡在pbs溶液中，于室温下80-150r/min转速下，旋转摇动孵育60min，获得细胞悬液，其中含有部分黑色素组织，见图1。

(5)室温下，将细胞悬液离心3min，转速为1500r/min，弃去上清，用pbs溶液洗涤沉淀，洗涤后弃去上清液，保留沉淀，重复上述离心及洗涤操作3遍。

(6)然后，用黑素细胞培养基重悬沉淀，所述黑素细胞培养基为m254培养基，添加1％(终浓度)人黑素细胞生长补充剂(humanmelanocytegrowthsupplement,hmgs)和1％(终浓度)双抗，获得的重悬液移至培养瓶，置于二氧化碳培养箱中在37℃，5％co2的条件下培养48h，即获得原代黑素细胞，如图2所示。

(7)离心更换培养液，一周进行两次，继续培养7天。

(8)越来越多的黑素细胞贴壁生长，生长周期较长，大概15天左右小块组织能够全部分散贴壁生长；培养瓶长满后，进行传代并冻存；图3所示为第二代细胞，重复实验步骤提取大量黑素细胞冻存，以备实验使用。

实施例2.用于研究不同剂量的中波红斑效应紫外线uvb照射致早衰的原代黑素细胞培养方法。

重复实施例1，与实施例1的不同在于，步骤1)所述皮肤样本为婴儿或幼儿包皮样本。

实施例3.用于研究不同剂量的中波红斑效应紫外线uvb照射致早衰的原代黑素细胞培养方法。

重复实施例1，与实施例1的不同在于，步骤6)所述的用黑素细胞培养基m254培养基重悬沉淀，获得的重悬液移至培养瓶，置于二氧化碳培养箱中在37℃，5％co2的条件下培养72h，即获得原代黑素细胞。

以实施例1培养方法为例，本发明分别利用0、20、50、80、100mj/cm²剂量的uvb照射培养出的原代黑素细胞72h，β-半乳糖苷酶染色实验结果具有统计学意义，如图4所示，随着剂量的增大，衰老细胞的数量有显著增加，由此可见，上述方法培养获得的细胞可用于不同剂量uvb照射原代黑素细胞的实验研究。