一种鸡生长性状基因诊断试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种鸡生长性状基因诊断试剂盒及其应用，属于生物育种
技术领域：
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背景技术：
：畜禽遗传资源是保护生物多样性、培育新品种、实现畜牧业可持续发展战略的重要生物资源。我国有丰富的地方鸡品种资源，如何对其评估、保护和选育是迫切需要解决的问题。目前，随着人们对畜禽生长环境的重视和饲料品质要求的提高，畜禽的生产性能得到了很大的提升，畜禽的肉质满足了人类稳定蛋白摄入的需要，成为了人类生活所必需的物质基础。但是，对家禽的不利选育又会导致某些优势基因型的丢失，因此借助现代分子标记在种质特性不改变的情况下提高地方畜禽品种的经济性状，从而进一步对畜禽遗传资源进行保护开发利用就显得尤为重要。分子标记辅助育种是一种利用dna水平上的分子标记对生物群体进行遗传改良的技术，也就是将分子生物学技术应用于育种中，在分子水平上进行育种；其中插入/缺失(insertion-deletion,indel)是指在近缘物种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基。相比于其他分子标记技术，indel标记具有稳定性好、多态性高、分型系统简单的优点，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种、医学诊断等研究领域，有利于优良基因的进一步开发和利用。就在基因组dna中的分布密度而言，indel仅次于snp，但远高于ssr。indel大致可分为以下5大类：1)单碱基对的插入/缺失；2)单一碱基的插入/缺失；3)重复单元为2-15个碱基的多碱基对插入/缺失；4)转座子插入/缺失；5)任意dna序列的插入/缺失。在基因组dna中，虽然indel的分布频率很高，但其分布区域并不是均匀的，在不同的染色体上有着不同的分布密度。公布号为cn108531615a的中国发明专利申请中公开了一种鸡hs6st3基因43bpindel多态性标记及其应用、检测引物、试剂盒，其中已经发现鸡hs6st3基因第1内含子区域43bp插入/缺失多态与鸡的多个经济性状显著相关，可用于鸡的辅助选择和分子育种。但是对于长链非编码rna中indel多态性标记的研究仍较少。技术实现要素：本发明的目的是提供一种鸡生长性状基因诊断引物，该引物的扩增片段覆盖了鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失多态性标记，可以根据扩增结果从基因多态性上分析鸡群生长状况。本发明还提供了鸡生长性状基因诊断试剂盒，使用该试剂盒可以从基因多态性上分析鸡群生长状况。本发明还提供了检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法，使用该方法可以检测出待测鸡lncfam基因内含子区indel多态性状况，根据多态性状况可以进一步确定待测鸡的基因型。本发明还提供了上述的检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法在预测鸡群生长状况方面的应用，根据鸡lncfam基因内含子区基因型可以确定鸡群的生长状况。本发明还提供了上述的检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法在鸡的辅助选择和分子育种方面的应用，可以筛选出生长状况较好的鸡个体用于分子育种。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种鸡生长性状基因诊断引物，所述引物的扩增片段覆盖鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段区域，所述鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段的核苷酸序列如seqidno.6所示。本发明中通过研究发现鸡lncfam基因第二内含子区indel多态性标记与鸡生长性状的差异有关，具体的是：lncfam基因第二内含子区97bp的插入与鸡出生重、2、6、8周体重，1天的胫长，4、8、12周胫围，8、12周胫宽以及4、12周骨盆宽等性状显著相关(p<0.05)，其中，与鸡出生重、6周体重、4周胫围、8周胫围、12周胫围、8周胸宽、4周骨盆宽等性状呈极显著相关(p<0.01)。根据该indel多态性标记设计相应的鸡生长性状基因诊断引物，可以检测并筛选出97bp的纯合插入的鸡个体，因此该引物可以用于鸡的辅助选择和分子育种。优选的，所述引物序列如下所示：p-f：5′-tctccacccatttttatgctgc-3′；p-r：5′-tgttgccagaaatatgcttgct-3′。该引物的扩增片段覆盖了鸡lncfam基因第二内含子区5′端起的第461-557位。如为97bp插入基因型，则pcr扩增的片段大小为303bp，如为97bp缺失基因型，则pcr扩增的片段大小为206bp。一种鸡生长性状基因诊断试剂盒，所述试剂盒中包含检测鸡lncfam基因内含子区indel多态性的引物，所述引物的扩增片段覆盖鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段区域，所述鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段的核苷酸序列如seqidno.6所示。本发明中的试剂盒中包含检测鸡lncfam基因内含子区indel多态性的引物，该引物可以检测并筛选出97bp的纯合插入的鸡个体，因此该试剂盒可以用于鸡的辅助选择和分子育种。所述引物序列如下所示：p-f：5′-tctccacccatttttatgctgc-3′；p-r：5′-tgttgccagaaatatgcttgct-3′。该引物的扩增片段覆盖了鸡lncfam基因第二内含子区5′端起的第461-557位。如为97bp插入基因型，则pcr扩增的片段大小为303bp，如为97bp缺失基因型，则pcr扩增的片段大小为206bp。所述试剂盒中还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和dnamarker中的一种或几种。试剂盒中的这些试剂为pcr扩增过程中常用的试剂。检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法，包括以下步骤：1)根据鸡lncfam基因第二内含子中97bp插入/缺失位点的前后序列设计引物，所述引物的扩增片段覆盖鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段区域，所述鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段的核苷酸序列如seqidno.6所示；提取待测鸡的基因组dna，利用设计的引物进行pcr扩增；2)根据扩增结果判定待测鸡的基因型。本发明建立的检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法大大提高了基因型的判定效率和准确性，而且方法简便，分型时间短，不需要测序和限制性内切酶，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。该方法可以快速判定出不同体重性状的基因型，从而缩短育种时间，加快育种进程。利用本发明的方法检测出了鸡lncfam基因第二内含子区indel多态性标记在地方鸡、高产蛋鸡及商品肉鸡中的分布，分析了indel多态性标记在不同品种鸡中基因型的分布及等位基因频率。所述基因型为纯合插入型ii、纯合缺失型dd或杂合型id，其中i等位基因表现为97bp插入，d等位基因表现为97bp缺失突变。若pcr扩增片段中都包含这97bp片段，则该待测鸡为ii基因型，个体为纯合体；若扩增片段都不包含这97bp片段，则该待测鸡为dd基因型，个体为纯合体；若扩增片段中有的包含这97bp片段，有的不包含，则该待测鸡为id基因型，个体为杂合体。检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法在预测鸡群生长状况方面的应用，还包括以下步骤：3)根据基因型判定结果预测鸡群的生长状况。本发明中通过研究发现ii基因型个体的生长性状关联分析数值最大，dd基因型个体的关联分析数值则最小，而id基因型个体的关联分析数值居中；ii基因型个体生长状况最好，id基因型个体次之，dd基因型个体最次，根据鸡群中ii、id、dd基因型个体的数目，预测鸡群的生长状况。检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法在鸡的辅助选择和分子育种方面的应用，还包括以下步骤：3)根据基因型判定结果筛选出纯合插入型ii个体，进行分子育种。本发明中通过研究发现ii基因型个体的生长性状关联分析数值最大，dd基因型个体的关联分析数值则最小，而id基因型个体的关联分析数值居中，因此可以通过加强对ii基因型个体的选育，来提高鸡的经济性能。附图说明图1为本发明中实验例1中研究过程的技术流程图；图2为本发明中实验例1中检测的部分鸡个体lncfam基因第二内含子中97bp插入/缺失基因型检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及实验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。鸡生长性状基因诊断引物的实施例1本实施例中鸡生长性状基因诊断引物的扩增片段覆盖鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段区域；具体的该引物根据ncbi公布的lncfam基因序列(genbankaccessionnc_006088)设计引物，设计得到的引物的扩增片段为鸡lncfam基因第二内含子区(lncfam基因第二内含子区序列如seqidno.1所示)第461-557位，引物序列如下所示：p-f：5′-tctccacccatttttatgctgc-3′(如seqidno.2所示)；p-r：5′-tgttgccagaaatatgcttgct-3′(如seqidno.3所示)。上述引物扩增出的片段大小为303bp(如seqidno.4所示)或者206bp(如seqidno.5所示)，303bp为i等位基因，206bp为d等位基因。i等位基因中有97bp的插入，插入的片段核苷酸序列如seqidno.6所示。鸡生长性状基因诊断试剂盒的实施例1本实施例中鸡生长性状基因诊断试剂盒包含检测鸡lncfam基因内含子区indel多态性的引物，还包括dntps、灭菌超纯水、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和dnamarker。所述引物序列如下所示：p-f：5′-tctccacccatttttatgctgc-3′；p-r：5′-tgttgccagaaatatgcttgct-3′。检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法的实施例1本实施例中检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法，包括以下步骤：1)根据鸡lncfam基因第二内含子中97bp插入/缺失位点的前后序列设计引物，所述引物的扩增片段覆盖鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段区域，所述鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段的核苷酸序列如seqidno.6所示；提取待测鸡的基因组dna，利用设计的引物进行pcr扩增；2)根据扩增结果判定待测鸡的基因型。所述基因型为纯合插入型ii、纯合缺失型dd或杂合型id，其中i等位基因表现为97bp插入，d等位基因表现为97bp缺失突变。步骤1)中所述的提取待测鸡的基因组dna采用的方法为苯酚-氯仿粗提法。步骤1)所述的pcr扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。步骤1)中所述的pcr扩增的反应体系为2×taqpcrmastermix3.0μl、引物p-f(10pmol/l)0.5μl、引物p-r(10pmol/l)0.5μl、待测鸡的基因组dna(50ng/μl)1.0μl、灭菌超纯水5.0μl。检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法的在预测鸡群生长状况方面的应用的实施例1本实施例中检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法的在预测鸡群生长状况方面的应用包括以下步骤：1)根据鸡lncfam基因第二内含子中97bp插入/缺失位点的前后序列设计引物，所述引物的扩增片段覆盖鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段区域，所述鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段的核苷酸序列如seqidno.6所示；提取待测鸡的基因组dna，利用设计的引物进行pcr扩增；2)根据扩增结果判定待测鸡的基因型；3)根据基因型判定结果预测鸡群的生长状况。ii基因型个体的生长性状关联分析数值最大，dd基因型个体的关联分析数值则最小，而id基因型个体的关联分析数值居中；ii基因型个体生长状况最好，id基因型个体次之，dd基因型个体最次，根据鸡群中ii、id、dd基因型个体的数目，预测鸡群的生长状况。所述的鸡群生长状况指鸡体重、胫长、胫围、胸宽、体斜长、骨盆宽中的至少一种。优选的，所述的鸡群生长状况指鸡出生、2、6、8周体重，1天胫长，4、8、12周胫围，8、12周胫宽以及4、12周骨盆宽。检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法在鸡的辅助选择和分子育种方面的应用的实施例1本实施例中检测鸡lncfam基因内含子区基因型的方法在鸡的辅助选择和分子育种方面的应用包括以下步骤：1)根据鸡lncfam基因第二内含子中97bp插入/缺失位点的前后序列设计引物，所述引物的扩增片段覆盖鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段区域，所述鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失片段的核苷酸序列如seqidno.6所示；提取待测鸡的基因组dna，利用设计的引物进行pcr扩增；2)根据扩增结果判定待测鸡的基因型；3)根据基因型判定结果筛选出纯合插入型ii个体，进行分子育种。实验例1本实验例中研究了鸡lncfam基因第二内含子中97bp的插入或缺失与鸡生长状况的相关性，对于优势基因型进行了明确，选择这些优势基因型个体进行育种，整体的技术流程图如图1所示，研究中pcr反应所用的引物为鸡生长性状基因诊断引物的实施例1中的引物，研究过程包括如下步骤：(1)样品的采集采集河南农业大学种鸡场f2代资源群(固始鸡×安卡)800只、淅川乌骨鸡266只、卢氏鸡143只、东乡鸡129只、长顺鸡92只、固始鸡143只、海兰褐壳蛋鸡222只、罗曼褐壳蛋鸡60只、哈伯德肉鸡459只、罗斯308172只(308指罗斯308鸡品种艾拔益加肉鸡)和aa肉鸡300只(aa肉鸡指艾拔益加鸡品种)。翅静脉采血，加1/3抗凝剂，采用苯酚-氯仿粗提法提取基因组dna，保存于4℃冰箱备用。(2)pcr扩增pcr反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的pcr反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分别分装到0.2mleppendorfpcr管中，然后分别加入模板dna，再瞬时离心后进行pcr扩增；pcr反应体系见表1，其中，2×taqpcrmastermix购自北京康为公司。pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。表1pcr反应体系灭菌超纯水(h2o)5.0μl2×taqpcrmastermix3.0μl引物p-f(10pmol/l)0.5μl引物p-r(10pmol/l)0.5μl待检测鸡的dna(50ng/μl)1.0μl总体积10.0μl(3)pcr扩增产物的检测及基因型的判定取7μlpcr扩增产物，2％的琼脂糖凝胶电泳(电泳电压：120v；电泳时间：30min)点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱结果如图2所示，自左至右泳道分别代表dnamarker:dl2000、id、ii、ii、ii、dd、id、id基因型的电泳带型。基因型的判定方法如下：若pcr扩增产物仅有303bp的片段，则该待测鸡为ii基因型，个体为纯合体；若扩增片段大小仅为206bp，则该待测鸡为dd基因型，个体为纯合体；若扩增片段大小为303bp和206bp，则该待测鸡为id基因型，个体为杂合体。对f2分离群体、5个地方品种(淅川鸡、卢氏鸡、东乡鸡、长顺鸡和固始鸡)、高产型蛋鸡(海兰褐蛋鸡、罗曼褐壳蛋鸡)和快大型肉鸡(哈伯德肉鸡、罗斯308和aa肉鸡)的基因型分型结果如表2所示。表2不同群体基因型检测结果统计表(4)f2资源群体生长性状与lncfam基因第二内含子区基因型的关系分析对于检测的800个个体f2资源群体中具有完整经济性状记录，可用于该多态位点的关联分析。经济性状测定方法参考文献(hanrl，lizj，limj.novel9-bpindelinvisfatingeneanditsassociationswithchickengrowth.brpoultsci，2011，52(1):52-57.)。其中测定的生长性状指标，对800只f2资源群体生长性状的统计分析如表3所示。表3lncfam基因第二内含子区基因型与f2资源群体生长性状的关联分析结果注：a,b同一行上标不同者表明达到了显著水平(p<0.05)。表3中的关联分析结果显示：在lncfam基因第二内含子区插入一段97bp的序列，即lncfam基因的indel突变多态性与出生重、2、6、8周体重，1天的胫长，4、8、12周胫围，8、12周胫宽以及4、12周骨盆宽等显著相关(p<0.05)，其中，与出生重、6周体重、4周胫围、8周胫围、12周胫围、8周胸宽、4周骨盆宽呈极显著相关(p<0.01)。且整体上ii基因型个体的生长性状关联分析数值最大，dd基因型个体的关联分析数值则最小，说明该基因第二内含子中97bp缺失不利于鸡的生长发育。在此基础上对待测个体进行育种，筛选出优良品种。具体是，加强对ii基因型个体的选育，来提高鸡的经济性能；淘汰id、dd基因型个体。当然，如要培育纯合中国地方鸡种，选留ii基因型个体，如要培育杂合中国地方鸡种，也可以选留id基因型个体。<110>河南农业大学<120>一种鸡生长性状基因诊断试剂盒及其应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<211>5667<212>dna<213>鸡<221>lncfam基因第二内含子区序列<400>1gtgggctccttcccagctgttctgtgtgccttggatacctcatttcatgacccatttcaa60gggcagtttataaatgtttatgtgtcctcagcagcttttgcacataagggtttttagcag120taatttgtaacatttagtaaatatgtcatatctccacacatgatccaaccagagcttaga180caagccgatgagtaatcattgttgtctgaaaacattttttccttcctctgtgatgcataa240agaattcataagatcatagagaaaaagttgagttacagtcctgagatttatggtgagttg300ttcaatttcacagtgaagcaacgttatcccataaacacttcacttcatcaactgcttggt360tgaattattgttgccagaaatatgcttgctaattactgtcttttctactgattctgatgt420tgctggattcattttaacagtatgcagtatctgtgttttgttaaaatagtagttatccta480cattaactgtgggttaactgcttacaatgcattctaagagtgtaattttttctaacaaaa540acaatgcagtttgcagcataaaaatgggtggagataaattgaaacagacaaattgaaact600agaagattataacaaaggcaaagttagaccctcaaaaagtgtttttgaaaacacatcttg660ttgctatataaatctaggcagatatcattttaaaatacatcttctagcactgatgagaaa720tgtctgaatttgcctttgctggttacccttcttatctgcaaccatcacacctgcagcttg780ttatctattgcagggtaaagtagttatttagttatataacagtctttgccttctctgtga840attggcagctttgtcaaggaactctctaactcatcacagacagaatcccaagtgtaaatt900aacatctctgccatgtagacgataaaatggtgacggaaaaggggcaaagaaatctgaaag960tgtagatgtgctttctgtgacaattctgaacaattgattgttaatcaaattccagctgaa1020cagggataatttaaggctatctatccttccagagatgcatttctgtaaagctaggttatt1080ttcaactctgaaatctcagatcagatgtatatgtatgaaagtctcatctaagtttctatt1140ctacagcttgatatagacttcctactaaatgtctatagctgacggccacaaataacttga1200ggtaataatgatgatgataataataataataaattcatctgtgatttatccataaatatt1260gcacacgtatacaaaaatgacatatgtaatatgttaacctggatctcagcttaaactatc1320ttcagactcagggtttccgagttttggttaatgggcaaattttataaaaattacataaga1380ttataccagtgaaccctgaaggtactgtttctttcaattcaatgacatgcagaataaatt1440atatatattttcatcccacgtttccaatacagggtctaatgacttatatcttgatggact1500tatggacaatgcacattgaattaaaagcctcaatttatagtaagaagatataataagatg1560tcctctaactgtaaccttttattaagagacattaaggctcctttaataaccatcttgtcg1620attgtgattttcatcagttgacagtctcctctcatacaccattccacatgtacctagtgg1680ttctgacagttattcagatgggaagggtggggttagaatttgtcttaggaagaaaatgaa1740tactttgcactggaaatagagtaatgcaatattatcaatgatgtgtagactagagttcag1800ttagcatataaatcaactacattcttaaagctccgttctcaaataaacaaaatcttggta1860ttttttatactttgacacaacaaaaataacttattatattacaaaaataatttatcatta1920atgaatcatcttcttttgacagaaaattggcaaatgttagattacacaatgtacttaaca1980aagctgtgtacagtctccagagaatagaaacaatattgcatataaaatcatctaataaaa2040aataataatctcagctattaattgtaaattatggtgtgggatgattaaaaacaaatgggg2100ttggaggagttgttcaagatggagacatcaagtctgtttgaaatctgtactgttaactat2160gtttgtcagaaatgcattacgtcttcaacataagattgagtacttagctcaaattgtact2220gaatatttatactaaaatgttttgttaactatttaaacctaaaaagtcatgcaagtgcta2280caataactttatctcatgcttcctcccaatattccatgtagtgactatatcctggatcag2340tacattttactgtatttcatattgaatgtttcctttatcaaaaaatccaaaagtgcattt2400attcctaggacgagtccaatgtagggtgacaaagatgatgaggggcttggagcatgtcgc2460ttatgaaaaaagtttaaagacctgagtctgttcagtctggagaagagaaggctgagaggg2520gatctcatcactgtttataaacatgtaaaatgagggagccaagtcgatggggacagactc2580tttttggttggatgtagcaatagaacagggagcaatgggcagaaactgga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