本发明属于动物生物制品
技术领域：
，具体涉及一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂及制备。
背景技术：
：中华蜜蜂作为一种宝贵的资源对蜂蜜生产和全球粮食生产做出了巨大的贡献，在一定程度上促进了全球经济的发展。蜜蜂在维系动植物生态平衡等方面也起着极为重要的作用。由于中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(chinesesacbroodbeevirus，csbv)主要感染1～3日龄幼虫，致使幼虫的感染率和死亡率极高，最终造成蜂群的大面积死亡，给蜜蜂产业带来了巨大的经济损失。csbv是传染性软腐病病毒科属，其直径为26～30nm，是一种二十面体、无包膜、正链rna病毒颗粒。感染csbv幼虫的颜色从乳白色变为淡黄色，死亡后不久逐渐变得干枯，变为了暗褐色。csbv最早于1972年发现于广东，2008年在辽宁重新出现，大面积感染蜂群后，造成了农业和自然生态系统的毁灭性的打击。目前，已经利用多种方法尝试性的进行了该疾病的控制。如喂食异源性蜂王浆、dsrna和重组表达的病毒结构蛋白等。上述多种方法由于存在这样或那样的不足，使得上述方法在实际应用中得到了限制。为了克服上述方法存在的不足之处，利用卵黄抗体进行病毒性疾病的预防和治疗是较为常用的方法之一，且效果好，制备简单。为此，本发明基于此背景条件下，成功制备了抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，供预防和治疗中华蜜蜂抗csbv感染应用。技术实现要素：为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法。本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂。本发明的再一目的在于提供上述抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，包含如下步骤：(1)将壳聚糖(cs)溶解在质量分数为0.5～2％的乙酸溶液中，得到质量分数为2.5～10％的壳聚糖溶液；(2)在20～40℃下，将0.25～1.25mg/ml的氧化石墨烯(go)悬浊液首次超声处理，使体系分散均匀；然后将其与等体积的步骤(1)制得的壳聚糖溶液混合后再次超声处理，使体系分散均匀；随后20～40℃搅拌0.5～3.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖(go/cs)佐剂；(3)在步骤(2)制得的氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中逐滴缓慢加入中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液，充分混合均匀，然后20～40℃搅拌0.5～2.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗；(4)将步骤(3)制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为免疫抗原免疫蛋鸡，收集免疫蛋鸡产下的鸡蛋，分离蛋清与蛋黄，提取卵黄抗体，纯化，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体；(5)将藻类提取液与步骤(4)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的0.1～10％；步骤(2)中所述的首次超声处理的条件优选为200w，40khz超声处理5～15min，使体系分散均匀，分散度好；步骤(2)中所述的再次超声处理的条件优选为200w，40khz超声处理5～20min，使体系分散均匀，分散度好；步骤(3)中所述的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗中病毒粒子的浓度优选为0.20～5mg/ml；步骤(3)中所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子优选为如下毒株病毒粒子的至少两种：江西株、北京株、陕西株(例如：csbv-sxyl株)、辽宁株(例如：csbv-ln/2009)、福建株、河南株、云南株、四川株等；步骤(3)中所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子溶液的制备方法，包含如下步骤：①中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的人工繁殖：将不同中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株分别感染蜜蜂幼虫，然后将感染后的幼虫等质量混合；取5～15g感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫匀浆均质化，离心，收集含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液去感染80～480只健康蜜蜂幼虫，收集感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫；②中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的纯化：将步骤①收集到的感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫匀浆均质化，离心，收集含有病毒的上清液；用0.2mpbs缓冲液将沉淀重悬，再次匀浆后离心，收集含有病毒的上清液，合并两次收集到的含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液与等体积的氯仿混合，再次匀浆均质化，然后进行差速离心，弃沉淀取上清液；将上清液进行超速离心，弃上清液取沉淀，得到病毒粒子；病毒粒子用pbs缓冲液稀释，得到中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液；所述的匀浆优选采用玻璃匀浆器进行匀浆，至完全均质化；所述的匀浆的条件优选为在冰浴上匀浆5～30min；所述的差速离心的条件优选为：1000rpm离心10min，5000rpm离心30min，15000rpm离心30min；所述的超速离心的条件优选为35000rpm离心60min；步骤(4)中所述的蛋鸡优选采用2个月开产日龄的蛋鸡；步骤(4)中所述的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为抗原免疫蛋鸡的具体步骤优选为：将氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为抗原，采用皮下多点注射结合肌肉注射方式对蛋鸡进行注射；初次免疫后，每隔10天加强免疫一次，进行多次免疫；所述的皮下多点注射的部位优选为颈部、双翅根部、背部和胸大肌部位等处；所述的肌肉注射的部位优选为鸡一侧大腿外侧肌肉最为丰富处；所述的注射的用量优选为1ml/鸡，0.2ml/位点，初次免疫剂量和后续加强免疫剂量相同；所述的多次免疫优选为免疫至抗体效价达到25以上；步骤(4)中所述的提取鸡蛋中的卵黄抗体、纯化的具体操作优选为：将蛋黄从蛋清中分离出来，将pbs缓冲液与蛋黄按(2～10):1的体积比混合，搅拌均匀后加入peg6000试剂，使其最终浓度为2.0～5.5wt％；将该混合物在20～40℃下搅拌20～60min，2000～8000rpm离心10～60min，收集上清液，得到卵黄抗体；步骤(5)中所述的藻类优选为盐藻、小球藻、螺旋藻和雨声红球藻中的至少一种；步骤(5)中所述的藻类提取液的制备方法优选为：在藻类中加入淡水调整细胞湿重为200g/l，然后在80～120mpa的高压条件下破碎藻类细胞，低速离心，收集上清，得到藻类提取液；一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，通过上述制备方法制备得到；所述的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂在制备预防和治疗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒感染产品中的应用；本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明进行了三种免疫佐剂的效果比较，同时进行了不同免疫间隔时间和次数的比较，结果显示在三种免疫佐剂中，利用氧化石墨烯/壳聚糖(go/cs)佐剂在免疫间隔10天时，抗体效价最高，成功建立起来了一种高效制备抗csbv感染卵黄抗体的蛋鸡免疫程序。(2)本发明采用不同地区来源的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株制备氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗并作为免疫抗原免疫蛋鸡，制得的卵黄抗体克服了地域性差异带来的抗体效果差、持续时间短等问题。(3)本发明在制得的卵黄抗体中添加了藻类提取液，不仅提高了蜜蜂幼虫的生长发育速度和抗病能力，而且提高了蜜蜂对卵黄抗体应用时的适口性，缩短了用药时间。而且藻类提取液的添加，也提高了对该卵黄抗体的稳定性和储藏期，利于产品的运输和推广。(4)本发明制得了高抗体滴度的卵黄抗体复合制剂，通过该抗体的分析检测，其生物效价高、特异性强、作用迅速、且持续作用长。(5)本发明通过多次实际生产养殖中的试验，发现该卵黄抗体在蜜蜂抗csbv感染中，其预防性和治疗性保护效果均达到了100％，保护效果十分显著。(6)本发明所制备的卵黄抗体复合制剂对蜜蜂抗感染的保护时间能够持续4个月以上，且其制备过程操作简单、成本少、便于大规模工厂化制备。附图说明图1是本发明差速离心提纯的csbv粒子的电镜图。图2是本发明制得的卵黄和卵黄抗体的实物图；其中，a：未分离前的卵黄；b，分离后的卵黄抗体。图3是实施例1制得的复合制剂在预防蜜蜂抗csbv感染的实验结果图；其中，a：第4天幼虫；b：攻毒后第3天；c：第一次用药(第9天观察)；d：第2次用药(第11天观察)；e：第3次用药(13天观察)；f：第15天观察结果。图4是实施例1制得的复合制剂在治疗蜜蜂抗csbv感染的实验结果图；其中，a：第一次用药(第3天，第四天观察)；b：第2次用药(第五天，第六天观察)；c：从7天攻毒一次，在第9天观察；d：为12天以后观察结果。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株江西株已在参考文献(李游，曾志将，吴小波，etal.中华蜜蜂囊状幼虫病病毒江西株衣壳蛋白vp1基因的克隆及序列分析[j].黑龙江畜牧兽医，2015(7)：175-178)中公开；中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株北京株(csbv-bj/2010)已在参考文献(徐书法，周婷，胡颖颖，etal.中华蜜蜂囊状幼虫病病毒csbv-bj/2010基因克隆及序列分析[j].上海交通大学学报(农业科学版)，2011，29(5)：44-48)中公开；中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株陕西株(csbv-sxyl株)已在参考文献(李慧.中华蜜蜂囊状幼虫病毒生物学特性分析及其在幼虫原代细胞中复制研究[d].2010)中公开；中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株辽宁株(lnqy-2008株)已在参考文献(胡影.中蜂囊状幼虫病毒基因分型及其代表毒株生物学特性比较[d].锦州医科大学，2017.)中公开；中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株福建株已在参考文献(夏晓翠,周冰峰,魏太云.中华蜜蜂囊状幼虫病病毒非结构蛋白抗体的制备及其应用[j].福建农林大学学报(自然科学版)，2014，43(5)：499-503)中公开；实施例1(1)csbv的人工繁殖与纯化①csbv的人工繁殖：将江西株、北京株、陕西株、辽宁株和福建株五株中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株分别感染蜜蜂幼虫，将感染后的幼虫等质量混合；然后取5g感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫，用玻璃匀浆器将其匀浆至完全均质化，离心，然后收集含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液去感染1批健康蜜蜂幼虫(80只2日龄幼虫)，收集患病幼虫；②csbv的纯化：将步骤①收集到的感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫在冰浴上匀浆30min至完全均质化，离心，然后收集含有病毒的上清液；用0.2mpbs缓冲液将沉淀重悬，再次冰浴上匀浆30min后离心，收集含有病毒的上清液，合并两次收集到的含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液与等体积的氯仿混合，在冰浴上匀浆30min以便更好的抽提纯化病毒，采用以下参数进行差速离心，1000rpm×10min，5000rpm×30min，15000rpm×30min离心后，弃沉淀取上清液；将上清液35000rpm超速离心60min，弃上清液取沉淀，然后在沉淀中加入pbs缓冲液稀释至病毒蛋白浓度为2mg/ml，得到中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液(图1)，取5μl该溶液进行电镜观察结果见图1；(2)将壳聚糖(cs)溶解在质量分数为1％的乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液，其中，壳聚糖的质量分数为5％；(3)在25℃下，将浓度为0.5mg/ml的go悬浊液超声处理(200w，40khz)10min，使氧化石墨烯分散均匀；将其与等体积的步骤(1)制得的壳聚糖/乙酸溶液混合后超声处理(200w，40khz)20min，使两者充分混匀；然后25℃搅拌2h，得到氧化石墨烯/壳聚糖(go/cs)佐剂；(4)在步骤(3)制得的氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中逐滴缓慢加入步骤(1)制得的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液，充分混合均匀，然后25℃搅拌30min，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗，其中，病毒蛋白的终浓度为0.25mg/ml；(5)蛋鸡的免疫和鸡蛋的收集：将步骤(4)制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为抗原，分别在2个月开产日龄的蛋鸡颈部、双翅根部、背部和胸大肌部位进行皮下注射，同时在鸡一侧大腿外侧肌肉最为丰富处进行肌肉注射，其中，为了比较免疫间隔时间对免疫效果的影响，初次免疫后，本实施例加强免疫间隔时间分为4组，分别为间隔7天、10天、14天、19天，另，采用注射pbs缓冲液的10只母鸡作为阴性对照，注射的用量为1ml/鸡，0.2ml/位点，初次免疫剂量和后续加强免疫剂量相同，加强免疫共计3次；(6)卵黄抗体的分离和纯化：用蛋清分离器将蛋黄从蛋白中分离出来，将pbs缓冲液与蛋黄按2:1的体积比混合，搅拌均匀后加入peg6000试剂，使其最终浓度为2.0wt％；将该混合物在25℃下搅拌30min，4000rpm离心30min，收集上清液，得到卵黄抗体(图2)，储存在4℃备用。(7)将盐藻接种至天然海水养殖池中培养生长至稳定期(盐藻细胞呈现鲜亮的黄褐色)，然后逐级过滤去除杂质和其它生物，再利用自然沉淀法沉淀盐藻，淡水洗涤两次，离心收集盐藻；向收集的盐藻中加入淡水调整细胞湿重为200g/l，然后在800mpa的高压条件下高压破碎法破碎盐藻细胞，低速离心，收集上清，得到盐藻提取液；(8)将步骤(7)制得的盐藻提取液与步骤(6)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的0.1％。实施例2(1)csbv的人工繁殖与纯化①csbv的人工繁殖：将江西株、北京株、陕西株、辽宁株和福建株五株中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株分别感染蜜蜂幼虫，将感染后的幼虫等质量混合；然后取10g感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫，用玻璃匀浆器将其匀浆至完全均质化，离心，然后收集含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液去感染3批(240只2日龄幼虫)健康蜜蜂幼虫，收集患病幼虫；②csbv的纯化：将步骤①收集到的感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫在冰浴上匀浆5min至完全均质化，离心，然后收集含有病毒的上清液；用0.2mpbs缓冲液将沉淀重悬，再次在冰浴上匀浆15min后离心，收集含有病毒的上清液，合并两次收集到的含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液与等体积的氯仿混合，在冰浴上匀浆5min以便更好的抽提纯化病毒，采用以下参数进行差速离心，1000rpm×10min，5000rpm×30min，15000rpm×30min离心后，弃沉淀取上清液；将上清液35000rpm超速离心60min，弃上清液取沉淀，然后在沉淀中加入pbs缓冲液稀释至病毒蛋白浓度为5mg/ml，得到中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液；(2)将壳聚糖(cs)溶解在质量分数为0.5％的乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液，其中，壳聚糖的质量分数为2.5％；(3)在20℃下，将浓度为0.25mg/ml的go悬浊液超声处理(200w，40khz)5min，使氧化石墨烯分散均匀；将其与等体积的步骤(1)制得的壳聚糖/乙酸溶液混合后超声处理(200w，40khz)15min，使两者充分混匀；然后20℃搅拌3.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖(go/cs)佐剂；(4)在步骤(3)制得的氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中逐滴缓慢加入步骤(1)制得的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液，充分混合均匀，然后20℃搅拌2.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗，其中，病毒蛋白的终浓度为0.5mg/ml；(5)蛋鸡的免疫和鸡蛋的收集：将步骤(4)制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为抗原，分别在2个月开产日龄的蛋鸡颈部、双翅根部、背部和胸大肌部位进行皮下注射，同时在鸡一侧大腿外侧肌肉最为丰富处进行肌肉注射，其中，初次免疫后，每隔10天加强免疫一次，注射的用量为1ml/鸡，0.2ml/位点，初次免疫剂量和后续加强免疫剂量相同；多次免疫后，用间接elisa法测定抗体的效价，当效价达到25以上时，收集鸡蛋，做好相应的标记，将收集的鸡蛋存储在冰箱4℃，供卵黄抗体的分离所用；(6)卵黄抗体的分离和纯化：用蛋清分离器将蛋黄从蛋白中分离出来，将pbs缓冲液与蛋黄按8:1的体积比混合，搅拌均匀后加入peg6000试剂，使其最终浓度为5.5wt％；将该混合物在40℃下搅拌20min，2000rpm离心60min，收集上清液，得到卵黄抗体，储存在4℃备用；(7)将盐藻接种至天然海水养殖池中培养生长至稳定期(盐藻细胞呈现鲜亮的黄褐色)，然后逐级过滤去除杂质和其它生物，再利用自然沉淀法沉淀盐藻，淡水洗涤两次，离心收集盐藻；向收集的盐藻中加入淡水调整细胞湿重为200g/l，然后在100mpa的高压条件下高压破碎法破碎盐藻细胞，低速离心，收集上清，得到盐藻提取液；(8)将步骤(7)制得的盐藻提取液与步骤(6)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的2％。实施例3(1)csbv的人工繁殖与纯化①csbv的人工繁殖：将江西株、北京株、陕西株、辽宁株和福建株五株中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株分别感染蜜蜂幼虫，将感染后的幼虫等质量混合；然后取15g感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫，用玻璃匀浆器将其匀浆至完全均质化，离心，然后收集含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液去感染6批(480只2日龄幼虫)健康蜜蜂幼虫，收集患病幼虫；②csbv的纯化：将步骤①收集到的感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫在冰浴上匀浆20min至完全均质化，离心，然后收集含有病毒的上清液；用0.2mpbs缓冲液将沉淀重悬，再次在冰浴上匀浆5min后离心，收集含有病毒的上清液，合并两次收集到的含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液与等体积的氯仿混合，在冰浴上匀浆10min以便更好的抽提纯化病毒，采用以下参数进行差速离心，1000rpm×10min，5000rpm×30min，15000rpm×30min离心后，弃沉淀取上清液；将上清液35000rpm超速离心60min，弃上清液取沉淀，然后在沉淀中加入pbs缓冲液稀释至病毒蛋白浓度为10mg/ml，得到中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液；(2)将壳聚糖(cs)溶解在质量分数为2％的乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液，其中，壳聚糖的质量分数为10％；(3)在40℃下，将浓度为1.25mg/ml的go悬浊液超声处理(200w，40khz)15min，使氧化石墨烯分散均匀；将其与等体积的步骤(1)制得的壳聚糖/乙酸溶液混合后超声处理(200w，40khz)5min，使两者充分混匀；然后40℃搅拌3.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖(go/cs)佐剂；(4)在步骤(3)制得的氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中逐滴缓慢加入步骤(1)制得的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液，充分混合均匀，然后40℃搅拌0.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗，其中，病毒蛋白的终浓度为5mg/ml；(5)蛋鸡的免疫和鸡蛋的收集：将步骤(4)制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为抗原，分别在2个月开产日龄的蛋鸡颈部、双翅根部、背部和胸大肌部位进行皮下注射，同时在鸡一侧大腿外侧肌肉最为丰富处进行肌肉注射，其中，初次免疫后，每隔10天加强免疫一次，注射的用量为1ml/鸡，0.2ml/位点，初次免疫剂量和后续加强免疫剂量相同；多次免疫后，用间接elisa法测定抗体的效价，当效价达到25以上时，收集鸡蛋，做好相应的标记，将收集的鸡蛋存储在冰箱4℃，供卵黄抗体的分离所用；(6)卵黄抗体的分离和纯化：用蛋清分离器将蛋黄从蛋白中分离出来，将pbs缓冲液与蛋黄按10:1的体积比混合，搅拌均匀后加入peg6000试剂，使其最终浓度为3.0wt％；将该混合物在20℃下搅拌60min，8000rpm离心10min，收集上清液，得到卵黄抗体，储存在4℃备用；(7)将盐藻接种至天然海水养殖池中培养生长至稳定期(盐藻细胞呈现鲜亮的黄褐色)然后逐级过滤去除杂质和其它生物，再利用自然沉淀法沉淀盐藻，淡水洗涤两次，离心收集盐藻；向收集的盐藻中加入淡水调整细胞湿重为200g/l，然后在120mpa的高压条件下高压破碎法破碎盐藻细胞，低速离心，收集上清，得到盐藻提取液；(8)将步骤(7)制得的盐藻提取液与步骤(6)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的10％。对比实施例1弗氏组疫苗(1)csbv的人工繁殖与纯化：具体操作同实施例1；(2)弗氏佐剂的制备：无菌研钵中加入2g羊毛脂和4ml液体石蜡，充分研磨后即为弗氏不完全佐剂(fia)。然后在fia中加入1ml卡介苗，充分研磨成油包水状后即制成弗氏完全佐剂(fca)；(3)在步骤(2)制得的fca和fia中加入步骤(1)制得的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液，充分混合均匀，得到含病毒离子的fca和fia，病毒蛋白的终浓度为0.2mg/ml；(4)蛋鸡的免疫：将步骤(3)制得的含病毒离子的fca和fia作为抗原，分别在颈下、双翅根下、背部及胸肌皮下进行皮下注射，同时在鸡一侧大腿外侧肌肉最为丰富处进行肌肉注射，其中，首次免疫采用含病毒离子的fca，后续加强免疫采用含病毒离子的fia，初次免疫后，每隔14天加强免疫一次，注射的用量为1ml/鸡，0.2ml/位点，初次免疫剂量和后续加强免疫剂量相同，加强免疫共计3次；(5)卵黄抗体的分离和纯化：同实施例1。(6)盐藻提取液的制备同实施例1；(7)将步骤(6)制得的盐藻提取液与步骤(5)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的0.1％。对比实施例2白油组疫苗(1)csbv的人工繁殖与纯化：具体操作同实施例1；(2)白油佐剂的制备：span-80与白油按1:15体积比混合置于50℃震荡10min至透明均质状，得到油相；tween-80与步骤(1)制得的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(csbv)粒子溶液按1:20体积比混合，充分混匀，得到水相；水相与油相混合，得到白油组疫苗，其中，病毒蛋白的终浓度为0.2mg/ml；(3)蛋鸡的免疫：将步骤(3)制得的白油组疫苗作为抗原，分别在颈下、双翅根下、背部及胸肌皮下进行皮下注射，同时在鸡一侧大腿外侧肌肉最为丰富处进行肌肉注射，其中，初次免疫后，每隔14天加强免疫一次，注射的用量为1ml/鸡，0.2ml/位点，初次免疫剂量和后续加强免疫剂量相同，加强免疫共计3次；(4)卵黄抗体的分离和纯化：同实施例1。(5)盐藻提取液的制备同实施例1；(6)将步骤(5)制得的盐藻提取液与步骤(4)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的0.1％。对比实施例3步骤(1)～(6)同实施例1，得到卵黄抗体，储存在4℃备用；(7)将水与步骤(6)制得的卵黄抗体按照质量比1：0.008混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体制剂。效果实施例(1)为了评估免疫间隔时间对免疫效果的影响，本发明将实施例1步骤(6)制得的卵黄抗体进行抗体滴度，具体方法为采用elisa方法进行，elisa操作过程按照标准步骤进行。显色终止后，利用全自动酶标仪进行450nm处吸光值的测定。主要的参数如下：(1)样本稀释：用0.01mpbs溶液(0.01mna2hpo4，0.01mnah2po4)对样本进行稀释。csbv抗原(0.2mg/ml)按照1:2000稀释，制备的卵黄抗体稀释梯度为1:500，地高辛标记的csbv病毒作为二抗，其稀释倍数为1:3200；(2)加样：取1:2000抗原稀释液100μl加入微孔板中，然后加入包被液100μl，用保鲜膜封闭，37℃包被1.5h；(3)甩干：甩去包被液，在吸水纸上拍干。(4)封闭：每孔加入100μl封闭液，封闭液现用现配，即含有0.5％tween-20(w/t)和1％bsa(w/t)的pbs缓冲液，于37℃恒温箱封闭1.5h；(5)甩干：甩去封闭液，在吸水纸上拍干；(6)加入酶标一抗：取1:500的卵黄抗体稀释液(实施例1、对比实施例1和2制得)100μl，加入微孔板中，每个处理重复三次，用保鲜膜封闭于37℃孵育1.5h；(7)洗板：弃上清液，加入pbst(pbs，0.5％tween-20)，洗3次，拍干；(8)加入酶标二抗：取1:3200倍比稀释的标记二抗，每孔加100μl，于37℃恒温箱封闭1.5h；(9)显色：每空加入底物缓冲液1滴，底物液1滴，37℃，避光15min。注意：一定要先加底物缓冲液，然后再加入底物液；(10)终止：每孔加入终止液50μl；(11)吸光值测定：elisa操作过程按照标准步骤进行，显色终止后，利用全自动酶标仪进行450nm处吸光值的测定，依据od值得高低评定卵黄抗体滴度的高低。表1是不同免疫间隔时间处理后elisa检测结果，从表中可以看出，实施例制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗通过多点注射，间隔10天的多次免疫后，抗体效价最高。而弗氏组疫苗组(最佳间隔时间14天)和白油组疫苗组(最佳间隔时间14天)所测od值均低于氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗组，但两者之间没有显著性差异(表2)。表1不同免疫间隔时间处理后卵黄抗体滴度elisa检测结果间隔时间重复1(od450nm值)重复2(od450nm值)重复组(od450nm值)7天2.9602.7112.86310天3.8883.8423.87514天3.8513.7193.72519天3.6033.7413.685表2不同佐剂免疫后卵黄抗体滴度elisa检测结果组别间隔时间重复组1重复组2重复组3弗氏组14天3.2392.9783.014白油组14天2.9602.2292.870gs-co组10天3.8883.8423.875应用实施例卵黄抗体复合制剂预防和治疗蜜蜂抗csbv感染中的实际应用(1)将蜜蜂随机分为7组，即为预防组1、预防组2、预防组3、治疗组1、治疗组2、治疗组3和对照组。每组设有3批重复，以保证实验数据的准确性和科学性。预防组1、2、3分别采用对比实施例1制得的复合制剂、对比实施例2制得的复合制剂和实施例1制得的复合制剂喂养15ml1次，第2天重复喂养1次，第3天分别用0.5ml的纯化csbv感染蜜蜂。此后每天记录蜜蜂的发病时间和死亡率。治疗组1、2、3分别采用用0.5ml纯化的csbv喂养蜜蜂1次，第2天和第3天分别喂养对比实施例1制得的复合制剂、对比实施例2制得的复合制剂和实施例1制得的复合制剂15ml。此后每天记录蜜蜂的发病时间和死亡率。对照组：先用0.5ml纯化的csbv喂养蜜蜂1次，第2天和第3天分别再喂养15ml的pbs。此后每天记录蜜蜂的发病时间和死亡率。结果显示：对照组蜜蜂全部死亡，在3组预防组中，go-cs组卵黄抗体复合制剂保护率最高，能够达到100％(图3)，而弗氏组、白油组的预防保护率达到96.6％和9.41％。在3组治疗组中，go-cs组卵黄抗体复合制剂保护率最高，能够达到100％(图4)，而弗氏组、白油组的治疗保护率达到94.7％和92.8％。由此可以看出，go-cs组卵黄抗体在预防和治疗蜜蜂抗csbv感染中，保护效果均能达到100％。(2)将蜜蜂随机分为2组，每组设有3批重复，以保证实验数据的准确性和科学性，分别采用对比实施例3制得的复合制剂和实施例1制得的复合制剂每天喂养1次，每次15ml，连续喂养3天。结果显示：对比实施例3制得的复合制剂蜜蜂需要60分钟吃完，而实施例1制得的复合制剂蜜蜂可以在20～30min内吃完，且采用实施例1制得的复合制剂喂养后的蜜蜂的产蜜量较对比实施例3制得的复合制剂喂养后的蜜蜂的产蜜量提高1～5％。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12