检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组及其应用的制作方法

本发明属于恶性疟原虫青蒿素耐药基因检测
技术领域：
，具体涉及一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组及其应用。
背景技术：
：近年来，随着中国国际贸易、劳务输出的日趋频繁，境外输入性疟疾也明显增多。耐药性恶性疟原虫在全球广泛分布，对人类健康造成严重的危害。检测输入性恶性疟原虫的相关突变基因，可以有效的对输入性恶性疟原虫的抗药性进行早期检测，以便及时控制恶性疟原虫的传播速度和及时调整用药方案，延缓疟原虫抗性的产生，延长抗疟药物的使用时间，对消除恶性疟原虫的的工作具有重要的意义。世界范围内恶性疟原虫对传统抗疟药产生普遍的抗药性，已成为阻碍全球疟疾消除进程的重要因素[1]。近几年来，在东南亚地区发现青蒿素抗药性恶性疟原虫也为青蒿素类药物的使用带来了潜在的威胁[2]。最新研究发现，恶性疟原虫kelch螺旋体蛋白基因(k13-propellergene，k13)上位点的突变与恶性疟原虫对青蒿素抗性的产生紧密相关[3]。此后talundzic等[4]、tun等[5]和wang等[6]分别发现泰国、缅甸以及中缅边境流行的恶性疟原虫株的k13基因多个位点发生突变。feng等[7]对广西境外务工回国人员感染的恶性疟原虫的研究发现，k13基因所有突变位点中c580y突变率最高(2.7％)。当k13基因某些位点发生突变，会削弱k13-propeller蛋白与受体蛋白的相互作用，导致青蒿素耐药性的发生[3]因此，以检测k13基因kelch结构域多态来预测恶性疟原虫青蒿素耐药性具有理论支撑。多重pcr和多重荧光pcr是两种在多种病原混合感染中应用较多的检测鉴别技术。多重pcr需多对特异性引物组合在一个反应体系中同时竞争地结合扩增，引物之间会产生干扰，每多增加一对引物，其形成复杂引物二聚体的概率大大增加，敏感性就越低，加之多重pcr产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，难以区分小于100bp的条带；而多重荧光pcr由于探针要标记不同波长的荧光基团，如标记越多，相互会产生干扰越大，敏感性就越低。多重pcr和多重荧光pcr检测的目的基因数量有限，一般只能进行2至4重的检测，都达不到真正的高通量快速检测和分析多种病原体的目的。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题为：多重pcr和多重荧光pcr检测的目的基因数量有限，一般只能进行2至4重的检测，都达不到真正的高通量快速检测和分析多种病原体的目的。本发明提供一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组。本发明的技术方案如下：一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组，该特异性引物组包括针对恶性疟原虫k13基因的四个抗性突变位点设计的四对特异性引物；其中，四个抗性突变位点分别为：y493h、r539t、i543t以及c580y；四对特异性引物分别为：y493h特异性引物、r539t特异性引物、i543t特异性引物以及c580y特异性引物；其中，y493h特异性引物的正向引物序列为：aggtgacactatagaatatggaagtgctgtattgaataatttcttacac，y493h特异性引物的反向引物序列为：gtacgactcactatagggaatttgacgtaacaccacaattatttcttctag；r539t特异性引物的正向引物序列为：aggtgacactatagaatataattgtggtgttacgtcaaatggtaca；r539t特异性引物的反向引物序列为：gtacgactcactatagggatacattcggtataatagaagagccatcata；i543t特异性引物的正向引物序列为：aggtgacactatagaatatggtgttacgtcaaatggtagaatttattgtact；i543t特异性引物的反向引物序列为：gtacgactcactatagggactctcaccattagttccaccaatgac；c580y特异性引物的正向引物序列为：aggtgacactatagaataatacccctagatcatcagctatgtgt；c580y特异性引物的反向引物序列为：gtacgactcactatagggaattatataagaatctgacaatgtggcagct。本发明的工作原理或有益效果为：上述四对特异性引物在进行pcr扩增实际上是将多对特有异性引物的扩增转化为一对通用引物的扩增，使得各模板的扩增效率趋于一致，而不影响各特有异性引物的扩增效率，从而达到真正的高通量检测鉴别多种病原体的目的，且上述四对特异性引物在进行pcr扩增后得到的pcr产物的大小具有明显的区别，用于准确判定突变位点。进一步限定，所述y493h的特异扩增片段大小为200bp；所述r539t的特异扩增片段大小为113bp；所述i543t的特异扩增片段大小为232bp；所述c580y的特异扩增片段大小为374bp。本发明还提供一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组的应用，该特异性引物组可作为确定gexp多重pcr方法的检测浓度的下限、检测的灵敏度、检测的特异性以及诊断效能的应用。附图说明图1为r539t特异性引物的pcr反应产物电泳图；图2为i543t特异性引物的pcr反应产物电泳图；图3为c580y特异性引物的pcr反应产物电泳图；图4为y493h特异性引物的pcr反应产物电泳图；图5为四对特异性引物的pcr反应产物电泳图；图6为r539t特异性引物的gexp单重pcr检测结果；图7为y493h特异性引物的gexp单重pcr检测结果；图8为i543t特异性引物的gexp单重pcr检测结果；图9为c580y特异性引物的gexp单重pcr检测结果；图10为c580y特异性引物和r539t特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图11为r539t特异性引物和y493h特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图12为r539t特异性引物和i543t特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图13为c580y特异性引物、r539t特异性引物以及y493h特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图14为i543t特异性引物、r539t特异性引物以及y493h特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图15为i543t特异性引物、r539t特异性引物、y493h特异性引物以及c580y特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果。具体实施方式下面采用具体实施方式进行说明。本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。实施例11)设计特异性引物组参考文献和ncbi数据库，搜索近8年恶性疟原虫耐青蒿素分子标记k13基因序列及其四个snp位点，并从genbank数据库中下载蛋白和核苷酸序列，使用clustalx软件进行多序列同源性比对分析，将比对结果输入gexpexpressprofiler工具设计四对特异性引物。四对特异性引物使用ncbiprimer-blast,primerpremier5.0和oligo6.0软件进行分析筛选。同时下载近缘的间日疟原虫(plasmodiumvivax)、三日疟原虫(plamodiummalariae)系列，进行同源干扰评估。样本收集和恶性疟原虫dna提取带有4种恶性疟原虫耐药性基因突变位点配置的阳性质粒质控品以及阳性临床样本dna、以未携带耐药性基因突变基因的野生型疟原虫质粒配置阴性质控品作为对照。阳性质粒质控品为合成恶性疟原虫抗青蒿素基因k13的质粒按照一定浓度配置而成。2)恶性疟原虫耐青蒿素分子标记k13基因信息3)恶性疟原虫耐青蒿素分子标记k13基因氨基酸序列megekvktkansisnfsmtydresggnsnsddksgsssendsnsfmnltsdknektennsfllnnssygnvkdsllesidmsvldsnfdskkdflpsnlsrtfnnmskdnignkylnkllnkkkdtitnennninhnnnnnnltannitnnlinnnmnspsimntnkkenfldaanlinddsglnnlkkfstvnnvndtyekkiietelsdasdfenmvgdlritfinwlkktqmnfirekdklfkdkkelemervrlykelenrknieeqklhderkkldidisngykqikkekeehrkrfdeerlrflqeidkiklvlylekekyyqeyknfendkkkivdaniatetmidinvggaifetsrhtltqqkdsfiekllsgrhhvtrdkqgrifldrdselfriilnflrnpltipipkdlseseallkeaefygikflpfplvfciggfdgveylnsmelldisqqcwrmctpmstkkayfgsavlnnflyvfggnnydykalfetevydrlrdvwyvssnlniprrnncgvtsngriyciggydgssiipnveaydhrmkawvevaplntprssamcvafdnkiyviggtngerlnsievyeekmnkweqfpyallearssgaafnylnqiyvvggidnehnildsveqyqpfnkrwqflngvpekkmnfgaatlsdsyiitggengevlnschffspdtnewqlgpsllvprfghsvliani4)恶性疟原虫耐青蒿素分子标记k13基因dna序列atggaaggagaaaaagtaaaaacaaaagcaaatagtatctcgaatttttctatgacgtatgatagggaatctggtggtaacagcaatagtgatgataaaagcggaagtagtagcgagaatgattctaattcatttatgaatctaactagtgataaaaatgagaaaacggaaaataatagtttccttttaaataatagtagttatggaaatgttaaagatagcctattagaatccattgatatgagtgtattagattcgaactttgatagtaaaaaagattttttaccaagtaatttatcaagaacatttaataatatgtctaaagataatataggaaataaatatttaaataaattgttaaataaaaaaaaagatactattacaaatgaaaataataatattaatcataataataataataataatctgacagcaaataatataactaataatcttattaataataatatgaattctccatcaattatgaataccaacaaaaaagagaattttttagatgcagcaaatcttataaatgatgattctggattaaacaatttaaaaaaattttcaactgtaaataatgtaaatgatacttatgaaaagaaaattattgaaacggaattaagtgatgctagtgattttgaaaatatggtaggtgatttaagaattacatttattaattggttaaaaaagacacaaatgaattttattcgagaaaaagataaattatttaaagataagaaagaactagaaatggaaagagtacgattgtacaaagaattagaaaaccgtaaaaatattgaagaacagaaattacatgatgaaagaaagaaattagatattgatatatctaatggttataaacaaataaaaaaagaaaaagaagaacataggaaacgatttgatgaagaaagattaagatttttacaagaaatcgataaaattaaattagtattatatttagaaaaagaaaaatattatcaagaatataaaaattttgagaatgataaaaaaaaaattgttgatgcaaatattgctactgaaactatgattgatattaatgttggtggagctatttttgaaacatctagacataccttaacacaacaaaaagattcatttatagagaaattattaagtggaagacatcatgtaaccagagataaacaaggaagaatattcttagatagggatagtgagttatttagaattatacttaacttcttaagaaatccgttaactatacccataccaaaagatttaagtgaaagtgaagccttgttgaaagaagcagaattttatggtattaaatttttaccattcccattagtattttgtataggtggatttgatggtgtagaatatttaaattcgatggaattattagatattagtcaacaatgctggcgtatgtgtacacctatgtctaccaaaaaagcttattttggaagtgctgtattgaataatttcttatacgtttttggtggtaataactatgattataaggctttatttgaaactgaggtgtatgatcgtttaagagatgtatggtatgtttcaagtaatttaaatatacctagaagaaataattgtggtgttacgtcaaatggtagaatttattgtattgggggatatgatggctcttctattataccgaatgtagaagcatatgatcatcgtatgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaatacccctagatcatcagctatgtgtgttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaatggtgagagattaaattctattgaagtatatgaagaaaaaatgaataaatgggaacaatttccatatgccttattagaagctagaagttcaggagcagcttttaattaccttaatcaaatatatgttgttggaggtattgataatgaacataacatattagattccgttgaacaatatcaaccatttaataaaagatggcaatttctaaatggtgtaccagagaaaaaaatgaattttggagctgccacattgtcagattcttatataattacaggaggagaaaatggcgaagttctaaattcatgtcatttcttttcaccagatacaaatgaatggcagcttggcccatctttattagttcccagatttggtcactccgttttaatagcaaatatataa5)恶性疟原虫耐青蒿素分子标记k13基因突变位点信息atggaaggagaaaaagtaaaaacaaaagcaaatagtatctcgaatttttctatgacgtatgatagggaatctggtggtaacagcaatagtgatgataaaagcggaagtagtagcgagaatgattctaattcatttatgaatctaactagtgataaaaatgagaaaacggaaaataatagtttccttttaaataatagtagttatggaaatgttaaagatagcctattagaatccattgatatgagtgtattagattcgaactttgatagtaaaaaagattttttaccaagtaatttatcaagaacatttaataatatgtctaaagataatataggaaataaatatttaaataaattgttaaataaaaaaaaagatactattacaaatgaaaataataatattaatcataataataataataataatctgacagcaaataatataactaataatcttattaataataatatgaattctccatcaattatgaataccaacaaaaaagagaattttttagatgcagcaaatcttataaatgatgattctggattaaacaatttaaaaaaattttcaactgtaaataatgtaaatgatacttatgaaaagaaaattattgaaacggaattaagtgatgctagtgattttgaaaatatggtaggtgatttaagaattacatttattaattggttaaaaaagacacaaatgaattttattcgagaaaaagataaattatttaaagataagaaagaactagaaatggaaagagtacgattgtacaaagaattagaaaaccgtaaaaatattgaagaacagaaattacatgatgaaagaaagaaattagatattgatatatctaatggttataaacaaataaaaaaagaaaaagaagaacataggaaacgatttgatgaagaaagattaagatttttacaagaaatcgataaaattaaattagtattatatttagaaaaagaaaaatattatcaagaatataaaaattttgagaatgataaaaaaaaaattgttgatgcaaatattgctactgaaactatgattgatattaatgttggtggagctatttttgaaacatctagacataccttaacacaacaaaaagattcatttatagagaaattattaagtggaagacatcatgtaaccagagataaacaaggaagaatattcttagatagggatagtgagttatttagaattatacttaacttcttaagaaatccgttaactatacccataccaaaagatttaagtgaaagtgaagccttgttgaaagaagcagaattttatggtattaaatttttaccattcccattagtattttgtataggtggatttgatggtgtagaatatttaaattcgatggaattattagatattagtcaacaatgctggcgtatgtgtacacctatgtctaccaaaaaagcttattttggaagtgctgtattgaataatttcttatac(y493h,tac＞cac)gtttttggtggtaataactatgattataaggctttatttgaaactgaggtgtatgatcgtttaagagatgtatggtatgtttcaagtaatttaaatatacctagaagaaataattgtggtgttacgtcaaatggtaga(r539t，aga＞aca)atttattgtatt(i543t，att＞act)gggggatatgatggctcttctattataccgaatgtagaagcatatgatcatcgtatgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaatacccctagatcatcagctatgtgt(c580y，tgt＞tat)gttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaatggtgagagattaaattctattgaagtatatgaagaaaaaatgaataaatgggaacaatttccatatgccttattagaagctagaagttcaggagcagcttttaattaccttaatcaaatatatgttgttggaggtattgataatgaacataacatattagattccgttgaacaatatcaaccatttaataaaagatggcaatttctaaatggtgtaccagagaaaaaaatgaattttggagctgccacattgtcagattcttatataattacaggaggagaaaatggcgaagttctaaattcatgtcatttcttttcaccagatacaaatgaatggcagcttggcccatctttattagttcccagatttggtcactccgttttaatagcaaatatataa6)通用引物上游引物:aggtgacactatagaata下游引物:gtacgactcactataggga7)特异性引物设计的四对特异性引物的引物序列和四个抗性突变位点的特异扩增片段大小如表1所示；表1特异性引物序列表8)标准品制备从genbank数据库中下载恶性疟原虫耐青蒿素分子标记k13基因的四个snp位点(y493h、r539t、i543t以及c580y)的突变型序列，选取特异扩增的序列，储存dna浓度为5×106copy/ml。其中，四对特异性引物的pcr扩增序列及引物信息如下：y493h，共603bptggaagtgctgtattgaataatttcttacacgtttttggtggtaataactatgattataaggctttatttgaaactgaggtgtatgatcgtttaagagatgtatggtatgtttcaagtaatttaaatatacctagaagaaataattgtggtgttacgtcaaatggtagaatttattgtattgggggatatgatggctcttctattataccgaatgtagaagcatatgatcatcgtatgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaatacccctagatcatcagctatgtgtgttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaatggtgagagattaaattctattgaagtatatgaagaaaaaatgaataaatgggaacaatttccatatgccttattagaagctagaagttcaggagcagcttttaattaccttaatcaaatatatgttgttggaggtattgataatgaacataacatattagattccgttgaacaatatcaaccatttaataaaagatggcaatttctaaatggtgtaccagagaaaaaaatgaattttggagctgccacattgtcagattcttatataatr539t，共603bptggaagtgctgtattgaataatttcttatacgtttttggtggtaataactatgattataaggctttatttgaaactgaggtgtatgatcgtttaagagatgtatggtatgtttcaagtaatttaaatatacctagaagaaataattgtggtgttacgtcaaatggtacaatttattgtattgggggatatgatggctcttctattataccgaatgtagaagcatatgatcatcgtatgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaatacccctagatcatcagctatgtgtgttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaatggtgagagattaaattctattgaagtatatgaagaaaaaatgaataaatgggaacaatttccatatgccttattagaagctagaagttcaggagcagcttttaattaccttaatcaaatatatgttgttggaggtattgataatgaacataacatattagattccgttgaacaatatcaaccatttaataaaagatggcaatttctaaatggtgtaccagagaaaaaaatgaattttggagctgccacattgtcagattcttatataati543t，共603bptggaagtgctgtattgaataatttcttatacgtttttggtggtaataactatgattataaggctttatttgaaactgaggtgtatgatcgtttaagagatgtatggtatgtttcaagtaatttaaatatacctagaagaaataattgtggtgttacgtcaaatggtagaatttattgtactgggggatatgatggctcttctattataccgaatgtagaagcatatgatcatcgtatgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaatacccctagatcatcagctatgtgtgttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaatggtgagagattaaattctattgaagtatatgaagaaaaaatgaataaatgggaacaatttccatatgccttattagaagctagaagttcaggagcagcttttaattaccttaatcaaatatatgttgttggaggtattgataatgaacataacatattagattccgttgaacaatatcaaccatttaataaaagatggcaatttctaaatggtgtaccagagaaaaaaatgaattttggagctgccacattgtcagattcttatataatc580y，共603bptggaagtgctgtattgaataatttcttatacgtttttggtggtaataactatgattataaggctttatttgaaactgaggtgtatgatcgtttaagagatgtatggtatgtttcaagtaatttaaatatacctagaagaaataattgtggtgttacgtcaaatggtagaatttattgtattgggggatatgatggctcttctattataccgaatgtagaagcatatgatcatcgtatgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaatacccctagatcatcagctatgtatgttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaatggtgagagattaaattctattgaagtatatgaagaaaaaatgaataaatgggaacaatttccatatgccttattagaagctagaagttcaggagcagcttttaattaccttaatcaaatatatgttgttggaggtattgataatgaacataacatattagattccgttgaacaatatcaaccatttaataaaagatggcaatttctaaatggtgtaccagagaaaaaaatgaattttggagctgccacattgtcagattcttatataat将步骤1)中已标定浓度的阳性质粒质控品与阴性血清按照特定浓度进行配置，加入0.05％的proclion300，按照0.5ml规格进行分装，-20℃保存备用。9)四对特异性引物的特异性验证将四对特异性引物等浓度混合后，利用步骤1)中的含有合成质粒的阳性样品为模板，灭菌水为阴性对照进行单引物单模板pcr反应，验证特异性引物的可行性，确定本实验所用的引物浓度和rt-pcr反应条件。反应体系如表2所示，反应条件如表3所示：表2pcr反应体系表pcr反应试剂量/孔(μl)10xpcrbuffer225mmmgcl24四种特异性引物f混合2四种特异性引物r混合2taqdnapolymerase0.7dna模板4.3(20ng)ddh2o5total20表3pcr反应条件表步骤温度时间194℃10分钟294℃30秒钟354-62℃梯度退火30秒钟470℃1分钟5n/a重复2-4步骤30次64℃持续:直至收取pcr产物取10μlpcr做琼脂糖电泳，maker条带自上而下分别是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp以及100bp。条带1-5分别为梯度退火温度54℃、56℃、58℃、60℃、62℃。选择合适的退火温度。实验结果如下：pcr反应产物电泳图如图1-5所示；其中，图1是r539t特异性引物的pcr反应产物电泳图；图2是i543t特异性引物的pcr反应产物电泳图；图3是c580y特异性引物的pcr反应产物电泳图；图4是y493h特异性引物的pcr反应产物电泳图，图5是四对特异性引物的pcr反应产物电泳图；图5中四对特异性引物的各扩增片段大小分别为：c580y特异性引物374bp、r539t特异性引物113bp、i543t特异性引物232bp、y493h特异性引物200bp；通过图1-图5显示所得出：四对特异性引物的特异性验证结果发现四对特异性引物的特异性均良好，条带单一，无明显杂带。退货温度在54℃-62℃均扩增良好，确定pcr扩增最佳退火温度为56℃。10)四对特异性引物扩增的可行性将四对特异性引物以同等浓度与通用引物混合，pctprimermix是所有特异性引物中的上游引物和下游引物的混合，每对特异性引物的上游引物和下游引物的浓度均为200nm；universalprimermix是通用引物中的上游引物和下游引物的混合，通用引物的上游引物和下游引物的浓度均为2μm；合成质粒的阳性样品为模板，灭菌水为阴性对照进行多引物多模板pcr反应，验证多重扩增体系的可行性。反应体系如表4所示，反应条件如表5所示：表4pcr反应体系表pcr反应试剂量/孔(μl)10xpcrbuffer225mmmgcl24pcrprimermix2universalprimermix2taqdnapolymerase0.7dna模板9.3(50ng)total20将表4中的各物质混匀后按表5所示的温度进行pcr反应；表5pcr反应条件表步骤温度时间194℃10分钟294℃30秒钟360℃30秒钟470℃1分钟5n/a重复2-4步骤10次694℃30秒钟750℃30秒钟870℃1分钟9n/a重复6-8步骤10次1094℃30秒钟1150℃30秒钟1270℃1分钟13n/a重复2-4步骤20次144℃持续:直至收取pcr产物pcr结束后，按表6所示的比例将pcr产物和试剂加入到96孔样品板中。表6反应体系gexp样品量/孔(μl)sls上样液38.5dnasizestandard-4000.5pcr产物1total40矿物油1滴准备分离液：将约220μl分离液加入96孔分离液板上适当数目的孔中。选择“frag-3”样品分离方法，(详见genomelabgexp遗传分析仪说明书)结果分析(详见genomelabgexp遗传分析仪说明书)。a)分别加入一种突变型基因的质粒作为模板进行多引物单模板gexp，结果如图6～9所示；其中：图6为r539t特异性引物的gexp单重pcr检测结果；图7为y493h特异性引物的gexp单重pcr检测结果；图8为i543t特异性引物的gexp单重pcr检测结果；图9为c580y特异性引物的gexp单重pcr检测结果；b)随机在加入两种、三种、四种突变型基因的质粒作为模板的进行多引物多模板gexp，结果如图10～15所示；其中：图10为c580y特异性引物和r539t特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图11为r539t特异性引物和y493h特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图12为r539t特异性引物和i543t特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图13为c580y特异性引物、r539t特异性引物以及y493h特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图14为i543t特异性引物、r539t特异性引物以及y493h特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；图15为i543t特异性引物、r539t特异性引物、y493h特异性引物以及c580y特异性引物的混合物的gexp多重pcr检测结果；由图6～15可知：含有四对特异性引物的混合质粒的pcr产物为4条目的条带，由15图可知，特异性扩增四个峰值位于为113.24bp、200.09bp、232.14bp、374.85bp，符合r539t特异性引物、y493h特异性引物、i543t特异性引物以及c580y的特异扩增片段大小。11)gexp多重pcr检测方法稳定性实验a)人源dna干扰gd1组，在20μl的pcr体系中，加入浓度为5×103copy的含有四种特异性引物的混合质粒和5ng人全基因组dna；gd2组，在20μl的pcr体系中，加入浓度为5×103copy的含有四种特异性引物的混合质粒和50ng人全基因组dna；gd3组，在20μl的pcr体系中，加入浓度为5×103copy的含有四种特异性引物的混合质粒和500ng人全基因组dna。每组做18个重复。b)人源rna干扰gr1组，在20μl的pcr体系中，加入浓度为5×103copy的含有四种特异性引物的混合质粒和500ng人rna；gr2组，在20μl的pcr体系中，加入浓度为5×103copy的含有四种特异性引物的混合质粒和50ng人rna；gr3组，在20μl的pcr体系中，加入浓度为5×103copy的含有四种特异性引物的混合质粒和5ng人rna。每组做18个重复，测定结果表7所示：表7稳定性检测结果由表7结果显示，gd1和gr1不影响对snp的检测结果，gd2、gd3、gr2以及gr3存在一定干扰性；因此，提取dna时需要加入适当的rna酶，去除rna，同时需要控制pcr体系中模板的dna量，总量不超过50ng，避免pcr扩增受到干扰。c)检测限确定检测限度范围将标准品用标准品稀释液稀释至5×106copy/μl，然后做10倍比稀释，每个梯度浓度的样品重复20份，检测结果如表8所示，将具有90％-95％阳性检出率的最低标准品浓度作为最低检测限。表8各浓度检测限结果由表8可知，gexp多重pcr方法的检测限为5×103copy/μl。12)gexp多重pcr方法的特异性检测恶性疟原虫中k13基因4种snp突变，分别设计四组样品，分别是间日疟组、三日疟组、间日疟+恶性疟组以及三日疟+恶性疟组，每组中每个浓度的样品应做3个复孔，分别为：group1：间日疟原虫(plasmodiumvivax)dna(5×106copy)，用于检测gexp多重pcr方法是否能够检测间日疟原虫dna；group2：三日疟原虫(plamodiummalariae)dna(5×106copy)，用于检测gexp多重pcr方法是否能够检测三日疟原虫dna；group3：野生型恶性疟原虫dna(5×106copy)，用于检测gexp多重pcr方法是否能够检测野生型恶性疟原虫dna；group4：间日疟原虫dna(5×103copy)以及突变型恶性疟原虫(plamodiummalariae)合成质粒dna(5×103copy)；group5：三日疟原虫dna(5×103copy)以及突变型恶性疟原虫(plamodiummalariae)合成质粒dna(5×103copy)；group6：野生型恶性疟原虫dna(5×103copy)以及突变型恶性疟原虫(plamodiummalariae)合成质粒dna(5×103copy)；检测结果如表9所示：表9检测方法专属性确认结果由表9可知，gexp多重pcr方法的特异性良好，可以排除间日疟原虫、三日疟原虫dna以及野生型恶性疟原虫。13)检测性能gexp多重pcr方法的检测性能验证包含：阳性符合率、阴性符合率、总符合率、灵敏度、特异性和方法效率。采用分别含有四种特异性引物的质粒dna标准品(4份)、临床标本(8份)、混合标本(12份)和其他疟原虫标本(4份)，共28例。其中临床阳性标本由中国疾病预防控制中心寄生虫所提供，包括y493h突变样本2例，r539t突变样本1例，i543t突变样本2例，c580y突变样本3例。所有样本均经外送进行基因测序，结果如表10所示，表10临床标本gexp结果表11gexp与基因测序结果的比较表12gexp的诊断效能评价由表10，表11以及表12可知，gexp多重pcr方法的灵敏度为100％，特异性为99.81％，准确性为99.15％，与测序法比较，检测结果一致性为99.32％。14)临床应用收集实验室2016-2018年出入境人群中检出的恶性疟原虫标本dna，共28例，应用gexp多重pcr方法检测恶性疟原虫k13抗性基因突变位点y493h、r539t、i543t以及c580y，结果均为阴性。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12