本发明涉及一种非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用。
背景技术：
：非洲猪瘟又称东非猪瘟或疣猪病，是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性热型高度接触性传染病。本病仅感染猪，临床症状与病理变化与猪瘟很相似，主要表现为发热、皮肤发绀和淋巴结、肾脏、胃肠道粘膜出血等。本病的死亡率很高，在流行期间可高达100％。目前非洲猪瘟已在30多个国家发生流行，并有继续扩大蔓延的趋势，2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟的诊断常采用如红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、免疫电泳试验、间接酶联免疫蚀斑试验等，国际上相关特异性试剂缺乏，对控制非洲猪瘟带来许多困难。非洲猪瘟病毒为一种含有囊膜的双链dna，基因组为线性双链dna，长度在170～190kb之间，可编码151个蛋白。该病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，目前只有1个血清型，但不同地区asfv分离株基因组存在一定的差异。根据p72基因遗传进化分析，目前可将asfv分为23个基因型。技术实现要素：为了克服上述缺陷，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用。p11.5基因比较稳定，在感染细胞中非常丰富，本发明利用p11.5基因的表达、多肽合成等建立快速检测非洲猪瘟特异抗体和抗原，以便为检测非洲猪瘟提供优质试剂。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性抗原多肽，所述的抗原多肽为p11.5-2或者p11.5-1；p11.5-2的序列为peerctykfnsytkkmel，p11.5-1的序列为dqeekkalqnketknlgip。所述的抗原多肽通过合成制得。本发明还提供一种非洲猪瘟病毒p11.5蛋白免疫原，所述的免疫原直接由前述的非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性抗原多肽构成；或者，所述的免疫原由所述的非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性抗原多肽和完全佐剂混合而成；或者，所述的免疫原由所述的非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性抗原多肽和不完全佐剂混合而成。本发明还公开一种非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：a)选择非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多肽表位：p11.5-1—dqeekkalqnketknlgip；或p11.5-2—peerctykfnsytkkmel；b)合成非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多肽表位；c)将非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多肽表位首先与完全佐剂或不完全佐剂混合后免疫动物；再将非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多肽表位直接免疫动物；d)分离免疫动物的血清，血清中含有抗非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体。优选的，所述的动物为小鼠或家兔。本发明还提供前述的方法制备获得的抗非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体以及非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体在制备检测非洲猪瘟病毒抗原和/或抗体试剂盒中的应用。相对于现有技术，本发明的有益效果：本发明公开了一种快速制备非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体的方法，该方法利用p11.5多肽表位免疫实验动物如小鼠、兔等制备特异性多克隆抗体。该方法抗原纯度高，制备的抗体特异性强，亲和力高，使用的抗原量少，操作简便。所述的多克隆抗体的制备方法包括asfvp11.5的特异性抗原表位的选择，多肽抗原的合成，动物免疫，抗体的测定等步骤。与常规方法比较，具有简便快速，抗原纯度高，制备的抗体特异性强，抗原使用量少。该多克隆抗体可以用于非洲猪瘟病毒p11.5蛋白检测，为我国非洲猪瘟的防控提供重要的技术方法。具体实施方式下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。1.多肽抗原表位的筛选根据医学在线公开的非洲猪瘟病毒p11.5蛋白氨基酸序列，筛选设计具有亲水性好，抗原性强，具有共性的特异性表位，如序列p11.5-1—dqeekkalqnketknlgip(seqidno.1)，p11.5-2—peerctykfnsytkkmel(seqidno.2)。2.多肽抗原表位的合成合成直线多肽，多肽从c端到n端方向合成。1.称取rink树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(dcm)浸泡。2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的dmf洗涤四次，然后抽干。4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。5.称取c端第一个氨基酸适量和1-羟基-苯骈三唑(hobt)适量于50ml的离心管中，加入20ml的dmf将其溶解，然后加入3ml的n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐：diea:dcm＝1：1：2)半小时，然后用3倍树脂体积的dmf洗涤四次，抽干待用。7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干。8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。9.称取后面第二个氨基酸适量和hobt适量于50ml的离心管中，加入25ml的dmf将其溶解，然后加入2.5ml的dic振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检a、检b各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。11.待反应完全后，用dmf洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。12.按照步骤9-11依次接上后面的氨基酸。13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用dmf洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9)离心沉降四次。最后用hplc分离纯化，再冻干，得到一定纯度的多肽。其中hplc分离纯化条件：固定相：c18；流动相的配置：pumpa：v(tfa)/v(水)＝1/1000pumpb:v(tfa)/v(乙腈)＝1/1000；流速：10ml/min；保留时间：20-30min之间。3.多肽的免疫a、将多肽抗原(p11.5-1或p11.5-2)与完全佐剂混合，通过腹腔途径免疫小鼠或皮内和足底免疫家兔；免疫剂量为每只小鼠5ug，家兔免疫剂量每只10ug。b、7天后将多肽抗原与不完全佐剂混合，通过腹腔途径免疫小鼠或皮内和足底和淋巴结内免疫家兔；免疫剂量为每只小鼠10ug，家兔免疫剂量每只50ug。c、7天后将多肽抗原直接通过腹腔途径免疫小鼠或皮内和淋巴结内免疫家兔；免疫剂量为每只小鼠20ug，家兔免疫剂量每只100ug。d、7天后采血，分离血清，测定抗体反应性。如效价不足，可以重复c再免疫一次。e、分离的血清中含有抗非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体。用血蓝蛋白偶联的多肽进行包被酶标板，进行elisa检测，在血清1:100稀释后，其抗体的反应性，od450或od490大于1.0以上。3.多克隆抗体的应用1)elisa检测非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体利用合成的多肽抗原(p11.5-2)包被酶标板，用封闭液封闭其它非特异性活性基团，洗涤后加入待检小鼠抗非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体血清，37℃孵育1小时后洗涤，再与酶标记的抗小鼠igg全分子抗体37℃孵育1小时，用底物显色，根据显色的强度，判定是否有非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体。检测结果如表1、表2。表1elisa方法检测非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体(p11.5-1)表2elisa方法检测非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体(p11.5-2)以上结果可以看出，p11.5-2多肽的抗原性比p11.5-1好。所以选择p11.5-2多肽抗原。其中1：100指小鼠血清按1：100稀释。表格内的数据是elisa的读值，读值越高，抗体效价越高。如果检测猪血清中是否含有非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体，可以采用同样的方法和原理，技术人员完全能理解和能够操作，只要将血清替换为猪血清、酶标抗体替换为抗猪igg和/或igm酶标记抗体。2)也可以用阻断elisa方法检测非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体，利用合成的多肽抗原(p11.5-2)包被酶标板，用封闭液封闭其它非特异性活性基团，洗涤后加入待检兔(或猪)抗非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体血清，37℃孵育30分钟后洗涤，加入小鼠抗非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体，37℃孵育30分钟，洗涤后再与酶标记的抗小鼠igg全分子抗体37℃孵育1小时，用底物显色，根据显色的强度，计算od值抑制率，判定是否有非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体，如果od值抑制率达到35％及以上，判为抗体阳性。如下表3：表3阻断elisa方法检测非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体阴性对照空白对照兔血清1兔血清2兔血清3兔血清4p11.5-21.1500.060.3120.2230.2121.10抑制率72.87％80.61％81.56％4.34％结果阳性阳性阳性阴性3)夹心elisa检测非洲猪瘟病毒p11.5特异性蛋白利用抗p11.5的多克隆抗体(p11.5-2免疫得到的兔血清，纯化后的igg)包被酶标板，通过封闭液封闭未结合的非特异性基团，加入待检样本(表达的非洲猪瘟病毒p11.5蛋白或猪的组织样本)，37℃孵育1小时，洗涤，加入酶标记的抗p11.5小鼠igg酶标抗体(p11.5-2或p11.5-1免疫得到的小鼠血清，纯化后的igg)，37℃孵育1小时，洗涤后用底物显色。根据显色的强度，判定样本中是否含有非洲猪瘟p11.5蛋白抗原，见表4。表4夹心elisa检测非洲猪瘟病毒p11.5特异性蛋白抗原结果表达产物空白对照阴性对照od650值1.2030.0750.066结果阳性阴性阴性4)多克隆抗体的其它应用如免疫荧光检测等先构建表达非洲猪瘟病毒p11.5蛋白的pcdna-p11.5载体，通过转染vero细胞，48小时后，用上述多克隆抗体血清(p11.5-2免疫得到的血清)进行孵育，30分钟后洗涤，并与荧光素fitc标记的抗小鼠igg全分子抗体孵育30分钟，洗涤后加50％甘油pbs缓冲液进行封片，在荧光显微镜下观察，可以观察到特异性亮绿色荧光。本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。序列表<110>扬州大学<120>非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用<130>xhx2019031901<141>2019-03-19<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>prt<213>reticuloendotheliosisvirus<400>1aspglngluglulyslysalaleuglnasnlysgluthrlysasnleu151015glyilepro<210>2<211>18<212>prt<213>reticuloendotheliosisvirus<400>2proglugluargcysthrtyrlyspheasnsertyrthrlyslysmet151015gluleu当前第1页12