一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒。
背景技术：
：核酸扩增是生物体内必不可少的反应,其体外应用产生的技术奠定了现代分子生物学的基础。其中最常用的技术是聚合酶链式反应(pcr)，需要热循环仪在某种程度上制约了pcr的应用。然而等温扩增不需要热循环仪，科研人员基于核酸自然扩增过程开发了很多等温扩增方法，现有方法可分为基于rna转录的等温扩增方法、基于dna复制的等温扩增方法、基于链替代反应的等温扩增方法、依赖切刻内切酶的等温扩增技术，这些方法各具优缺点，扩增效率与应用范围也不同，现简述如下。依赖核酸序列的扩增技术(nucleicacidsequence-basedamplification，nasba)，又称自主序列复制(self-sustainedsequencereplication，3sr)，是一种典型的基于rna转录的等温扩增方法，如果模板为dna需要95℃变性，然后引物1(p1)与单链dna模板或rna模板在65℃退火，随后反应在41℃进行，禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(avianmyeloblastosisvirus(amv)reversetranscriptase)、核糖核酸酶h(rnaseh)、t7rna聚合酶(t7dnadependentrnapolymerase)与两条引物(p1和p2)在2h左右将模板rna扩增约109倍，该技术已广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测。nasba的优点：(1)在rna病毒诊断中优势明显；(2)可替代rt-pcr进行rna扩增检测；(3)需要引物的浓度相比pcr低1个数量级；(4)可在基因组dna大量存在的情况下选择性扩增rna。nasba的缺点：(1)不是一个真正的等温扩增反应，需要高温变性或退火；(2)由于反应酶耐热性差需要分别加入；(3)只有120-250bp的靶序列才能有效扩增。信号介导的rna扩增技术(signal-mediatedamplificationofrnatechnology，smart)也是一种基于rna转录的等温扩增方法。该反应使用2条单链寡核苷酸探针(single-strandedoligonucleotideprobes)、1条标记延伸探针(labelledextensionprobe)和1条标记模板探针(labelledtemplateprobe)，延伸探针比模板探针短，但有自由的5’端羟基，用于模板延伸，整个反应需要bstdna聚合酶与t7rna聚合酶在相同反应条件下共同作用，产生靶序列依赖信号，该信号可被进一步放大，既可检测dna又可检测rna。由于形成经典的three-wayjunction(3wj)结构，smart具有特异性强的优点，并且该方法可耐受各种样品，如基因组dna、总rna、粗提样品或大量非靶标基因组dna存在；smart的主要缺点是其灵敏度比pcr低，未来smart的发展趋势是提高灵敏度、开发更有效的结果检测方法以及将扩增反应与结果检测设计在一个反应管中进行。赖解旋酶恒温基因扩增技术(helicase-dependentamplification，hda)是一种基于dna复制的等温扩增方法，hda模拟生物体内复制叉，使用解链酶如e.coliuvrdhelicase等解开dna双链，使用单链结合蛋白ssb等蛋白质防止解开的双链重新结合，并促使两个引物与模板结合，在dna聚合酶作用下37℃扩增。hda成功实现了37℃低温扩增基因组dna，目前hda的不足之处是反应速度慢，e.coliuvrdhelicase的持续解链能力差，解链酶与dna聚合酶缺乏协调作用。但由于hda反应机制简单、反应温度低并且不需要dna模板变性，最具有poc诊断的应用前景，未来发展趋势是将hda整合到lab-on-chip上，包括多步样品处理能力与多通道样品检测能力，实现微型化与自动化。piepenburg等对had进行改进提出了重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技术，rpa主要依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换dna聚合酶进行常温下的核酸扩增。rpa的扩增效率高，可在37-42℃范围内40-60分钟将模板扩增到109倍，rpa反应机制简单、反应温度低，相比had更适合poc诊断，rpa分析的关键在于扩增引物或探针的设计，pcr引物多半是不适用于该技术，因为rpa引物比一般pcr引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度，rpa的引物和探针设计不像传统pcr那样成熟，需要多次摸索条件进行优化，而且目前还没有设计软件可以使用。fire等于1995年借鉴微生物环状dna复制过程提出滚环扩增技术(rollingcircleamplification，rca)，是一种基于链替代反应的等温扩增方法。在rca反应中，phi29dna聚合酶是至关重要的组成部分，具有持续dna合成能力和链置换活性。rca的反应模板通常是单链环状dna，如果样品是双链环状dna，需变性处理，如果样品是双链线状dna，在进行变性处理后，还需用t4多核苷酸激酶与t4dna连接酶环化单链线状dna。rca按引物数量可分为单引物rca，双引物rca、多引物rca以及基于锁式探针的rca(padlock-rca)。与其他核酸扩增方法相比，rca主要优点为：反应机制简单，仅需一种聚合酶即可实现核酸扩增；灵敏度高，一条引物可达到105倍扩增，而两条引物的扩增效率可达到109倍。rca的不足之处在于：前处理繁琐，反应模板要求是单链环状dna，须对不符合要求的样品进行退火和环化处理；反应时间较长，至少需要4小时。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)也是一种基于链替代反应的等温扩增方法。lamp的反应过程可分为3个阶段：循环模板合成阶段、循环扩增阶段和伸长再循环阶段。lamp使用4条引物，分别是正向内引物fip(包括f1c和f2两部分序列，其中c代表反向互补序列)，反向内引物bip(包括b1c和b2)，正向外引物f3和反向外引物b3。反应初始，fip和f3先后与单链dna模板结合，引发循环模板合成，随着f3的延伸，fip产生的延伸链被置换出来，同时，其5'端发生自我碱基配对，形成环状结构。随即，bip和b3以环状结构dna作为模板延伸，引发新一轮链置换反应，最终形成一条哑铃状单链dna，即循环模板。进入循环扩增阶段后，哑铃状单链dna3'端以自身为模板进行延伸，打开5'端环状结构，形成一条双链茎环dna。随后，fip的f2区域与茎环dna环状结构中的f2c区域互补配对，发生延伸置换反应，自此引发循环扩增和伸长再循环扩增，进入指数扩增阶段。随着fip与bip不断与环状结构结合，链置换反应持续发生，最终大量生成不同长度地多环花椰菜结构dna。lamp的主要优点是特异性强、扩增效率高。lamp也存在一定的缺陷：由于反应需要的引物数量多浓度大，极易发生非特异性扩增，产生假阳性；靶序列长度在200-300bp才能被有效扩增；操作过程中极易发生污染从而产生假阳性；lamp在产物的回收、鉴定、克隆和单链分离等方面也存在很大的操作障碍。链置换扩增(stranddisplacementamplification,sda)是一种依赖切刻内切酶的等温扩增技术。sda主要依赖于限制性内切酶对半硫代磷酸化碱基对应互补链的切割作用，以及聚合酶exo-klenowdna聚合酶对切口的延伸作用和对下游dna片段的置换作用。如nasba，sda也需要预热对双链dna变性，变性步骤后加入两种酶，在37℃进行余下的反应。如lamp，sda使用四条引物，两条引物分别与dna靶序列3'端和5'端限制性内切酶hincii酶切位点互补，其他两条引物为正常引物，就像lamp的f3与b3。整个反应分为两个阶段：模板产生阶段和循环阶段，经过2h循环靶序列可得到108倍的扩增量。sda具有等温核酸扩增的通用优势：无须热变性、特异高效、操作简便。但由于反应原理和反应体系的复杂性，sda具有较多缺点：(1)使用非标准核苷酸，经硫基修饰的单核苷酸比普通的单核苷酸价格高出很多倍，增加了反应成本；(2)经硫基修饰的单核苷酸不是dna聚合酶的天然底物，修饰的核苷酸与标准核苷酸存在竞争关系，聚合酶容易从dna模板上掉落，降低了扩增效率，因此sda不能合成较长的产物，一般不超过200bp；(3)sda产物末端带有限制性核酸内切酶的识别序列或其残端，不适合直接用于克隆；(4)sda的等温过程是两步法，需要有变温过程打开双链与引物退火，催化酶在变温环节后添加，增加了外源污染的可能性。综上所述，现有核酸等温扩增技术各有优缺点，展望未来核酸等温扩增技术应具有如下特点：(1)反应机制简单，例如had、rpa和rca；(2)引物设计简单，例如had和rca；(3)扩增能力强，had能合成长链序列，nasba,3sr和sda只能扩增短链模板；(4)不需要预热变性，例如had、rpa、rca和lamp不需要对模板预热变性，是真正的等温扩增；(5)应用范围广，能以rna为模板，能以dna为模板，最好可snp分型检测，目前nasba主要以rna为模板；rca常以环形dna为模板。开发具有上述特点的新型核酸等温扩增技术成为国内外的一个研究热点，我国在核酸等温扩增技术研究方面起步相对较晚，但近年来我国科研人员奋起直追、潜心研究，开发了一些具有竞争力的新型核酸等温扩增技术。杭州优思达生物技术有限公司研发了交叉引物扩增(cross-primingamplification，cpa)，依托这种扩增方法建立的《中国松材线虫流行规律与防控新技术》2017年获国家科学技术进步奖二等奖；青岛科技大学的马翠萍教授团队与青岛大学的石超教授团队开发的等温扩增“一步法”rna检测新技术可在25分钟内可视化检测几个拷贝的寨卡病毒(zikavirus)，具有poc应用前景；上海仁度生物科技有限公司建立了实时荧光核酸恒温扩增检测平台(simultaneousamplificationandtesting，sat)，以rna为检测靶标，已有10个产品获得cfda注册证书并上市销售；陕西师范大学的李正平教授团队基于血红素(hemin)与g-四联体(g4)所形成模拟酶的催化作用，结合等温指数扩增反应(iexpar)，建立了特定序列dna的显色检测方法，可快速检测0.1-10nmol/l的目标dna分子，并可区分单个碱基；河北农业大学的张伟教授团队开发的跨越式滚环等温扩增(saltatoryrollingcircleamplification，srca)巧妙设计引物，避免了lamp反应中引物引起的非特异性扩增。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种新的等温扩增核酸片段的方法。本发明的另一目的在于提供用于核酸等温扩增的引物组和试剂盒。本发明的目的还在于提供了所述引物组在snp分型检测中的应用。本发明的等温扩增核酸片段的方法采用如下技术方案：一种等温扩增核酸片段的方法，采用包括特异性引物对和通用引物对的引物组，补平所述特异性引物对与扩增模板结合后形成的切口(nick)，使所述通用引物对以补平产物为模板，在dna聚合酶催化下等温扩增核酸模板。所述dna聚合酶可选自dna聚合酶(大片段)为bstdnapolymerase(largefragment)或bsudnapolymerase(largefragment)或bsmdnapolymerase(largefragment)或dnapolymerase等。优选的，所述特异性引物对由引物p1和p2组成，所述引物p1包括引物片段f1、f2、f3和f4，所述引物片段f1和f3反向互补，所述引物片段f4可与所述扩增序列互补；所述引物p2包括引物片段r1、r2、r3和r4，所述引物片段r1和r3反向互补，所述引物片段r4可与所述核酸模板互补。优选的，所述通用引物对由引物p3和p4组成，所述引物p3包括引物片段f3和f2c,所述引物片段f2c与所述引物片段f2反向互补，所述引物p4包括引物片段r3c和r2,所述引物片段r3c与所述引物片段r3反向互补。优选的，采用耐热dna连接酶或不耐热dna连接酶补平所述切口。所述不耐热dna连接酶可选自t3dnaligase或t4dnaligase或t7dnaligase或或ligase或e.colidnaligase等或dna连接酶试剂盒blunt/taligasemastermix或instantsticky-endmastermix或quickligationtmkit等；热稳定dna连接酶可选自hifitaqdnaligase或taqdnaligase或9°ntmdnaligase等。优选的，所述切口的补平和核酸模板的扩增可在同一反应体系中进行。优选的，在57-67℃条件下等温扩增核酸模板。优选的，所述核酸模板的扩增在实时荧光定量pcr系统中进行。用于扩增核酸片段的引物组，包括如上任意一项所述的特异性引物对和通用引物对。如上所述的用于扩增核酸片段的引物组在snp分型检测中的应用。一种用于扩增核酸片段的试剂盒，包括如上所述的引物组。优选的，所述试剂盒内还包括dna连接酶及其缓冲液、dna聚合酶及其缓冲液、mg2+、mn2+、dntp、nuclease-freewater、荧光染料、betaine、dmso等原料中的任意一种或几种的组合，所述荧光染料可选自evagreen、sybrsafe、sybrgold、sybrgreeni、sybrgreenii、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐或calcein等。本发明的等温扩增核酸片段的方法的原理为：特异性引物的引物片段f4和r4与同一条特异性靶序列dna或rna互补，并且结合后形成一个切口(nick)，如图1；dna连接酶催化补平引物片段f4和r4之间的切口，如图1(1)所示；f1与f3反向互补配对，dna聚合酶(大片段)由f1的3’羟基端催化扩增反应，取代模板dna或rna，并产生一端封闭的双链，如图1(2)所示；通用引物p3的f2c与双链封闭端的f2互补配对，dna聚合酶(大片段)由f2c的3’羟基端催化扩增反应，取代新合成的链，如图1(3)所示；被取代下来的链为单链，末端r1与r3反向互补配对，r1的3’羟基端在dna聚合酶(大片段)催化下进行新一轮的链取代反应，结合通用引物p3与p4循环往复，指数扩增，如图1(4)所示。本发明的有益效果是：本发明的等温扩增核酸片段的方法适用于双链dna、单链dna和rna扩增。本发明的等温扩增核酸片段的方法引物设计简单，对靶序列无长度要求。本发明的等温扩增核酸片段的方法通用引物经实践筛选，扩增产物不需开盖检测，不存在气溶胶污染与非特异性扩增引起的假阳性。本发明的等温扩增核酸片段的方法检测过程可控，因为使用的是通用引物对特异性连接结果检测，反应体系与通用引物相同，反应体系与反应温度优化后，所有靶序列的扩增反应条件一致，不需要再优化。本发明的等温扩增核酸片段的方法可对50bp以上的片段进行扩增。本发明的等温扩增核酸片段的方法可检测特异性核酸片段，可用于snp分型检测。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1：本发明的等温扩增核酸片段的方法的原理图；图2：实施例1中补平特异性引物对和猪圆环病毒2型单链dna结合后形成的切口后的real-timepcr验证结果图；图3：实施例1中猪圆环病毒2型单链dna的等温扩增结果图(t4dnaligase与bstdnapolymerase催化)。图4：实施例2中猪圆环病毒2型单链dna的等温扩增结果图(t4dnaligase与bstdnapolymerase催化)。图5：实施例3中猪圆环病毒2型单链dna的等温扩增结果图(hifitaqdnaligase与bstdnapolymerase催化)。图6：实施例4中补平特异性引物对和金黄色葡萄球菌16s-23srrna的双链dna结合后形成的切口后的real-timepcr验证结果图。图7：实施例4中金黄色葡萄球菌16s-23srrna的双链dna的等温扩增结果图(t4dnaligase与bstdnapolymerase催化)。图8：实施例5中金黄色葡萄球菌16s-23srrna的双链dna的等温扩增结果图(hifitaqdnaligase与bstdnapolymerase催化)。图9：合成的rna片段与单一突变位点的四条dna片段，其中rna片段(5’-3’)的具体序列如g0134535-5-rna.seq所示；dna片段(5’-3’)序列依次如图中g0134535-1所示(共106bp)，dna的单一突变位点序列除所示出的与g0134535-1中有一个碱基被替换外(将c分别替换为g、a、c)，其余均与g0134535-1相同。图10：实施例6中rna片段的等温扩增结果图。图11：实施例7中单一突变位点的等温扩增结果图。图12：实施例8中rna片段的等温扩增结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：猪圆环病毒2型orf2基因(genbankid:mf169755.1)的切口补平等温扩增(方法1)引物设计以猪圆环病毒2型orf2基因(genbankid:mf169755.1)的单链dna(702bp)为靶标，dna模板由河南省动物免疫学重点实验室刘运超课题组提供，用oligo7、beacondesigner、primerexpress3.0、primerexplorerv5等软件设计，得到如下引物(表1)。表1.引物序列表备注：上表中r2的5’端用磷酸基团修饰。切口补平反应(1)反应体系(反应总体积为20μl)表2.切口补平反应体系成分反应体系(20μl)t4dnaligasebuffer(10x)2μl模板dna0.020pmol以上p10.020pmol以上p20.020pmol以上nuclease-freewaterto20μlt4dnaligase(20u/μl)1μl(2)反应条件上述反应体系室温连接10分钟，65℃水浴10分钟灭活t4dnaligase，得到补平产物，作为等温扩增反应中通用引物(p3和p4)的模板。(3)real-timepcr验证针对p1与p2切口补平连接后的片段用在线软件primer3plus设计pcr引物pu和pd，两条引物分别居切点的上游与下游，引物序列如表3所示。表3.引物序列表引物名称序列(5’-3’)pdtgaatcatccgccctacgtgpugatatgggtgacgcctagcc用所设计的pcr引物与荧光pcr试剂盒premixextaqtmii验证两条特异性引物之间的切口是否被补平，反应体系如表4所示，steponeplus实时荧光定量pcr系统中，95℃预变性10s后进入40个循环阶段，单个循环为95℃变性10s与60℃退火延伸30秒，反应结果如图2所示，表明两个特异性引物(p1和p2)之间的切口已被补平。表4.real-timepcr反应体系等温扩增反应(1)反应体系(反应总体积为25μl)表5.等温扩增反应体系成分反应体系(25μl)bstdnapolymerasebuffer(10x)2.5μldna模板(上述切口补平产物)2μlp30.8μm以上p40.8μm以上betaine1.0mol以上dntp1.2mmol左右mgso46.0mmol左右nuclease-freewaterto25μlevagreen1×bstdnapolymerase(8u/μl)1μl(2)反应条件在steponeplus实时荧光定量pcr系统中65℃左右扩增60分钟。根据扩增曲线判读结果(如图3所示)：切口补平后的特异性引物(p1和p2)作为通用引物的模板(p3和p4)进行了指数扩增，并且35min内进入平台期。实施例2：猪圆环病毒2型orf2基因(genbankid:mf169755.1)的切口补平等温扩增(方法2)引物设计同实施例1反应体系表6.切口补平等温扩增反应体系成分反应体系(25μl)t4dnaligasebuffer(10x)2.5μlbstdnapolymerasebuffer(10x)2.5μl模板dna0.020pmol以上p10.020pmol以上p20.020pmol以上dna模板(上述切口补平产物)2μlp30.8μm以上p40.8μm以上betaine1.0mol以上dntp1.2mmol左右mgso46.0mmol左右nuclease-freewaterto25μlevagreen1×bstdnapolymerase(8u/μl)1μlt4dnaligase(20u/μl)1.5μl反应条件在steponeplus实时荧光定量pcr系统中25℃左右度保温10分钟，65℃左右扩增60分钟。根据扩增曲线判读结果(如图4所示)：在t4dnaligase与bstdnapolymerase催化作用下，特异性引物p1和p2之间的切口被补平，补平产物作为通用引物(p3和p4)的模板进行了指数扩增，并且30分钟内进入平台期。实施例3：猪圆环病毒2型orf2基因(genbankid:mf169755.1)的切口补平等温扩增(方法3)引物设计同实施例1反应体系表7.切口补平等温扩增反应体系成分反应体系(25μl)hifitaqdnaligasebuffer(10x)2.5μlbstdnapolymerasebuffer(10x)2.5μl模板dna0.020pmol以上p10.020pmol以上p20.020pmol以上dna模板(上述切口补平产物)2μlp30.8μm以上p40.8μm以上betaine1.0mol以上dntp1.2mmol左右mgso46.0mmol左右nuclease-freewaterto25μlevagreen1×bstdnapolymerase(8u/μl)1μlhifitaqdnaligase(20u/μl)1.5μl反应条件在steponeplus实时荧光定量pcr系统中65℃左右切口补平等温扩增60分钟。根据扩增曲线判读结果(结果如图5所示)：在hifitaqdnaligase与bstdnapolymerase催化作用下，特异性引物p1和p2之间切口被补平并作为通用引物(p3和p4)的模板进行了指数扩增，并且30分钟内进入平台期。实施例4：金黄色葡萄球菌16s-23srrna基因间区(genbankid:u39769.1)的切口补平等温扩增(方法1)引物设计以金黄色葡萄球菌16s-23srrna基因间区(genbankid:u39769.1)的双链dna(458bp)为靶标，dna模板由天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)提取所得，用oligo7、beacondesigner、primerexpress3.0、primerexplorerv5等软件设计，得到如下引物(表8)：表8.引物序列表备注：上表中r2的5’端用磷酸基团修饰。切口补平反应(1)反应体系(反应总体积为20μl)表9.切口补平反应体系成分反应体系(20μl)t4dnaligasebuffer(10x)2μl模板dna0.020pmol以上p10.020pmol以上p20.020pmol以上nuclease-freewaterto20μlt4dnaligase(20u/μl)1μl(2)反应条件将模板dna、引物p1、引物p2与nuclease-freewater加入到反应管中95℃加热10分钟，冷却到室温加入t4dnaligasebuffer与t4dnaligase，室温连接10分钟，65℃水浴10分钟灭活t4dnaligase，作为等温扩增反应中通用引物(p3和p4)的模板。(3)real-timepcr验证针对p1与p2切口补平连接后的片段用在线软件primer3plus设计pcr引物pu和pd，两条引物分别居切点的上游与下游，引物序列如表10所示。表10.引物序列表引物名称序列(5’-3’)pdtgaatcatccgccctacgtgpugatatgggtgacgcctagcc用所设计的pcr引物与荧光pcr试剂盒premixextaqtmii验证两条特异性引物之间的切口是否被补平，反应体系如表11所示，steponeplus实时荧光定量pcr系统中，95℃预变性10s后进入40个循环阶段，单个循环为95℃变性10s与60℃退火延伸30秒，反应结果如图6所示，表明两个特异性引物p1和p2之间的切口已被补平。表11.real-timepcr反应体系等温扩增反应(1)反应体系(反应总体积为25μl)表12.等温扩增反应体系(2)反应条件在steponeplus实时荧光定量pcr系统中65℃左右扩增60分钟。根据扩增曲线判读结果(等温扩增结果如图7所示)：特异性引物p1和p2之间的切口被补平，补平后的产物并被通用引物(p3和p4)作为模板进行了指数扩增，并且35min内进入平台期。实施例5：金黄色葡萄球菌16s-23srrna基因间区(genbankid:u39769.1)的切口补平等温扩增(方法2)引物设计同实施例4。切口补平反应(1)反应体系(反应总体积为20μl)表13.切口补平反应体系成分反应体系(20μl)hifitaqdnaligasebuffer(10x)2μl模板dna0.020pmol以上p10.020pmol以上p20.020pmol以上nuclease-freewaterto20μlhifitaqdnaligase(20u/μl)1μl(2)反应条件将上述反应体系95℃加热5分钟，然后65℃加热10分钟补平切口，作为等温扩增反应中通用引物(p3和p4)的模板。等温扩增反应(1)反应体系(反应总体积为25μl)表14.等温扩增反应体系(2)反应条件在steponeplus实时荧光定量pcr系统中65℃左右扩增60分钟。根据扩增曲线判读结果(等温扩增结果如图8所示)：切口补平后的特异性引物并被通用引物(p3和p4)作为模板进行了指数扩增，并且30min内进入平台期。实施例6：——以合成rna片段为模板按照本发明的方法进行等温扩增rna片段合成将金黄色葡萄球菌16s-23srrna基因间区(genbankid:u39769.1)的部分序列合成为rna片段，本实施例的rna片段是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物设计与实施例4中的引物序列相同。反应体系表15.切口补平等温扩增反应体系反应条件在steponeplus实时荧光定量pcr系统中65℃左右切口补平等温扩增60分钟。根据扩增曲线判读结果(如图10所示)：在hifitaqdnaligase与bstdnapolymerase催化作用下，特异性引物p1和p2之间的切口被补平，并且补平产物作为通用引物(p3和p4)的模板进行了指数扩增，并且25分钟内进入平台期。实施例7：将金黄色葡萄球菌16s-23srrna基因间区(genbankid:u39769.1)的部分序列合成为有单一突变位点的双链dna片段(本实施例的dna片段是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成的)，进行按照本发明的方法进行等温扩增。引物设计同实施例4。切口补平反应(1)反应体系(反应总体积为20μl)表16.切口补平反应体系备注：上表16中的dna模板为无单一突变位点的正常dna片段或其具有单一突变位点的dna片段(分别按照上表16配制反应体系)。(2)反应条件将上述反应体系95℃加热5分钟，然后65℃加热10分钟补平特异性引物对p1、p2之间的切口，补平产物作为等温扩增反应中通用引物(p3和p4)的模板。等温扩增反应(1)反应体系(反应总体积为25μl)表17.等温扩增反应体系成分反应体系(25μl)bstdnapolymerasebuffer(10x)2.5μldna模板(上述切口补平产物)2μlp30.8μm以上p40.8μm以上betaine1.0mol以上dntp1.2mmol左右mgso46.0mmol左右nuclease-freewaterto25μlevagreen1×bstdnapolymerase(8u/μl)1μl(2)反应条件在steponeplus实时荧光定量pcr系统中65℃左右扩增60分钟，根据扩增曲线判读结果，等温扩增结果如图11所示，对于切口处正确配对的dna模板，特异性引物对p1、p2之间的切口被补平，补平产物被通用引物(p3和p4)作为模板进行了指数扩增，并且20min内进入平台期。对于切口处存在配对错误的三条模板(3条带有单一突变位点的dna片段)，无扩增现象。实施例8：——以合成rna片段为模板按照本发明的方法进行等温扩增并可视化判读扩增结果rna片段合成与实施例6中的rna片段相同。引物设计与实施例4中的引物序列相同。反应体系表15.切口补平等温扩增反应体系成分反应体系(25μl)hifitaqdnaligasebuffer(10x)2.5μlbstdnapolymerasebuffer(10x)2.5μl模板rna0.020pmol以上p10.020pmol以上p20.020pmol以上dna模板(上述切口补平产物)2μlp30.8μm以上p40.8μm以上betaine1.0mol以上dntp1.2mmol左右mgso46.0mmol左右mnso40.6mmolnuclease-freewaterto25μl4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐0.05mmolbstdnapolymerase(8u/μl)1μlhifitaqdnaligase(20u/μl)1.5μl反应条件在水浴锅中65℃左右切口补平等温扩增60分钟，若反应液由橘红色变为浅黄色为阳性扩增；如反应液保持橘红色为阴性扩增。阴性对照将上表15中的模板rna替换为nuclease-freewater。扩增结果如图12所示，图中左侧2个反应管为按照上表15配制的反应体系进行扩增的结果，反应液呈浅黄色，表明模板rna进行了扩增；图12中右侧2个反应管为配制的阴性对照反应液，等温扩增前后颜色均为橘红色。最后应说明的是：以上实施例仅用于说明而非限制本发明，本领域的技术人员应当理解：在不脱离本发明的精神和范围内的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。序列表<110>许昌学院<120>一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>94<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acgttaactatggatgaatcatccgccctacgtggataaagaggcggatgattcatccat60agttaacgtcactgcgttcgaaaacagtatatac94<210>2<211>88<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaccaggaatacaatatccgtgtaaccctcggcagatatgggtgacggatgtgtagtgta60tggctaggcgtcacccatatctgccgag88<210>3<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cggatgattcatccatagttaacgtcctctttatccacgtaggg44<210>4<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgtcacccatatctgccgaggatgtgtagtgtatggctagg41<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgaatcatccgccctacgtg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gatatgggtgacgcctagcc20<210>7<211>96<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7acgttaactatggatgaatcatccgccctacgtggataaagaggcggatgattcatccat60agttaacgtccgagtgaataaagagttttaaataag96<210>8<211>91<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cttgaattcataagaaataatcgctagtgtctcggcagatatgggtgacggatgtgtagt60gtatggctaggcgtcacccatatctgccgag91<210>9<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cggatgattcatccatagttaacgtcctctttatccacgtaggg44<210>10<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cgtcacccatatctgccgaggatgtgtagtgtatggctagg41<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tgaatcatccgccctacgtg20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gatatgggtgacgcctagcc20当前第1页12