增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法与流程

本发明涉及发酵处理技术领域，特别涉及一种增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素(dnj)提取量的发酵处理方法。

背景技术：

我国地域辽阔，桑树资源丰富，分布广泛，是世界上桑树种类最多的国家。蛋白桑属于桑树属(morus)，是由全国各地收集的28个桑树品种经过长期选择与改良，杂交优化而得的新品系。现代药理学研究已经表明，桑叶中的生物碱类、黄酮类和多糖类均具有降血糖的作用。

桑树中有多种生物碱成分，其中的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，dnj)一种多羟基生物碱，是降血糖的主要活性成分，具有明显的降血糖作用。dnj能够抑制α-糖苷酶的活性，通过降低小肠对糖类物质的分解和吸收，同时能够促进胰岛素分泌，从而达到降低血糖的作用，是一种治疗糖尿病的有效药物。此外，还具有抗病毒、抑制肿瘤转移，降血压，降血脂等功效，具有非常高的食用和药用价值。

目前，桑叶中dnj的提取量受多种因素影响，其中样品的预处理方式能够对dnj的提取量造成影响。已有的处理方法如微波、加热等。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法，能有效的解决上述现有技术存在的问题。

为了实现以上发明目的，本发明采取的技术方案如下：

一种增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法，包括以下步骤：

步骤1，培养基配制；

ypd固体培养基：蛋白胨2g，葡萄糖2g，酵母膏1g，固体培养基添加琼脂2g，灭菌备用。用于培养酵母菌种。

lb固体培养基：nacl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养枯草芽孢杆菌菌种。

mrs固体培养基：葡萄糖2g，乙酸钠0.75g，蛋白胨1.5g，硫酸镁0.03g，牛肉膏1.5g，柠檬酸铵0.2g，酵母膏0.75g，磷酸氢二钾0.2g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养植物乳杆菌菌种。

步骤2，发酵液体菌种制备；

酵母菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落，置于装有5ml液体培养基的试管中，30℃，200r/min转速下震荡培养培养12h，按照2％的体积比接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12h左右，至活菌数1×10⁹cfu/ml，收集酵母菌发酵液备用。

枯草芽孢杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个枯草芽孢杆菌的单菌落，置于装有5ml液体培养基的试管中，37℃，200r/min转速震荡培养12h，按照2％的比例接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12小时，至活菌数5×10⁹cfu/ml，收集枯草芽孢杆菌发酵液备用。

植物乳杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个植物乳杆菌的单菌落，置于装有5ml液体培养基的试管中，37℃，密闭静置培养12h，按照2％的比例接种到装液量90％的三角瓶液体培养基中，静置培养12小时，至活菌数5×10⁹cfu/ml，收集植物乳杆菌发酵液备用。

步骤3，准确称取50g的自然晒干蛋白桑粉，放置于500ml锥形瓶中。以步骤2制作的发酵液为发酵菌种，按照菌种体积比组合酵母菌、枯草芽孢杆菌、草芽孢杆菌的其中一种或几种发酵；发酵水分为40～60％、发酵温度为25～35℃、发酵时间为24～72h。

作为优选，发酵菌种为枯草芽孢杆菌和酵母，发酵水分40％，发酵温度35℃，发酵时间72h。

作为优选，发酵菌种为产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌，接种量10％(2个液体菌种体积比1:1)，发酵水分40％，发酵温度35℃，发酵时间72h。

与现有技术相比本发明的优点在于：用微生物发酵的处理方式对蛋白桑进行预处理，不消耗能源，不产生粉尘、废液等污染，更主要的是能够提高dnj提取量和蛋白桑资源的利用效果。

附图说明

图1是本发明实施例高效液相色谱图；

图1a为dnj标准品色谱图；

图1b为样品色谱图；

图2是本发明实施例dnj标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图并列举实施例，对本发明做进一步详细说明。

材料

蛋白桑采自河南汝州市河南宏翔生物科技有限公司蛋白桑种植基地。

菌种：产朊假丝酵母(c.utilis，cicc32211)，枯草芽孢杆菌(b.subtilis，ln)、植物乳杆菌(l.plantarum，bncc192567)均为河南科技大学宏翔生物饲料实验室保存，使用前活化。

dnj标准品(sigma公司)，fmoc-cl(上海谱振生物科技有限公司)，乙腈(默克公司)，其他试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

高效液相色谱仪荧光检测器(美国waters公司)，台式冷冻高速离心机(美国thermofisher公司)，电热恒温水浴箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

培养基配制

ypd固体培养基(100ml)：蛋白胨2g，葡萄糖2g，酵母膏1g，固体培养基添加琼脂2g，灭菌备用。用于培养酵母菌种。

lb固体培养基(100ml)：nacl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养枯草芽孢杆菌菌种。

mrs固体培养基(100ml)：葡萄糖2g，乙酸钠0.75g，蛋白胨1.5g，硫酸镁0.03g，牛肉膏1.5g，柠檬酸铵0.2g，酵母膏0.75g，磷酸氢二钾0.2g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养植物乳杆菌菌种。

发酵液体菌种制备

酵母菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落，置于装有5ml液体培养基的试管中，30℃，200r/min转速下震荡培养培养12h，按照2％的体积比接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12h左右，至活菌数1×10⁹cfu/ml，收集发酵液备用。

枯草芽孢杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个枯草芽孢杆菌的单菌落，置于装有5ml液体培养基的试管中，37℃，200r/min转速震荡培养12h，按照2％的比例接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12小时，至活菌数5×10⁹cfu/ml，收集发酵液备用。

植物乳杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个植物乳杆菌的单菌落，置于装有5ml液体培养基的试管中，37℃，密闭静置培养12h，按照2％的比例接种到装液量90％的三角瓶液体培养基中，静置培养12小时，至活菌数5×10⁹cfu/ml，收集发酵液备用。

dnj的和测定

乙醇提取法：准确称取0.5g蛋白桑样品粉放置于圆底烧瓶，加入一定量的70％乙醇，加热回流提取2次，每次2h，合并两次滤液定容至100ml，备用。

采用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，hplc)，并参照欧阳臻,陈钧(不同季节桑叶中1-脱氧野尻霉素(dnj)含量的测定.食品科学,2004,25(10):211-214.)进行测定。

dnj的衍生化：取提取液10μl置于1.5ml离心管，加入10μl硼酸盐缓冲液(ph＝8.5)混合，在加入5mmol/l的fmoc-cl乙腈混合液20μl，均匀混合后于20℃水浴条件下反映20min，然后加入0.1mol/l甘氨酸10μl与剩余的衍生化试剂反应，终止反应。最后，加入0.1％的醋酸水溶液950μl稀释，混合均匀后用0.45μm一次性无菌针头过滤器过滤，取10μl进行进样分析。

高效液相色谱条件：色谱柱：c18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.1％醋酸-乙腈(45：55，v/v)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm，进样量10μl。

绘制标准曲线：准确称取3.4mg的dnj标准品定容于100ml蒸馏水中，制得标准品母液，吸取不同体积的标准品母液配制成不容浓度的dnj标准溶液。吸取不同浓度的标准液进行衍生化和液相色谱分析，结果以标准品溶液浓度(x)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。

发酵方案的确定过程

发酵样品制备

准确称取50.00g的自然晒干蛋白桑粉9份，分别放置于500ml锥形瓶中。以菌种组合、发酵水分、发酵温度、发酵时间4个影响发酵效果的主要指标为因素，每个因素设置3个水平，设计l9(3⁴)正交试验。其中菌种组合为固定10％的液体菌种接种量，各组合中菌液等比例。通过spss18.0统计软件生成正交试验方案表，根据正交试验方案编号装入自封袋，密封放置不同温度的培养箱进行兼性厌氧发酵试验，发酵结束，烘干发酵样品至水分10％左右，测定水分和dnj含量，并以绝干物质中含量进行校正。采用正交试验极差分析，筛选出最佳发酵条件。

测定dnj结果如表1所示。从表中可以看出，与未发酵样品相比，蛋白桑经过发酵dnj的含量极大的提高。直观分析结果显示，发酵菌种的不同是导致dnj含量的最主要因素，发酵温度和发酵时间影响较大，发酵水分在40％-60％的范围内，对dnj的影响不明显。以dnj做唯一指标评价时，发酵菌种选择枯草芽孢杆菌和酵母，发酵水分40％，发酵温度35℃，发酵时间72h为最优发酵方案。进一步做主效应显著性分析结果显示，发酵菌种组合对dnj含量的影响效果显著(p＜0.05)，其它因素对dnj含量影响不显著(表2)。故确定了发酵方案为：发酵菌种为产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌，接种量10％(2个菌种液体体积比1:1)，发酵水分40％，发酵温度35℃，发酵时间72h。

表1发酵蛋白桑正交试验结果

注：k1表示各因素第1水平3试验结果平均数，k2表示各因素第2水平3试验结果平均数，k3表示各因素第3水平3试验结果平均数，r表示各因素最大水平与最小水平之差，即k最大-k最小。

表2各因素主效应检验

方法学考察结果

(1)标准曲线线性

按照前述的的方法和色谱条件得到dnj标准品色谱图和样品的dnj色谱图，结果见图1。表明各成分分离良好。以标准品溶液浓度(x)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标作图，得到回归方程y＝2584067x+743351，r²＝0.9993，表明在0.34～17μg/ml范围内具有良好的线性关系，结果见图2。

(2)回收率和精密度

对发酵前蛋白桑中的dnj进行加标处理，回收率实验结果如表4所示。由表4可知，样品平均回收率为98.6，rsd为1.87，说明回收率和精密度良好。

表3桑叶的加样回收率试验结果(n＝9)

经过多次试验重复，经过发酵蛋白桑中的dnj提取量较未发酵提高21.5％多，如表4所示。

表4发酵对乙醇提取法dnj提取量的影响

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。